Utilizzando scansioni MRI (umane), software di imaging 3D e analisi immunoistologica, documentiamo i cambiamenti nei ventricoli laterali del cervello. La mappatura 3D longitudinale delle variazioni di volume del ventricolo laterale e la caratterizzazione dei cambiamenti cellulari periventricolari che si verificano nel cervello umano a causa dell'invecchiamento o della malattia vengono quindi modellati nei topi.
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Articolo metodologico
Modellazione 3D del laterale ventricoli e istologica Caratterizzazione del Tissue periventricolare di esseri umani e il mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema ventricolare trasporta e fa circolare il liquido cerebrospinale (CSF) e facilita l'eliminazione di soluti e tossine dal cervello. Le unità funzionali dei ventricoli sono cellule epiteliali ciliate denominate cellule ependimali, che rivestono i ventricoli e attraverso l'azione ciliare sono in grado di generare un flusso laminare di liquido cerebrospinale sulla superficie del ventricolo. Questo monostrato di cellule ependimali fornisce anche funzioni di barriera e filtrazione che promuovono lo scambio tra i fluidi interstiziali cerebrali (ISF) e il liquido cerebrospinale circolante. I cambiamenti biochimici nel cervello si riflettono quindi nella composizione del liquido cerebrospinale e la distruzione dell'ependima può interrompere il delicato equilibrio dello scambio di liquido cerebrospinale e ISF. Nell'uomo esiste una forte correlazione tra l'espansione del ventricolo laterale e l'invecchiamento. La ventricolomegalia associata all'età può verificarsi anche in assenza di demenza o ostruzione del flusso del liquido cerebrospinale. La causa esatta e la progressione della ventricolomegalia sono spesso sconosciute; Tuttavia, i ventricoli allargati possono mostrare una perdita regionale e, spesso, estesa della copertura cellulare ependimale, con astrogliosi della superficie ventricolare ed edema periventricolare associato che sostituisce il monostrato funzionale delle cellule ependimali. Utilizzando le scansioni MRI insieme al tessuto cerebrale umano post mortem, descriviamo come preparare, visualizzare e compilare rendering 3D dei volumi del ventricolo laterale, calcolare i volumi del ventricolo laterale e caratterizzare il tessuto periventricolare attraverso l'analisi immunoistochimica delle preparazioni di tessuto della parete del ventricolo laterale en front. Vengono inoltre presentate analisi corrispondenti del tessuto cerebrale di topo a sostegno dell'uso di modelli murini come mezzo per valutare i cambiamenti dei ventricoli laterali e del tessuto periventricolare riscontrati nell'invecchiamento e nella malattia umana. Insieme, questi protocolli consentono di indagare la causa e l'effetto della ventricolomegalia e di evidenziare le tecniche per studiare la salute del sistema ventricolare e le sue importanti funzioni di barriera e filtrazione all'interno del cervello.
Introduzione
Un ependimali linee monostrato cellulare il sistema ventricolare del cervello fornire funzioni bidirezionali di barriera e di trasporto tra il fluido cerebrale spinale (CSF) e liquido interstiziale (ISF) 1-3. Queste funzioni aiutano a mantenere in equilibrio fisiologico 2,3 libero da agenti tossici nel cervello. Negli esseri umani la perdita di porzioni di questo rivestimento per infortunio o malattia non sembra tradursi in sostituzione rigenerativa come si trova in altri rivestimenti epiteliali; piuttosto la perdita di copertura cellulare ependimale sembra comportare astrogliosis periventricolare con un reticolo di astrociti che coprono regioni....
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Protocollo
NOTA: le procedure di animali sono stati approvati dalla University of Connecticut IACUC e sono conformi alle linee guida NIH. Il tessuto umano e l'analisi dei dati e le procedure fossero conformi e approvati dalla University of Connecticut IRB e sono conformi alle linee guida NIH.
1. Mouse: Analisi di periventricolare Cellular Integrità e modellazione 3D del ventricolo laterale
1.1) Preparazione del mouse ventricolo laterale intera parete Monti
- Preparare il mouse ventricolo laterale interi supporti per immunoistochimica (IHC) come descritto in precedenza 16,17.
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Risultati
Contour tracciamento dei ventricoli laterali del mouse sulla base immunostained 50 micron sezioni coronali e ricostruzioni 3D (Figura 3) consente ai dati del volume per essere raccolti in diversi paradigmi sperimentali utilizzando il mouse come sistema modello per la malattia o infortunio. Fondamentale per questa procedura è l'esclusione delle regioni in cui le pareti laterali ventricolo aderiscono l'uno all'altro. Con subsegmenting regioni dei ventricoli e la designazione di un colore diver.......
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Discussione
Presentiamo strumenti e protocolli che possono essere utilizzati per valutare l'integrità del sistema ventricolare del cervello in topi e negli esseri umani. Questi strumenti, tuttavia, possono essere applicati anche ad altre strutture cerebrali o sistemi di organi che subiscono variazioni dovute a lesioni, malattie, o durante il processo di invecchiamento 14,21,22. Le strategie presentate approfittare di software che permette l'allineamento di sequenze MRI trasversali e longitudinali per generare rap.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Un NINDS Grant NS05033 (JCC) ha supportato questo lavoro. I programmi RAC, SURF e OUR dell'Università del Connecticut hanno fornito ulteriore supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Microscopia elettronica Scienze | 19210 | Uso al 4% in PBS, 4 gradi; C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,1% in PBS (v/v) |
| Vibratomo | Leica | VT1000S | |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss | Imager.M2 | |
| Fotocamera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscopio Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Software di stereologia | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Software di stereologia | ImageJ/NIH NIH | freeware | |
| di ricostruzione 3D | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Microscopio confocale | Leica | TCS SP2 | |
| risonanza | |||
| magnetica Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentazione e volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentazione e | |
| analisi multi-immagine del volume GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Sovrapposizione longitudinale | |
| Intera attrezzatura | |||
| 22,5 gradi coltello da pugnalata dritto microchirurgico | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| ... | |||
| perni | |||
| pinze | |||
| aquapolymount | |||
| Microscopio da dissezione | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenina | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| capra anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| coniglio anti-AQP4 (acquaporina-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Anticorpi | |||
| Anti-S100β anticorpo | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 &; g/ml in PBS |
Riferimenti
- Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
- Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid,....
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Ristampe e permessi
