Articolo metodologico

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

DOI:

10.3791/52259

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3 gennaio 2015

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1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

In questo articolo

Sommario

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I saggi delle sfere in vitro sono comunemente usati per identificare le cellule staminali tumorali. Qui confrontiamo saggi basati su sfere singole con più cellule. I saggi più laboriosi basati su singole cellule o l'integrazione di metilcellulosa forniscono risultati più accurati, mentre i saggi basati su più cellule eseguiti in mezzo liquido possono essere fortemente influenzati dalla densità cellulare.

Abstract

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Anni di ricerca indicano che i tumori ovarici ospitano una miscela eterogenea di cellule, tra cui una sottopopolazione delle cosiddette "cellule staminali tumorali" (CSC) responsabili dell'inizio, del mantenimento e della recidiva del tumore dopo le chemioterapie convenzionali. L'identificazione delle CSC ovariche è quindi un obiettivo importante. Un metodo comunemente usato per valutare il potenziale delle CSC in vitro è il saggio delle sfere, in cui le cellule vengono piastrate in condizioni di coltura non aderenti in un terreno privo di siero integrato con fattori di crescita e la formazione di sfere viene valutata dopo pochi giorni. Qui, esaminiamo i protocolli attualmente disponibili per i saggi sulle sfere del carcinoma ovarico umano ed eseguiamo un'analisi fianco a fianco tra i saggi basati su più cellule comunemente usati e un sistema più accurato basato sulla placcatura a singola cellula. I nostri risultati indicano che sia i saggi basati su più cellule che quelli basati su sfere a singola cellula possono essere utilizzati per studiare la formazione di sfere in vitro. I saggi basati su singole cellule, più laboriosi e costosi, sono più adatti per la valutazione funzionale delle singole cellule e portano a risultati complessivamente più accurati, mentre i saggi basati su più cellule possono essere fortemente influenzati dalla densità delle cellule piastrate e richiedere esperimenti di titolazione iniziali. L'integrazione di metilcellulosa con saggi basati su più cellule può essere utilizzata efficacemente per ridurre gli artefatti meccanici.

Introduzione

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C'è una crescente evidenza che i carcinomi ovarici sono costituiti da miscele eterogenee di cellule e ospitano le cosiddette "cellule staminali tumorali" (CSC) responsabili dell'inizio, del mantenimento e della recidiva della malattia dopo le terapie citotossiche convenzionali1-3. Pertanto, lo sviluppo di strategie molecolari mirate alle CSC ovariche è un obiettivo importante e promette di migliorare la terapia delle pazienti con carcinoma ovarico.

Un prerequisito per la comprensione delle caratteristiche molecolari delle CSC è il loro isolamento affidabile dalle non-CSC. Tuttavia, l'identificazione delle CSC ovariche sembra impe....

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Protocollo

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1. Generazione di Ovcar-3 umane cellule di carcinoma ovarico stabilmente trasdotte con lentivirus contenente il Reporter Construct SOX2 Regione Regulatory

  1. Generare particelle lentivirali trasfettando la linea cellulare 293T-imballaggi HEK con un costrutto giornalista riconoscere una regione regolatoria SOX2 come descritto 10,21.
    NOTA: Il giornalista costruire inoltre contiene un dominio destabilizzazione del sistema Shield ProteoTuner avanti della proteina tdTomato fluorescenza. Shield1 lega al dominio destabilizzazione impedendo così il proteasoma a degradare la proteina fluorescente 22.
  2. Trasdurre O....

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Risultati

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In sfere convenzionali saggi, quasi il 40% delle RFP + OVCAR-3 celle contro il 20% delle cellule RFP- ha dato luogo a una sfera singolo tumore nel primario test sfere (Figura 4A). Inoltre, sfere formate da RFP + cellule erano di dimensioni maggiori di quelle formate da cellule RFP-.

Quando placcato in saggi cellulari singoli, cellule RFP + anche formati più sfere di cellule RFP-, confermando i risultati di cui sopra. Tuttavia, c'è stata una tendenza verso un minor numero di .......

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Discussione

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Sfere culture sono un metodo ampiamente utilizzato per saggiare il potenziale delle cellule staminali del cancro e arricchire per le cellule staminali, come in una vasta gamma di cellule tumorali umane 15,25,26. In queste condizioni di coltura, le cellule tumorali che non hanno la capacità di auto-rinnovamento sono tenuti a differenziare e infine sottoposti a morte cellulare. Anche se possono inizialmente formare gruppi di cellule o persino sfere tumorali soprattutto a dosaggi primarie, non sono in grado di s.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato da una sovvenzione della Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) assegnata a C.L. Ringraziamo la Dott.ssa Martina Konantz per il contributo critico e la revisione del manoscritto. Ringraziamo Emmanuel Traunecker e Toni Krebs del DBM FACS Facility (Ospedale universitario di Basilea) per l'assistenza nello smistamento FACS.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra a basso attaccoCorning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinaLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
IdrocortisoneLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644concentrazione finale: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bconcentrazione finale: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044concentrazione finale: 1X
Eparina-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02diluizione 1:1.000
Pen/StrepGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Tripsina-EDTAGibco25300-054
Dulbecco' s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontechdiluizione 632189 1:1.000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (polvere)Gibco42400-010
MetilcellulosaSigmaM0387
Puromicina dicloridratoApplichemA2856
Cell selezionatoreBDAria III selezionatore cellulare Analizzatore
FACSBDCitometro a flusso Accuri c6
MicroscopioOlympusIX50 Osiris

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  2. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  3. Ahmed, ....

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