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Articolo metodologico

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

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DOI:

10.3791/52259

⸱

3 gennaio 2015

 ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

In questo articolo

Sommario

I saggi delle sfere in vitro sono comunemente usati per identificare le cellule staminali tumorali. Qui confrontiamo saggi basati su sfere singole con più cellule. I saggi più laboriosi basati su singole cellule o l'integrazione di metilcellulosa forniscono risultati più accurati, mentre i saggi basati su più cellule eseguiti in mezzo liquido possono essere fortemente influenzati dalla densità cellulare.

Abstract

Anni di ricerca indicano che i tumori ovarici ospitano una miscela eterogenea di cellule, tra cui una sottopopolazione delle cosiddette "cellule staminali tumorali" (CSC) responsabili dell'inizio, del mantenimento e della recidiva del tumore dopo le chemioterapie convenzionali. L'identificazione delle CSC ovariche è quindi un obiettivo importante. Un metodo comunemente usato per valutare il potenziale delle CSC in vitro è il saggio delle sfere, in cui le cellule vengono piastrate in condizioni di coltura non aderenti in un terreno privo di siero integrato con fattori di crescita e la formazione di sfere viene valutata dopo pochi giorni. Qui, esaminiamo i protocolli attualmente disponibili per i saggi sulle sfere del carcinoma ovarico umano ed eseguiamo un'analisi fianco a fianco tra i saggi basati su più cellule comunemente usati e un sistema più accurato basato sulla placcatura a singola cellula. I nostri risultati indicano che sia i saggi basati su più cellule che quelli basati su sfere a singola cellula possono essere utilizzati per studiare la formazione di sfere in vitro. I saggi basati su singole cellule, più laboriosi e costosi, sono più adatti per la valutazione funzionale delle singole cellule e portano a risultati complessivamente più accurati, mentre i saggi basati su più cellule possono essere fortemente influenzati dalla densità delle cellule piastrate e richiedere esperimenti di titolazione iniziali. L'integrazione di metilcellulosa con saggi basati su più cellule può essere utilizzata efficacemente per ridurre gli artefatti meccanici.

Introduzione

C'è una crescente evidenza che i carcinomi ovarici sono costituiti da miscele eterogenee di cellule e ospitano le cosiddette "cellule staminali tumorali" (CSC) responsabili dell'inizio, del mantenimento e della recidiva della malattia dopo le terapie citotossiche convenzionali1-3. Pertanto, lo sviluppo di strategie molecolari mirate alle CSC ovariche è un obiettivo importante e promette di migliorare la terapia delle pazienti con carcinoma ovarico.

Un prerequisito per la comprensione delle caratteristiche molecolari delle CSC è il loro isolamento affidabile dalle non-CSC. Tuttavia, l'identificazione delle CSC ovariche sembra impegnativa. Mentre l'espressione di CD133 e l'attività dell'aldeide deidrogenasi (ALDH)4,5 marcano le CSC ovariche, alcuni dati indicano che questi marcatori sono instabili6. Coerentemente, nel carcinoma ovarico, ad eccezione ad esempio nel carcinoma mammario7, l'espressione di ALDH1 si associa con esito favorevole8 e l'espressione della variante CD44 del marcatore delle cellule staminali proposto non ha valore prognostico9. Più recentemente, abbiamo dimostrato che l'espressione della proteina SOX2 delle cellule staminali embrionali conferisce staminalità alle cellule di carcinoma ovarico10 e che un'elevata espressione di SOX2 si associa a carcinomi ovarici e mammari clinicamente aggressivi11,12. Pertanto, in questo rapporto utilizziamo un costrutto reporter lentivirale contenente una proteina di fluorescenza rossa (RFP) la cui espressione è controllata da una regione regolatoria SOX2, come metodo per isolare le CSC ovariche putative.

Per definizione, le CSC possono sia auto-rinnovarsi che differenziarsi, dando origine a tutti i tipi di cellule tumorali. Le popolazioni putative di CSC devono essere analizzate in saggi funzionali eseguiti in vivo. Per ovvie ragioni, nelle cellule umane tali test funzionali sono limitati a saggi di xenotrapianto, che comprendono principalmente il trapianto di cellule tumorali umane in topi immunocompromessi10,13.

Un metodo alternativo in vitro è stato offerto da Brent Reynolds e Sam Weiss che per primi hanno riportato il cosiddetto saggio della neurosfera come un test surrogato che valuta il potenziale staminale nelle cellule neurali14. Dontu e colleghi hanno successivamente confermato l'uso di questo test per la valutazione del potenziale delle cellule staminali nelle cellule mammarie15,16. Qui, le cellule mammarie umane sono state piastrate in numero diverso in terreno privo di siero integrato con fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF), B-27 ed eparina e coltivate in condizioni non aderenti per sette-dieci giorni prima che la formazione della sfera fosse valutata al microscopio. Seguendo questo protocollo con alcuni aggiustamenti nel numero di cellule, nel terreno di crescita e negli integratori, diversi gruppi hanno esplorato il potenziale delle cellule staminali in vitro di diversi tipi di cancro come i tumori del seno17, del cervello18, del pancreas19 e del colon20. Nel carcinoma ovarico, abbiamo recentemente riportato la fattibilità del test delle sfere e confrontato i suoi risultati con quelli raccolti in modelli murini di xenotrapianto in vivo 10. Abbiamo scoperto che la sovraespressione della proteina SOX2 delle cellule staminali aumenta sia la formazione di sfere in vitro che la tumorigenicità in vivo delle cellule di carcinoma ovarico umano10. Tuttavia, la frequenza delle cellule che iniziano la sfera era superiore alla frequenza delle cellule che iniziano il tumore misurata in vivo10, suggerendo che il test della sfera può portare a risultati falsi positivi per motivi tecnici o, in alternativa, il test in vivo può essere inefficiente e portare a risultati falsi negativi.

In questo rapporto, analizziamo in modo più dettagliato i saggi di sfere ovariche multicellulari, esaminiamo i diversi protocolli disponibili in letteratura e li confrontiamo con un saggio basato su una singola cellula. Dimostriamo che il saggio basato su singole cellule fornisce risultati più accurati e riproducibili rispetto ai saggi basati su più cellule, che possono essere fortemente influenzati dalla densità delle cellule piastre, a meno che la metilcellulosa non venga aggiunta alle colture per immobilizzare le cellule. Tuttavia, anche nei saggi basati su singole cellule, il potenziale di inizio della sfera in vitro è osservato con una frequenza più elevata rispetto al potenziale di inizio del tumore in vivo.

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Protocollo

1. Generazione di Ovcar-3 umane cellule di carcinoma ovarico stabilmente trasdotte con lentivirus contenente il Reporter Construct SOX2 Regione Regulatory

  1. Generare particelle lentivirali trasfettando la linea cellulare 293T-imballaggi HEK con un costrutto giornalista riconoscere una regione regolatoria SOX2 come descritto 10,21.
    NOTA: Il giornalista costruire inoltre contiene un dominio destabilizzazione del sistema Shield ProteoTuner avanti della proteina tdTomato fluorescenza. Shield1 lega al dominio destabilizzazione impedendo così il proteasoma a degradare la proteina fluorescente 22.
  2. Trasdurre OVCAR-3 celle con particelle lentivirali per un periodo di tempo di 24 ore. Successivamente, rimuovere il surnatante virale e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) e coltivate in mezzo completo (RPMI supplementato con 10% FBS, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina).
  3. 48 ore più tardi, 10 ug / ml puroMycin sono stati aggiunti alle culture e mantenuto per 5 giorni per consentire la selezione di cellule trasdotte correttamente.

2. Preparazione di cellule Ordinamento e placcatura

  1. Aggiungi Shield1 a 1: 1.000 diluizione 24 ore prima della separazione delle cellule. Utilizzare stabilmente trasdotte Ovcar-3 celle senza trattamento Shield1 come controlli negativi (Figura 1). Aspirare i media da pallone, lavare le cellule con PBS 1x e trypsinize cellule con 0,05% tripsina-EDTA per 3 min.
  2. Smettere di tripsina utilizzando terreno completo (vedi sopra), contare il numero di cellule, le cellule centrifugare a 300 xg a RT (15 - 25 ° C) per 5 min.
  3. Decantare il surnatante e risospendere le cellule con cura in 0,5 - 1 ml di PBS sterile.
  4. Utilizzare 40 micron filtro cap filtro cella per ottenere cella singola sospensione.
  5. Regolare conta delle cellule a 5 milioni di cellule per ml.
  6. Preparare basso attaccamento piastre ultra 96 ​​pozzetti con 100 microlitri sfere medio (MEGM completato con fattori di crescita, citochine, e supplementi,B-27, eparina di sodio; o DMEM / F12 addizionato con fattori di crescita, citochine e integratori, B-27, eparina di sodio, con o senza l'aggiunta di 1% metilcellulosa, vedi anche tabella 1). Facoltativamente aggiungere antibiotici per il mezzo ad una concentrazione di 100 U / ml penicillina e 100 ug / ml di streptomicina per minimizzare il rischio di possibili contaminazioni.
  7. Ordina RFP + e cellule RFP- in preparati piastre a 96 pozzetti dall'alto, 1 cella per pozzetto (single cell-based sfere test) e di 100 cellule per bene (più saggio sfere a base di cellule), rispettivamente. Eseguire sorta su disponibile in commercio cell sorter (vedi Materiali) utilizzando la modalità singola cella, Sort installazione: 100 μ ugello, pressione della guaina 20 psi, e la resa maschera 0, maschera purezza 32, maschera di fase 16.
  8. Valutare placcatura efficienza microscopicamente segnando pozzetti contenenti cellule (per il saggio basato su cellule singole) e contando il numero di cellule in singoli pozzetti (per il dosaggio più basato su cellule; Figura 2 ).
  9. Incubare le cellule in condizioni standard in ambito di media (per la composizione vedi punto 2.6) a 37 ° C e 5% di CO 2. Supplemento giornaliero bFGF (20 ng / ml) e EGF (20 ng / ml).
  10. Dopo una settimana, contare il numero di emergenti sfere tumorali utilizzando un microscopio standard 4X o 10X di ingrandimento e un microscopio a fluorescenza per rilevare il segnale di fluorescenza dal sistema reporter integrato. Contare sfere con un diametro superiore a 100 micron come "grandi" sfere e sfere di diametro 50 - 100 micron come "piccole" sfere (Figura 3). Essere sicuri che si contano sfere reali e non CELL cluster.
    NOTA: In saggi cellulari singola formazione sfera è più facile segnare microscopicamente dopo 10 (contro 7) giorni di coltura.
  11. Calcolare la percentuale di cellule che formano sfera in RFP + e cellule rispettivamente RFP- in saggi cellulari singoli (una piastra a 96 pozzetti per ogni singolo esperimento) o più cellule-basfere sed saggi (uno anche per ogni singolo esperimento) presentato dalla Shaw et al. 16
    NOTA: Percentuale di cellule che formano sfera (%) = (numero di sfere) / (numero di cellule seminate) x 100

3. Passaging seriale di sfere

  1. Posizionare il contenuto di ciascun pozzetto in un idoneo tubo sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. Per il multi-cellulari sfere saggi, raccogliere insieme le sfere di un bene. Lavare il ben 3 - 5 volte con PBS e centrifugare 2 min più. Per i singoli cellulari-sfere saggi, raccogliere le singole sfere. A causa del basso numero di cellule, utilizzare 1,5 ml tubi per centrifugazione e lavaggio passi.
  2. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 ml di 0,05% tripsina-EDTA.
  3. Per realizzare la separazione cellulare ottimale, incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 5 minuti in un agitatore morbido. Ottimizzare tripsinizzazione tempo per la vostra linea cellulare a basso tasso di morte cellulare: se no grandesfere è visibile triturare delicatamente con un puntale 100 microlitri. In caso di grandi sfere sono ancora presenti, incubare con tripsina altri 3 minuti e poi procedere al passo triturazione. In caso di singolo saggi cellulari assicurarsi di ottimizzare i tempi per la resa ottimale delle cellule delle cellule viventi durante la fase di tripsinizzazione.
  4. Per inattivare la tripsina, aggiungere 500 microlitri mezzo completo e centrifugare a 300 xg per 10 min, in caso di saggi cellulari singoli, centrifugare per altri 2 minuti.
  5. Rimuovere accuratamente le cellule surnatante e risospendere in sfere di media.
  6. Utilizzare un filtro tappo filtro cella 40 micron per ottenere una cella singola sospensione.
  7. In caso di utilizzo RFP + e le cellule RFP- in saggi di multi-cellulari bassed, valutare la percentuale di cellule fluorescenti in ogni pozzetto dopo risospensione tramite citofluorimetro analisi.
  8. Per i saggi replating serie di singole cellule, di semi 1 cella per bene in un nuovo minimo attaccamento piastra a 96 pozzetti ultra preparati come sopra. Da una sfera individuale, seminare circa 20 singoli pozzi. Per i saggi replating di multi-sfere primarie a base di cellule, le cellule di semi ottenuti da un pozzetto di sfere primarie in una nuova piastra a 96 pozzetti e contano i numeri cellulari giorno successivo al microscopio.
  9. Valutare la proporzione di cellule che formano sfera in sfere secondarie test utilizzando la formula descritta al punto 2.11.

Analisi 4. Risultato

  1. Analizzare i risultati di esperimenti condotti in triplicato indipendenti e utilizzare Test t su due lati per analizzare i valori normalmente distribuiti e altrimenti Mann-Whitney-test per l'analisi statistica.

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Risultati

In sfere convenzionali saggi, quasi il 40% delle RFP + OVCAR-3 celle contro il 20% delle cellule RFP- ha dato luogo a una sfera singolo tumore nel primario test sfere (Figura 4A). Inoltre, sfere formate da RFP + cellule erano di dimensioni maggiori di quelle formate da cellule RFP-.

Quando placcato in saggi cellulari singoli, cellule RFP + anche formati più sfere di cellule RFP-, confermando i risultati di cui sopra. Tuttavia, c'è stata una tendenza verso un minor numero...

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Discussione

Sfere culture sono un metodo ampiamente utilizzato per saggiare il potenziale delle cellule staminali del cancro e arricchire per le cellule staminali, come in una vasta gamma di cellule tumorali umane 15,25,26. In queste condizioni di coltura, le cellule tumorali che non hanno la capacità di auto-rinnovamento sono tenuti a differenziare e infine sottoposti a morte cellulare. Anche se possono inizialmente formare gruppi di cellule o persino sfere tumorali soprattutto a dosaggi primarie, non sono in grado di s...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato da una sovvenzione della Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) assegnata a C.L. Ringraziamo la Dott.ssa Martina Konantz per il contributo critico e la revisione del manoscritto. Ringraziamo Emmanuel Traunecker e Toni Krebs del DBM FACS Facility (Ospedale universitario di Basilea) per l'assistenza nello smistamento FACS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra a basso attaccoCorning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinaLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
IdrocortisoneLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644concentrazione finale: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bconcentrazione finale: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044concentrazione finale: 1X
Eparina-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02diluizione 1:1.000
Pen/StrepGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Tripsina-EDTAGibco25300-054
Dulbecco' s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontechdiluizione 632189 1:1.000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (polvere)Gibco42400-010
MetilcellulosaSigmaM0387
Puromicina dicloridratoApplichemA2856
Cell selezionatoreBDAria III selezionatore cellulare Analizzatore
FACSBDCitometro a flusso Accuri c6
MicroscopioOlympusIX50 Osiris

Riferimenti

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