Articolo metodologico

Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta l'espressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium

DOI:

10.3791/52265

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14 marzo 2015

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1Discipline of Physiology, University of Sydney, 2Discipline of Biomedical Science, University of Sydney

In questo articolo

Sommario

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Disfunzione mitocondriale è una caratteristica della senescenza cellulare. Questo documento utilizza nel vicino infrarosso (NIR) trattamento non invasivo per migliorare la funzione mitocondriale nel invecchiamento del mouse vestibolare epitelio sensoriale.

Abstract

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Strategie per attenuare il declino in funzione di bilanciamento con l'aumentare dell'età sono prevalentemente concentrati su terapie fisiche, tra cui le attività di bilancio e l'esercizio fisico. Tuttavia, questi approcci non affrontano le cause alla base dell'equilibrio declino. Usando topi, è stato valutato l'effetto di luce vicino infrarosso (NIR) sul metabolismo di cellule dell'epitelio sensoriale vestibolare. I dati raccolti mostrano che questo intervento semplice e sicuro può proteggere queste cellule vulnerabili dagli effetti deleteri di invecchiamento naturale. mRNA è stato estratto dalla isolato epitelio periferico vestibolare sensoriale (ampollare crista e macula utricular) e successivamente trascritto in una libreria di cDNA. Questa libreria è stato poi indagato per l'espressione di antiossidanti onnipresente (SOD-1). Antiossidante espressione genica è stato poi utilizzato per quantificare il metabolismo cellulare. Utilizzando consegna transcranica di Nir in giovane (4 settimane) e anziani (8-9 mesi) i topi, e un regime di trattamento breve (90 sec / giorno per 5 days), questo lavoro suggerisce Nir sola può essere sufficiente per migliorare la funzione mitocondriale nell'epitelio sensoriale vestibolare. Dal momento che non ci sono attualmente disponibili, a prezzi accessibili, i metodi non invasivi di terapia per migliorare la funzione delle cellule dei capelli vestibolare, l'applicazione delle radiazioni NIR esterna fornisce una strategia potenziale per contrastare l'impatto dell'invecchiamento sul metabolismo cellulare inthe vestibolare epitelio sensoriale.

Introduzione

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Il calo delle prestazioni equilibrio e cadute successive sono comuni, e le caratteristiche, purtroppo, spesso definiscono di invecchiamento naturale 1. L'impatto di questo declino può essere sia fisica che sociale, e riduce in modo significativo la qualità della vita per le persone anziane. In risposta, terapie fisiche e riabilitazione sono stati al centro della ricerca di cadute, ma non sono stati associati con la riduzione consistente della prevalenza di cadute ripetute. Allo stesso tempo, il lavoro indagando i cambiamenti nel sistema periferico o centrale vestibolare (il sistema responsabile per mantenere l'equilibrio) è scarso, e potenziali strategie terapeutiche destinate a questi sistemi e le cause di squilibrio limitato.

Un recente lavoro su malattie neurodegenerative legate all'età, tra cui età-correlate degenerazione maculare 2-4, modelli di malattia di Alzheimer 5-8, e il morbo di Parkinson 9-12 hanno mostrato effetti neuroprotettivi di simple applicazione non invasiva del vicino infrarosso (NIR) luce. Inoltre, nel sistema vestibolare, NIR è stato usato per aumentare l'attività di neuroni vestibolari afferenti primari in vitro 13. Mentre il meccanismo di Nir luce non è ben compreso,, maggior parte degli studi che utilizzano NIR hanno suggerito che Nir stimola mitocondri complesso IV (citocromo c ossidasi) 14-17 per facilitare il metabolismo cellulare. Nel epitelio sensoriale vestibolare piastra sottocuticolare delle cellule ciliate che tipo è denso in mitocondri 18 e come tale può rappresentare un luogo di azione per il trattamento terapeutico Nir.

Qui, una breve, regime di trattamento non invasivo transcranially applicato NIR che può essere utilizzato per misurare il metabolismo cellulare (e di conseguenza, la funzione mitocondriale) nel topo vestibolare dell'epitelio sensoriale descritto. Anche discusso è una preparazione dell'epitelio sensoriale vestibolare e si dimostra che NIR aumenta l'espressione di un ubiquitonoi anti-ossidante (superossido dismutasi 1) nell'epitelio sensoriale - precedentemente dimostrato di essere importante per la sopravvivenza delle cellule dei capelli coclea 19.

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Protocollo

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Etica Dichiarazione: Tutte le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati dalla University of Sydney Comitato etico degli animali.

1. Gli animali

NOTE: 1 e 8-9 mesi topi (C57 / BL6) sono stati ottenuti dalla Animal Resources Centre (Perth, Australia). I topi sono stati alloggiati in Facility Bosch Roditore presso l'Università di Sydney.

  1. Casa topi in gabbie standard del mouse su un 12/12 luce hr / ciclo scuro con accesso a cibo e acqua ad libitum.
  2. Topi Divide in ogni fascia d'età in vicino infrarosso (NIR) trattati, o sham trattati (controllo) gruppi per il confronto.

2. vicino infrarosso (NIR) irradiazione e Sham trattamento

  1. Accorciare il pelo sulla regione della testa e del collo del mouse con un rasoio elettrico più vicino possibile impedire rapida ricrescita dei capelli prima del completamento del regime di trattamento. Per mantenere lo stato privo di patogeni dei topi, utilizzare etanolo al 70%per pulire strumenti tra gli animali da trucco e F10 veterinaria disinfettante tra animali di gabbie separate. Fare questo 2 - 3 giorni prima l'inizio del trattamento in modo gli animali non sono più manico.
  2. Trattenere il mouse tenendo l'estremità prossimale della coda e permettono di rilassarsi nel palmo di una mano o superiore del banco di modo da ridurre al minimo lo stress che potrebbe portare a risultati falsi.
  3. Tenere il NIR (670 nm) LED (light emitting diode) Dispositivo 1 - 2 cm di distanza dal (rasato) area esposta e accendere il dispositivo per 90 secondi (Figura 1A).
    NOTA: La variazione di temperatura a seguito di esposizione 90 sec stata misurata come <0,2 ° C in 100 ml di acqua.
  4. Ripetere i passaggi 2,2-2,3 per il gruppo di trattamento sham degli animali, ma lasciare l'apparecchio spento (Figura 1B).
  5. Ripetere i passaggi 2,2-2,3 per il gruppo di trattamento Nir-bloccato di animali, ma coprire il dispositivo con un foglio di alluminio.
  6. Ripetere i passaggi 2,2-2,5 giorni alle approximate 24 intervalli hr per 5 giorni consecutivi.
  7. Estrarre l'epitelio vestibolare sensoriale (3 creste e 1 macula utricular) da entrambe le orecchie per il quinto giorno dopo il trattamento (vedere paragrafo 3).

3. Tissue estrazione 20

  1. Preparare 300 ml di un liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) basato glicerolo-costituiti (in mM): 26 NaHCO3, 11 glucosio, 250 glicerolo, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1.2 MgCl 2, 2,5 e CaCl 2. Prima dell'aggiunta di CaCl 2, gas la soluzione con CarboGen (95% O 2 e 5% CO 2) per stabilire un pH di 7,4 e di evitare la precipitazione di calcio (nuvolosità). Raffreddare la soluzione in un -80 ° C freezer per 45 minuti in modo da formare una sospensione di ghiaccio.
  2. Preparare il tampone di lisi isolamento RNA etichettati microtubi tappo a vite (ferma il popping dei coperchi, quando le variazioni di pressione del tubo tra congelamento e scongelamento in azoto liquido) in basele istruzioni del fabbricante o usuali pratiche di laboratorio. Avere azoto liquido pronto in un matraccio dewar alluminio.
    NOTA: Usare indumenti protettivi e eyeware durante la manipolazione di azoto liquido. Assicurarsi che l'azoto liquido viene utilizzato in una stanza ben ventilata come il volume della sua forma di gas è di circa 700 volte quella della sua forma liquida e può causare asfissia.
  3. Profondamente anestetizzare topi con ketamina (400 mg / kg) tramite una iniezione intra-peritoneale. Lasciare che il riflesso arti posteriori a placarsi del tutto come indicazione che i topi sono completamente anestetizzati.
  4. Decapitare topi con le forbici in acciaio inossidabile affilate e fare un'incisione lungo la pelle sagittale del cranio con una lama di rasoio (arrotondato # 22). A questo punto e tutto passi 3,5-3,9, mantenere il più fresco possibile, l'applicazione regolare di ACSF ghiacciato sopra il tessuto della volta cranica, cervello e apparato vestibolare sottostante.
  5. Utilizzando il braccio punta di forbici modello standard fare un small 'incisione nel cranio a Lambda e tagliare lungo la sutura sagittale.
  6. Scorrere delicatamente un braccio di un superficiale rongeurs sotto l'osso parietale mantenendo la lama più vicino possibile alla superficie inferiore dell'osso senza trascinare il cervello. Sicuro e tirare via l'osso parietale laterale e l'osso occipitale posteriormente fino a quando il cervello è esposto.
  7. Utilizzare una piccola spatola di acciaio inox e sollevare il cervello dal anteriore e centrale fossa cranica per esporre il nervo vestibolococleare (CN VIII). Transetto il nervo per evitare inutili tensioni sui assoni afferenti primari che innervano direttamente le cellule ciliate vestibolari.
  8. Rimuovere il cervello in toto dopo resezione del CN VIII.
  9. Osservare il labirinto osseo contiene la coclea e gli organi vestibolari periferici nella fossa cranica media. Fare due piccole incisioni accanto a ogni labirinto osseo e asportare l'intera struttura tenendo il canale semicircolare anteriore e tirare tardialleato.
  10. Immergere immediatamente labirinti escisse in un piatto dissezione contenente soluzione ACSF ghiacciata (come descritto al punto 3.1), mentre continua perfusione con CarboGen.
  11. Sotto uno stereomicroscopio, tenere premuto il labirinto della coclea e fissarla al fondo del piatto con una pinza.
    1. Utilizzare pinze dritto fini graffiare una piccola apertura nel midollo sopra anteriore canale semicircolare (SSC) ampolla.
    2. Allargare delicatamente questa apertura raggiungendo immediatamente sotto l'osso e sfogliando verso l'esterno lontano dal ampolla. Fare attenzione qui per non spingere pinze nell'apertura e danneggiare il labirinto membranoso fragile sotto. Continuare in questo modo fino a quando il utricolo, anteriore e ampolle laterale sono tutti esposti. Se possibile rimuovere anche l'ampolla posteriori.
  12. Utilizzando una pinza sottile, sollevare delicatamente il utricolo e ampolle dal labirinto osseo fino a quando non sono completamente staccati. Ove possibile, tenerlidai canali semicircolari associati per evitare di danneggiare l'epitelio sensoriale. In alcuni casi, la parte prossimale del condotto membranoso semicircolare può avere bisogno di essere tagliato con forbici iris per rilasciare le ampolle dall'osso.
  13. Saldamente cogliere gli organi vestibolari tra la punta di una pinza e posto nel buffer di lisi preparata in precedenza al punto 3.2. Mescolare delicatamente la pinza intorno nel buffer per garantire organi vestibolari hanno staccato dalla pinza. Controllare questo è il caso per portare le pinze con lo stereomicroscopio.
    1. Avvitare sul coperchio microtubuli e congelare il campione in azoto liquido immediatamente.

4. RNA Estrazione e RT-PCR

  1. Seguire metodi standard di RNA messaggero (mRNA) di estrazione secondo le istruzioni del fabbricante o protocolli di laboratorio preferito.
    NOTA: un kit commerciale che utilizzava RNA carrier per aiutare isolare le piccole rese di mRNA è stato utilizzato in questoprotocollo. Volumi di eluizione inferiori possono essere usati per aumentare le concentrazioni finali di mRNA.
    NOTA: Controlli negativo "no enzima" (NEC) e controlli "non modello DNA" (NTC) devono essere completati per garantire la validità degli effetti osservati.
  2. Applicare metodi standard di trascrizione inversa di mRNA a DNA complementare (cDNA) e l'amplificazione di geni bersaglio 21-23.

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Risultati

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Per confrontare l'impatto del trattamento Nir nei giovani (4 settimane) e anziani (8-9 mesi) topi abbiamo misurato l'espressione di antiossidanti superossido dismutasi 1 (SOD-1) nei giovani (n = 16) e anziani (n = 20) i topi che erano NIR-trattata, sham-trattati, o Nir-bloccato. figura 2 mostra un aumento significativo normalizzato SOD-1 β-actina di oltre 2 volte nei giovani Nir-animali trattati rispetto ai giovani animali sham trattati (p <0.01) e animali giovani NIR-bloccati (p <0.01). Animali p...

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Discussione

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I risultati rappresentativi qui descritti mostrano che breve consegna transcranica di NIR luce (90 sec / giorno per 5 giorni) è sufficiente per aumentare i livelli di espressione antiossidante nei topi anziani rispetto ai topi sham trattati. Mentre calore emesso potrebbe rappresentare una fonte di mitocondriale e / o l'attivazione neuronale, come riportato per ratto vestibolare afferenti 24 - nostra misurazione del calore emesso dal LED NIR dispositivo era <0,2 ° C superiore al 90 sec, e come tale è im...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Paul Witting e la signora Genevieve Fong per la loro assistenza con estrazione mRNA e PCR, e Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation per il supporto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Quantum WARP 10Quantum Devices2070N030-A
Microtubuli con tappo a vite Plasticascientifica di qualità520-GRD-Q
KetaminaParnell, Alessandria Australia
Forbici modello standardFST14001-12
Lame chirurgiche in acciaio al carbonio #22LivingstoneSBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeursFST16221-14
StereomicroscopioLeica MicrosystemsA60S
Dumont #5 SF pinzeFST11252-00
Isolato II RNA Micro KitBiolineBIO-52075

Riferimenti

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  1. Agrawal, Y., Carey, J. P., Della Santina,, C, C., Schubert, M. C., Minor, L. B. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Archives of internal medicine. 169, 938-944 (2009).
  2. Bessho, K., et al. Effect of subthreshold infrared laser treatment for drusen regression on macular autofluorescence in patients with age-related macular degeneration. Retina. 25, 981-988 (2005).
  3. Olk, R. J., et al. Therapeutic benefits of infrared (810-nm) diode laser macular grid photocoagulation in prophylactic treatment of nonexudative age-related macular degeneration: two-year results of a randomized pilot study. Ophthalmology. 106, 2082-2090 (1999).
  4. Rodanant, N., et al. Predictors of drusen reduction after subthreshold infrared (810 nm) diode laser macular grid photocoagulation for nonexudative age-related macular degeneration. American journal of ophthalmology. 134, 577-585 (2002).
  5. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-beta peptide neuropathology in amyloid-beta protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 23, 521-535 (2011).
  6. Grillo, S. L., Duggett, N. A., Ennaceur, A., Chazot, P. L. Non-invasive infra-red therapy (1072 nm) reduces beta-amyloid protein levels in the brain of an Alzheimer's disease mouse model. TASTPM. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 123, 13-22 (2013).
  7. Purushothuman, S., Johnstone, D. M., Nandasena, C., Mitrofanis, J., Stone, J. Photobiomodulation with near infrared light mitigates Alzheimer's disease-related pathology in cerebral cortex - evidence from two transgenic mouse models. Alzheimer's researc., & therapy. 6, 2(2014).
  8. Sommer, A. P., et al. 670 nm laser light and EGCG complementarily reduce amyloid-beta aggregates in human neuroblastoma cells: basis for treatment of Alzheimer's disease. Photomedicine and laser surgery. 30, 54-60 (2012).
  9. Moro, C., et al. Photobiomodulation preserves behaviour and midbrain dopaminergic cells from MPTP toxicity: evidence from two mouse strains. BMC neuroscience. 14, 40(2013).
  10. Peoples, C., et al. Photobiomodulation enhances nigral dopaminergic cell survival in a chronic MPTP mouse model of Parkinson's disease. Parkinsonis., & related. 18, 469-476 (2012).
  11. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. The Journal of comparative neurology. 518, 25-40 (2010).
  12. Ying, R., Liang, H. L., Whelan, H. T., Eells, J. T., Wong-Riley, M. T. Pretreatment with near-infrared light via light-emitting diode provides added benefit against rotenone- and MPP+-induced neurotoxicity. Brain research. 1243, 167-173 (2008).
  13. Rajguru, S. M., et al. Infrared photostimulation of the crista ampullaris. The Journal of physiology. 589, 1283-1294 (2011).
  14. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  15. Desmet, K. D., et al. Clinical and experimental applications of NIR-LED photobiomodulation. Photomedicine and laser surgery. 24, 121-128 (2006).
  16. Huang, Y. Y., Chen, A. C., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose-response : a publication of International Hormesis Society. 7, 358-383 (2009).
  17. Rojas, J. C., Gonzalez-Lima, F. Low-level light therapy of the eye and brain. Eye and brain. 3, 49-67 (2011).
  18. Vranceanu, F., et al. Striated organelle, a cytoskeletal structure positioned to modulate hair-cell transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4473-4478 (2012).
  19. Johnson, K. R., et al. Separate and combined effects of Sod1 and Cdh23 mutations on age-related hearing loss and cochlear pathology in C57BL/6J mice. Hearing research. 268, 85-92 (2010).
  20. Tung, V. W., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50471(2013).
  21. Kirby, J., Menzies, F. M., Cookson, M. R., Bushby, K., Shaw, P. J. Differential gene expression in a cell culture model of SOD1-related familial motor neurone disease. Human molecular genetics. 11, 2061-2075 (2002).
  22. Parry, S. N., Ellis, N., Li, Z., Maitz, P., Witting, P. K. Myoglobin induces oxidative stress and decreases endocytosis and monolayer permissiveness in cultured kidney epithelial cells without affecting viability. Kidney and Blood Pressure Research. 31, 16-28 (2008).
  23. Saee-Rad, S., et al. Analysis of superoxide dismutase 1, dual-specificity phosphatase 1, and transforming growth factor, beta 1 genes expression in keratoconic and non-keratoconic corneas. Molecular vision. 19, 2501-2507 (2013).
  24. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  25. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of neuroscience. 120, 670-683 (2014).
  26. Moreno, L. E., et al. Infrared neural stimulation: beam path in the guinea pig cochlea. Hearing research. 282, 289-302 (2011).
  27. Curthoys, I. S. A red thread as a guide in the vestibular labyrinth. The Journal of physiology. 589, 1241-1241 (2011).
  28. Chakrabarti, S., et al. Mitochondrial Dysfunction during Brain Aging: Role of Oxidative Stress and Modulation by Antioxidant Supplementation. Aging and disease. 2, 242-256 (2011).
  29. Petrosillo, G., De Benedictis, V., Ruggiero, F. M., Paradies, G. Decline in cytochrome c oxidase activity in rat-brain mitochondria with aging. Role of peroxidized cardiolipin and beneficial effect of melatonin. Journal of bioenergetics and biomembranes. 45, 431-440 (2013).
  30. Zhu, H., Sun, A., Zou, Y., Ge, J. Inducible metabolic adaptation promotes mesenchymal stem cell therapy for ischemia: a hypoxia-induced and glycogen-based energy prestorage strategy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34, 870-876 (2014).

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