Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

Sommario

Questo protocollo descrive le tecniche per l'isolamento di cellule vive e la coltura primaria di linee cellulari miogeniche e fibroblastiche da tessuto muscolare o cutaneo. Viene anche descritta una tecnica per l'immortalizzazione di queste linee cellulari. Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.

Abstract

La generazione di linee cellulari specifiche per il paziente rappresenta uno strumento inestimabile per la ricerca diagnostica o traslazionale, e queste cellule possono essere raccolte dal tessuto bioptico cutaneo o muscolare disponibile durante l'iter diagnostico del paziente. In questo protocollo, descriviamo una tecnica per l'isolamento di cellule vive da piccole quantità di tessuto muscolare o cutaneo per la coltura cellulare primaria. Inoltre, forniamo una tecnica per l'immortalizzazione di linee cellulari miogeniche e linee cellulari di fibroblasti da cellule primarie. Una volta immortalizzate le linee cellulari, è possibile ottenere una sostanziale espansione delle cellule derivate dai pazienti. Le cellule immortalizzate sono suscettibili di molte applicazioni a valle, tra cui lo screening farmacologico e la correzione in vitro della mutazione genetica. Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.

Introduzione

La diagnostica molecolare si è evoluta notevolmente negli ultimi 20 anni. Il DNA genomico viene ora isolato di routine dall'espettorato o dal tampone della guancia, mentre in passato richiedeva un prelievo di sangue. Con gli attuali tempi di consegna rapidi e la facilità di sequenziamento genico, molte mutazioni della malattia vengono identificate di routine senza bisogno di ulteriori test. Nel caso della diagnostica delle malattie muscolari, l'identificazione di dozzine di nuovi geni nell'ultimo decennio responsabili della distrofia muscolare o della miopatia ha cambiato radicalmente il modo in cui queste malattie vengono diagnosticate ^1,2. Attualmente, ci sono dozzine di geni che sono stati identificati come cause della distrofia muscolare e della miopatia congenita, anche se i meccanismi con cui molti di questi geni producono la malattia rimangono poco chiari. In particolare, le malattie rare costituiscono una sfida a causa delle piccole dimensioni della popolazione di pazienti. Per questi casi, così come per le malattie più comuni, è altamente auspicabile la generazione di strumenti stabili che facilitino gli studi sul meccanismo di patogenesi e lo screening dei farmaci terapeutici.

Nonostante i notevoli progressi nella diagnostica del DNA, le biopsie muscolari vengono ancora eseguite per stabilire la diagnosi primaria in molti pazienti in cui si sospetta una malattia metabolica primaria o muscolare. Quando è necessaria una biopsia muscolare, offre l'opportunità di un'ulteriore raccolta di tessuti diagnostici e di ricerca con un rischio aggiuntivo minimo di morbilità per il paziente. Poiché ci sono una serie di usi per ogni campione di tessuto, è altamente auspicabile stabilire tecniche per la coltura cellulare primaria utilizzando tessuti chirurgici che siano semplici, efficienti e richiedano quantità minime di tessuto. È necessario un adeguato triage delle biopsie muscolari o cutanee per massimizzare l'isolamento delle cellule primarie dai tessuti e la conservazione a lungo termine del materiale vivo. Inoltre, la ricerca sulle cellule staminali e lo screening dei farmaci sono molto promettenti per lo sviluppo di terapie per molte malattie utilizzando saggi basati su cellule ^3,4.

Descriviamo qui i metodi per l'isolamento delle cellule primarie da biopsie muscolari o cutanee umane. Inoltre, includiamo un protocollo per l'immortalizzazione delle cellule miogeniche, utile per generare un gran numero di cellule da un individuo. Queste cellule possono essere utilizzate per applicazioni a valle, come gli screening farmacologici personalizzati, che altrimenti sarebbero irrealizzabili con il numero complessivo basso di cellule ottenute dal tessuto primario.

Protocollo

NOTA: I protocolli per la raccolta di tessuti umani devono essere esaminati e approvati dal comitato istituzionale IRB. Raccolta di scartati, tessuti umani de-identificato è stato approvato dal Children Hospital di Boston e Brigham and Women Hospital IRB Comitati. I metodi descritti di seguito sono stati applicati per l'isolamento di cellule miogeniche da de-identificati, scartato il tessuto. I metodi descritti sono applicabili ai tessuti raccolti da materiale paziente acconsentito.

Isolamento 1. Cella

1. La dissociazione della biopsia muscolare e purificazione di cellule miogeniche
   1. Pre-pesare un tessuto piastra di coltura 10 centimetri in una cappa coltura tissutale biosicurezza, e poi ri-pesare il piatto contenente la biopsia muscolare per calcolare la quantità di tessuto da dissociato.
   2. Utilizzando bisturi sterili, il tessuto muscolare tritare finemente e aggiungere qualche goccia di sterile 1x HBSS per evitare che il tessuto si secchi.
   3. Aggiungere 3,5 ml ciascuno di dispase II e collagenasi D per grammo di tessuto muscolare per essere digerito. Pipettare il tessuto macinata e soluzione enzimatica attraverso una sterile 25 ml pipetta un paio di volte. Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 15 min e digerire il tessuto fino slurry passa facilmente se un sterile 5 ml pipetta.
      NOTA: tessuto dissociazione avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90 min. Si prega di fare riferimento alla sezione "Risultati Rappresentante 'per ulteriori dettagli.
   4. Aggiungere 2 volumi di mezzo di crescita sterili per tessuti dissociato, filtrare attraverso un filtro 100 micron cellule sopra a 50 ml tubolare e pellet coniche per 10 min a 329 g (circa 1.100 rpm), a temperatura ambiente. Si prega di fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione media.
   5. Risospendere il pellet in 1 volume di mezzo di crescita sterili ed aggiungere 7 volumi soluzione di lisi dei globuli rossi. Filtrare la soluzione attraverso un colino cella 40 micron, quindi pellet tlui cellule per 10 min a 329 xg, temperatura ambiente.
   6. Contare le cellule in un emocitometro e risospendere le cellule in 1x HBSS 0,5% BSA ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule / 100 microlitri. Mettere da parte ~ 250.000 cellule in un unico tubo che verranno utilizzati come controllo negativo (senza macchia). Impostare tubi da parte ulteriori monocolore macchiati di controllo per ioduro di propidio e per CD56, che sono necessari per il corretto gating di cellule positive CD56 da FACS ordinamento. Fare riferimento alla cella manuali smistamento o consultare FACS ordinamento esperti core facility per garantire controlli adeguati sono inclusi.
   7. Macchiare le cellule da ordinare con 5μl / 10 ⁶ cellule di anticorpo anti CD56. Incubare tutti i campioni (compresi i controlli) su ghiaccio per 30 min.
   8. Lavare i campioni a 10 ml 1x HBSS e cellule pellet per 10 min a 329 g (circa 1.100 rpm) in una centrifuga refrigerata a 4 ° C di temperatura.
   9. Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 1 ug / ml per il campione ad essere sorted per l'esclusione di cellule morte. Purificare miogenici CD56 cellule positive dalle cellule non-miogeniche utilizzando la fluorescenza attivato cell sorter.
2. La dissociazione della biopsia cutanea
   NOTA: Dermal fibroblasti possono essere isolati da un pugno di pelle da pazienti quando biopsie muscolari non sono disponibili. Fibroblasti dermici possono essere utilizzati come biomateriale per vari studi, tra trasduzione con MyoD per generare cellule miogeniche. Inoltre, fibroblasti dermici possono essere utilizzati per generare cellule iPS, che possono essere differenziati in vari tipi di cellule per ulteriori studi.
   1. Trasportare la biopsia cutanea al laboratorio di mezzo di trasporto. Una volta ricevuto il campione, effettuare la coltura primaria appena possibile. Se la cultura primaria non è possibile stabilire il giorno stesso, conservare il campione a temperatura ambiente per una notte.
   2. Trasferire la biopsia cutanea di una piastra da 35 mm di Petri sterile nella cappa a flusso laminare.
   3. Sciacquare la biopsia cutanea in una capsula di Petri con sterili 1x PBS per rimuovere il sangue e detriti. Rimuovere il tessuto adiposo con un bisturi sterile.
   4. Aggiungere la soluzione di collagenasi 2 ml e tritare il tessuto con un bisturi, incubare a 37 ° C per 45 minuti a 1 ora, a seconda delle dimensioni del tessuto.
   5. Trasferire il tessuto digerito in una provetta conica da 15 ml, lavare la capsula di Petri con 2 ml di mezzo di coltura di fibroblasti due volte, e raccogliere il fluido nel tubo stesso.
   6. Agglomerare cellule a 200 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   7. Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 3 ml di terreno di fibroblasti per rimuovere la collagenasi, poi di nuovo cellule pellet. Si prega di fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione media.
   8. Ripetere il passaggio 1.2.7 ancora una volta.
   9. Risospendere il pellet in cellule medie fibroblasti e la piastra 5 ml su un pallone di coltura di tessuto T25 sterile. Incubare la beuta a 37 ° C con 5% di CO _2.
   10. Valutare la cultura per il fissaggio dei fibroblasti e la crescita nei prossimi 1-3 giorni.
       Nota: alcuni piccoli pezzi di tessuto può anche allegare al piatto e fibroblasti migrare di questi pezzi di tessuto.
   11. Mantenere la cultura nelle stesse condizioni fino fibroblasti sono coltivate a circa l'80% di confluenza.
   12. Raccogliere fibroblasti da tripsinizzazione e trasferire su palloni di coltura fresco per l'espansione ulteriore. Eseguire tripsinizzazione lavando culture 3 volte in 1x PBS libera di Ca ⁺⁺ e Mg ^++. Aggiungere tripsina-EDTA (vedi Materiali Table) alle cellule (2 ml / pallone T25) per 2 minuti a 37 ° C.
   13. Split cellule staccate in fiaschi supplementari. Se alcuni pezzi di tessuto rimangono attaccati ai fiaschi T25 originali, aggiungere 5 ml di terreno di coltura fresco per questo pallone e più fibroblasti migreranno fuori continuamente.
       NOTA: La cultura fibroblasti espansa può essere congelato giù come P1 e conservato in azoto liquido per esperimenti futuri.

2. Immortalizzazione di cellule miogeniche

1. cellule Tavola 5 milioni Phoenix Ecotropic Confezioni (PE) durante la notte in una piastra di coltura tissutale sterili 10 centimetri in DMEM e Medium 199 in un rapporto di 4: 1, integrato con siero di vitello al 10%.
2. Cellule di alimentazione 30 min prima di trasfezione con 5 ml di mezzi freschi integrato con 10 mM di caffeina.
3. Omogeneizzare una miscela di 2 mg di DNA plasmidico da una preparazione midi (CDK4 o hTERT plasmide) e Polyjet ed incubare a temperatura ambiente per 15 min, come raccomandato dal produttore.
4. Aggiungere il composto plasmide / Polyjet alle cellule PE durante la notte.
5. Cellule feed con mezzo fresco (DMEM e Medium 199 in un rapporto di 4: 1, supplementato con siero di vitello al 10%). Dodici ore dopo, raccogliere il surnatante contenente il virus e filtrare attraverso un filtro a 0,45 micron dimensione dei pori.
6. Usare 1 ml di surnatante raccolto di infettare tutta la notte la linea di cellule PA317 confezionamento amphotropic ⁵ e ottenere una linea di virus producono stabile cella dopo la selezione o con 0,5 mg / ml neomicina (G418) per CDK4 o 0,5 mg / ml igromicina per hTERT.
7. Preparare lavoro surnatanti virali coltivando le cellule di packaging stabili nei pressi di confluenza, poi raccogliendo il surnatante ogni mattina, sera e la mattina, per tre raccolti.
8. Filtrare il surnatante virale e utilizzare direttamente o dividerli in aliquote di 1 ml e conservare a -80 ° C per un uso successivo. Si noti che il surnatante virale perde il 50% di efficienza infezione tra gelo e disgelo. Ricordarsi di candeggina-wash, prima di eliminare tutto ciò che ha toccato le particelle virali.
   NOTA: La linea cellulare PA317 virus-produzione stabile può essere congelato e mantenuta a -150 ° C per la memorizzazione permanente (congelamento medio è del 10% DMSO; 90% siero).
9. Cellule miogeniche Piastra FACS-purificato (descritto nei passaggi 1,1-1,9) ad una densità di 5 x 10 ⁴ cellule / pozzetto in piastre da 6 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina. Assicurarsi che le cellule sono attaccati alla piastra prima di procedere con l'infezione virale.
10. Aggiungere 400 microlitri filtrato, freshly prodotto surnatante virale o aliquote congelate di ogni piatto sei bene durante la notte (mantenere 2 pozzi come controlli).
11. Cambiare medio alimentando cellule con 2,5 ml / pozzetto di mezzi freschi muscolare (4: 1 di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) e Medium 199 supplementato con siero fetale bovino 15%; 0,02 M tampone HEPES, 1,4 mg / L di vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L desametasone, 2.5 mg / l il fattore di crescita degli epatociti e / L fibroblasti fattore di crescita di base 10 mg). Eliminare i media e pipette contenenti le particelle virali in un contenitore di candeggina. Lasciare cellule nello stesso mezzo per 3 giorni per recuperare da infezione, poi trattare per la selezione utilizzando 400 mg / ml di neomicina (infezione CDK4) o 300 mg / ml igromicina (infezione hTERT).
12. Mantenere le cellule sotto selezione di droga fino a quando le cellule della matrice piatto di controllo (1-2 settimane).
13. Passaggio cellule prima che diventino confluenti (60-80% di confluenza, utilizzando 0,05% tripsina EDTA), anche durante la selectisul periodo. Cellule replate 10 centimetri in più piatti con media mioblasti fresca (come descritto in 2.11) integrati con il farmaco di selezione. Mantenere celle selezionate immortalizzate come popolazione eterogenea clonare o per ottenere un background genetico completamente omogenea (stessa inserimento del transgene in ogni cellula).
14. Eseguire la selezione clonale utilizzando le seguenti operazioni:
    1. Seme le cellule a bassa densità (ad esempio da 300 a 500 cellule in 10 piatti cm) e mantenere per circa due settimane, fino a quando si formano piccole colonie (10-20 cellule).
    2. Rimuovere la maggior parte del mezzo, a questo punto, lasciando solo una sottile pellicola per impedire le cellule si secchi.
    3. Posizionare un anello di clonazione (con una estremità immersa in grasso per vuoto silicone) su ogni clone desiderato e aggiungere qualche goccia di tripsina / EDTA.
    4. Celle di raccolta una volta che diventano arrotondati aspirando attentamente le cellule con una punta 1 ml o una pipetta Pasteur e trasferirli al più piccolo disponibile pla pozzettite (96 o 48, 24 o 12 pozzetti).
    5. Espandere cloni come necessario per evitare confluenza locale.

Risultati

Figura 1 illustra alcuni dei passaggi chiave coinvolti nella dissociazione tessuti primaria: l'esatta quantità di tessuto è pesato in un piatto di coltura di tessuti petri sterile (Figura 1A, B). Il tessuto viene quindi macinato finemente usando bisturi sterile, fino ad ottenere uno slurry di tessuto (Figura 1C, D). Dopo l'aggiunta di enzimi digestivi, il muscolo principale dissociazione del tessuto avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90 min. La p...

Discussione

Le cellule come una risorsa utile

L'isolamento e la cultura delle popolazioni di cellule miogeniche è estremamente utile quando si stabilisce fenotipi di malattia o in modelli in vitro di malattia. La procedura di isolamento delle cellule miogeniche qui descritto consente l'isolamento di mioblasti e fibroblasti da campioni del muscolo scheletrico, che possono poi essere propagate, differenziati, o immediatamente analizzati. La struttura e la funzione dei mioblasti p...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzature
Tissue  cappa di biosicurezza per coltura	Baker Company, Inc.	Modello SterilGuard Hood
Centrifuga da banco, come il modello Beckman	Beckman Coulter	Modello Allegra 6R	Se viene eseguita la selezione cellulare, è preferibile una centrifuga con refrigerazione
Microscopio	Nikon	Modello Eclipse TS100
Incubatore per colture tissutali, collegato a una fonte CO2 Forma	Scientific	Serie II
Selezionatore cellulare attivato da fluorescenza (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagenti per l'isolamento di mioblasti primari dal tessuto
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Preparare una soluzione di calza di 2,4U/ml in DMEM
Collagenasi D	Roche Applied Science	#088882001	Preparare una soluzione madre da 10 mg/ml
1x Hank' sterile s Soluzione salina bilanciata (HBSS), priva di calcio e magnesio	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Albumina sierica bovina, frazione V	Sigma	#05470	Preparare una soluzione sterile di 1X HBSS 0,5% BSA per la selezione FACS
Terreno di crescita sterile per mioblasti: Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio (4,5 g) integrato con il 30% di siero fetale bovino	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contiene L-glutammina
Soluzione di lisi RBC	Qiagen	158904
Ioduro di propidio 10mg/ml	Sigma	P4170	Preparare la soluzione madre diluendo la polvere in acqua distillata sterile
Anticorpo CD56 umano per citometria a flusso	Biolegend	318310	Anticorpo coniugato APC, sono disponibili altre etichette
Reagenti per l'immortalizzazione dei mioblasti
Linea cellulare di imballaggio ecotropico PE	Cell Biolabs	RV-101
Linea cellulare di confezionamento anfotropico PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Gelatina di pelle di maiale	Sigma	G1890-500g	Preparare una soluzione madre di gelatina allo 0,1% in acqua. Rivestire il piatto con la soluzione a 37 gradi C per un'ora. Rimuovere la soluzione e aggiungere il terreno.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
plasmidi pBabe contenenti mCDK4 e hTERT	non disponibili		Stadler et al, 2013
Kit midiprep del plasmide Qiagen	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medio 199 (31150022)
Dulbecco' s Eagle medium modificato (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Terreno di crescita mioblasto: 4:1 Dulbecco' s modificato Eagle medium (DMEM) e Medium 199 integrato con il 15% di siero fetale bovino; tampone HEPES da 0,02 M; 1,4 mg/L di vitamina B12; 0,03 mg/L di ZnSO4, 0,055 mg/L di desametasone, 2,5 μ g/L fattore di crescita degli epatociti e 10 μ g/L di fattore di crescita dei fibroblasti beta.	Tecnologie per la vita (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (solfato di zinco); Sigma (Vit.B12, Desametasone); Chemicon internazionale (HGF); Biopioniere (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Preparare il terreno e la soluzione madre Vit. B12 (20mg/ml); Solfato di zinco (60µ g/ml); Dex (55µ g/µ l) separatamente per un uso più semplice. Soluzione madre di HGF (5µ g/ml) e FGF (20µ g/ml) deve essere aggiunto fresco ogni settimana alla concentrazione di lavoro finale.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Anticorpo a catena pesante della miosina per l'immunocolorazione	Banca degli ibridomi dello sviluppo	MF20	Clone MF20
Desmin Anticorpo per l'immunocolorazione	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Siero di cavallo	Invitrogen	26050-088
Reagenti per l'isolamento dei fibroblasti cutanei primari
Terreno di trasporto: RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e lo 0,2% di penicillina/streptomicina	Terreno RPMI 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Terreno di coltura di fibroblasti primari umani: RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina	Siero fetale bovino: Thermo Scientific	SH30071.03
Soluzione di collagenasi: Collagenasi di tipo 2 (100 mg) risospesa in 12,5 ml di terreno di coltura per fibroblasti e sterilizzata con filtro	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) senza calcio e magnesio	Lonza	17-516F
Materiali per l'isolamento dei mioblasti
primari Provette coniche sterili da 50 ml e 15 ml	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Bisturi sterili	Aspen Surgical	372610
Emocitometro	Hausser Scientific	1492
Pipette sterili da 5, 10 e 25 ml Vetro	Bellco	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)	Le pipette riutilizzabili vengono lavate, tappate con cotone e sterilizzate in autoclave prima dell'uso
Piastre in plastica sterili trattate con coltura tissutale (10 cm)	BD Falcon	353003
Filtri cellulari sterili in nylon (100 &; micro; m e 40 µ taglia m)	BD Falcon	352340 (40µ m); 352360 (100µ m)
Materiali per l'immortalizzazione dei mioblasti
Sterile 0,45 & micro; m filtri	Millipore	SLHV013SL
Anelli di clonazione	Corning	#3166-8	Da pulire e sterilizzare in autoclave prima e dopo l'uso
Materiali per linee cellulari di fibroblasti
Piastre sterili in plastica trattate per colture tissutali da 35 mm	Greiner bio-one	628160
Bisturi sterili	DeRoyal	D4510A
Flaconi sterili per colture tissutali T25	Techno Plastic Product, TPP	90026	venduti negli Stati Uniti da MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010