Questo articolo descrive un metodo per la generazione e la propagazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente a un alloantigene definito. Questo protocollo può essere adattato per la clonazione di cellule T umane specifiche per una varietà di ligandi peptidici-MHC.
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Articolo metodologico
Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio della biologia dei linfociti T umani spesso comporta l'esame delle risposte ai ligandi attivanti. Le cellule T riconoscono e rispondono agli antigeni peptidici processati presentati dalle molecole MHC (HLA ortologo umano) attraverso il recettore delle cellule T (TCR) in modo altamente sensibile e specifico. Mentre la funzione primaria delle cellule T è quella di mediare le risposte immunitarie protettive agli antigeni estranei presentati dall'auto-MHC, le cellule T rispondono in modo robusto alle differenze antigeniche nei tessuti allogenici. Le risposte delle cellule T agli alloantigeni possono essere descritte come alloreattività diretta o indiretta. Nell'alloreattività, la cellula T risponde attraverso il riconoscimento altamente specifico sia del peptide presentato che della molecola MHC. La robusta risposta oligoclonale delle cellule T alla stimolazione allogenica riflette il gran numero di alloantigeni potenzialmente stimolatori presenti nei tessuti allogenici. Mentre l'ampiezza delle risposte alloreattive delle cellule T è un fattore importante nell'avvio e nella mediazione della patologia associata a risposte alloreattive biologicamente rilevanti come la malattia del trapianto contro l'ospite e il rigetto dell'allotrapianto, può precludere l'analisi delle risposte delle cellule T ai ligandi allogenici. A tal fine, questo protocollo descrive un metodo per generare cellule T alloreattive da leucociti del sangue periferico umano (PBL) naïve che rispondono agli alloantigeni noti del peptide-MHC (pMHC). Il protocollo applica la marcatura multimerica pMHC, l'arricchimento di biglie magnetiche e la citometria a flusso a metodi di coltura in vitro di singole cellule per la generazione di cloni di cellule T alloantigene-specifiche. Ciò consente di studiare la biochimica e la funzione delle cellule T che rispondono alla stimolazione allogenica.
Introduzione
I linfociti T sono componenti critici del sistema immunitario adattativo. Le cellule T sono responsabili non solo mediare direttamente risposte immunitarie protettive a patogeni attraverso una varietà di meccanismi effettori, ma anche mantenere attivamente immunologica auto-tolleranza e dirigere le risposte di altre cellule del sistema immunitario. Queste funzioni sono diretti attraverso una serie di segnali integrati, compreso recettore delle cellule T (TCR) legatura, citochine e chemochine, e metaboliti 1. Di questi segnali, il TCR è di particolare importanza, in quanto fornisce la specificità caratteristica che definisce il ruolo delle cellule T nell....
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Protocollo
NOTA: Questo protocollo richiede l'utilizzo di campioni di sangue periferico di volontari umani. Tutta la ricerca con soggetti umani deve essere esaminato e approvato da un studi sull'uomo Institutional Review Board per garantire la conformità con la Dichiarazione di Helsinki (2013) e l'Health Insurance Portability e Accountability Act del 1996.
1. Isolamento dei linfociti T da sangue intero
- Prima di iniziare, riscaldare il mezzo gradiente di densità a temperatura ambiente. Aliquota 4 ml di terreno gradiente di densità in 2-4 sterili da 15 ml provette coniche (1 tubo verrà utilizzato per ogni 10 ml di volume totale ....
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Risultati
Questo protocollo descrive la generazione di colture di cellule T clonale umani con definito alloantigene specificità attraverso un arricchimento tallone magnetico e flusso a cella singola citometria di ordinamento strategia. La Figura 1 fornisce una panoramica del processo.
Figura 1: Panoramica del protocollo Il protocollo qui descritto forni.......
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Discussione
L'alloreattività delle cellule T è un fenomeno studiato a lungo e clinicamente rilevante. Le robuste risposte proliferative ed effettrici delle cellule T alla stimolazione allogenica hanno permesso analisi approfondite delle risposte delle cellule T umane in vitro attraverso reazioni linfocitarie miste relativamente semplici delle cellule T del sangue periferico contro le cellule allogeniche inattivate. Tuttavia, queste risposte primarie delle cellule T alloreattive sono oligoclonali, costituite da un gran numer.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
L'autore desidera ringraziare il NIH Tetramer Core Facility per la produzione di tetrameri. L'autore desidera inoltre ringraziare E.D. O'Connor e K.E. Marquez del laboratorio di citometria a flusso UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility per l'assistenza nello smistamento delle cellule. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta per prelievo di sangue venoso con eparina di sodio 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Set Kit di arricchimento delle cellule T umane | Stemcell Technologies | 15061 | |
| PBS di Dulbecco, 1x senza Ca o Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Albumina | sierica bovinaSigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Tetramero pMHC marcato con fluoroforo | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Kit di selezione della biotina | Stemcell Technologies | 18553 | |
| Magnete di selezione EasySep | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Soluzione | di blocco Fc umanoBiolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| DMEM di Iscove, senza b-ME o L-glutammina | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoetanolo | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicina solfato (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Siero umano AB, donatore maschio | Omega Scientific | HS-30 | |
| Umano ricombinante IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Tecnologie | 11131D | |
| Media | |||
| Tampone | |||
| PBS, pH 7,4 | 1 L | ||
| BSA | 10 g | ||
| EDTA (0,5 M) | 2 ml | ||
| Terreno di coltura di cellule T umane DMEM | |||
| di Iscove | 351,6 ml | ||
| Siero AB umano inattivato termicamente | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100x) | 4 ml | ||
| Gentamicina (50 mg/ml) | 0,4 ml | ||
| b-mercaptoetanolo (14,3 M) | 1,4 ml | ||
| IL-2 umana ricombinante (1 mg/ml) | 1 ml |
Riferimenti
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
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Ristampe e permessi
