Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

Summary

I protocolli descrivono due sistemi di test in vitro di tossicità dello sviluppo (UKK e UKN1) a base di cellule staminali embrionali umane e studi trascrittoma. I sistemi di test prevedono pericolo tossicità per lo sviluppo umano, e possono contribuire a ridurre studi sugli animali, i costi e il tempo necessario per le prove della sicurezza chimica.

Abstract

Protocolli efficaci per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane a vari tessuti in combinazione con le tecnologie omiche aprono nuovi orizzonti per la tossicità in vitro test in di potenziali farmaci. Per fornire una solida base scientifica per tali dosaggi, sarà importante per ottenere informazioni quantitative sul corso tempo di sviluppo e sui sottostanti meccanismi regolatori di approcci biologia dei sistemi. Due saggi sono stati quindi sintonizzati qui per queste esigenze. Nel sistema di test UKK, cellule staminali embrionali umane (hESC) (o altre cellule pluripotenti) sono lasciate per differenziare spontaneamente per 14 giorni in corpi embrionali, a consentire la generazione di cellule di tutte e tre strati germinali. Questo sistema ricapitola passaggi chiave del primo sviluppo embrionale umano, ed è in grado di prevedere in anticipo embrionale tossicità / teratogenicità specifici umano, se le cellule sono esposti a sostanze chimiche durante la differenziazione. Il sistema di test UKN1 si basa sulla differenziazione hESC a un populationi di neuroectodermica progenitore (NEP), le cellule per 6 giorni. Questo sistema ricapitola precoce sviluppo neurale e prevede presto neurotossicità per lo sviluppo e cambiamenti epigenetici innescati da sostanze chimiche. Entrambi i sistemi, in combinazione con studi transcriptome microarray, sono adatti per l'identificazione di marcatori di tossicità. Inoltre, essi possono essere usati in combinazione per generare dati di input per l'analisi dei sistemi biologia. Questi sistemi di prova hanno vantaggi rispetto ai tradizionali studi tossicologici che richiedono grandi quantità di animali. I sistemi di test, possono contribuire ad una riduzione dei costi per lo sviluppo di farmaci e la valutazione della sicurezza chimica. La loro combinazione mette in luce soprattutto sui composti che possono influenzare lo sviluppo neurologico specifico.

Introduction

La capacità delle cellule staminali embrionali umane (hESC) di differenziarsi in vari tipi di cellule ha aperto una nuova era di tossicità test in vitro ^1, modelli di malattia e della medicina rigenerativa ^2. Le cellule staminali sono dotati della capacità di auto-replicarsi, per mantenere il loro stato pluripotente, e di differenziarsi in cellule specializzate ^3,4. Le proprietà di hESC (capacità di differenziarsi a tutti i principali tipi di cellule) si trovano anche in altre cellule staminali pluripotenti umane, come le cellule umane pluripotenti indotte staminali (hiPSC) o le cellule generate da trasferimento nucleare

Protocol

Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando la linea di cellule staminali embrionali umane (hESC) H9. Questa linea cellulare è stata regolarmente coltivati ​​su fibroblasti di topo mitoticamente inattivato embrionali (MEF) in coltura hESC multimediale integrato con bFGF e poi coltivate in mezzi di cellule staminali su 6 centimetri piastre Petri rivestite di matrice membrana basale come matrigel, per sbarazzarsi di MEF. Le cellule H9 di> 80% lastre confluenti sono stati utilizzati per un ulteriore passaggio. Cellule H9 coltivate su piastre di matrice membrana basale sono stati utilizzati per la formazione EBS. Tutte le procedure di ....

Results

Esposizione al mercurio metile in sistema di prova UKK

Il saggio di citotossicità è stata eseguita con H9 EBs per ottenere un valore di IC ₁₀ (riduzione della vitalità del 10%) per la citotossicità di metilmercurio (Figura 1). Abbiamo anche eseguito un microarray basato (piattaforma Affymetrix) studio biomarker. La H9 EBs sono stati esposti al mercurio metilico (0.25 e 1 micron) per 14 giorni. Il giorno 14, i campioni sono stati raccolti utilizzando TRIzol e RNA è.......

Discussion

Gli approcci tradizionali alla sperimentazione tossicologica coinvolgono ampi studi su animali rendendo così i test costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa delle differenze interspecie gli studi sulla sicurezza animale preclinici non sono sempre validi per prevedere effetti di tossicità di potenziali farmaci rilevanti per gli esseri umani. Anche se i primati non umani sono più prevedibili, ancora forte etica, e le richieste socioeconomiche sono rapidamente alzando dalla società moderne per sviluppare sensibili e robu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Dulbecco's Modified Eagle Medium: miscela di nutrienti F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	integratore GlutaMAX
NEAA	Life Technologies	11140050	MEM Soluzione
DPBS	Life Technologies	14190-0144	Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio
mTeSR medio	Stemcell Technologies	5850
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
V piastra inferiore	VWR	734-0483	Piastra, Microwell, V BTTM, 96 pozzetti, sterile 1 * 50 ST
V coperchio della piastra inferiore	VWR	634-0011	Coperchio, piastre per microtitolazione, anello di cond. 1 * 50
ST Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Penicillina-streptomicina,
acqua distillata liquida	Life Technologies	15230-089.	Acqua distillata sterile
Umano FGF-2 (bFGF)	Millipore	GF003AF-100UG	Fattore di crescita dei fibroblasti basico, umano ricombinante, senza animali
Filtro 0,22 μ m	Millipore	SCGPU02RE	Stericup-GP, 0.22 μ m, polietersulfone, 250 ml, radiosterilizzato
StemPro EZPassageTM Disposablte	Invitrogen	23181010
BD MatrigelTM, qualificato hESC Matrix	Stemcell Technologies	354277	flaconcino da 5 ml
DMSO	Sigma	D-2650
RNAlater Soluzione di stabilizzazione	Life Technologies	AM7020	Stabilizza e protegge l'integrità dell'RNA nei campioni non congelati.
70 μ m Filtro cellulare	Becton Dickinson	352350	Filtro cellulare con 70 μ m Maglia di nylon
35 μ m Filtro a celle del coperchio, 5  provetta da ml	Becton Dickinson	352235	provetta da 5 ml in polistirene a fondo tondo, con tappo per filtro cellulare (35  μ m)
Tubo sterile in polipropilene da 50 ml	Greiner Bio-One	227261	Tubo in polipropilene da 50 ml con fondo conico, pallone sterile
T75	Greiner Bio-One	658175	CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flaconi
TRIzol	Life Technologies	10296010
piastre a fondo ottico a 96 pozzetti	Thermo Scientific	165305
CellTiter-Blue	Promega	G8081
Accutase	PAA	L11-007
Apotransferina	Sigma-Aldrich	T-2036
Dispase	Worthington Biochemicals	LS002104
Dorsomorfina	Tocris Bioscience	3093
EDTA	Roth	8043.2
FBS	PAA	A15-101
FGF-2	R& D Systems	233-FB
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021-100G
GlutaMAX	Gibco Invitrogen	35050-038
HEPES	Gibco Invitrogen	15630-056
Insulina	Sigma-Aldrich	I-6634
Knockout DMEM	Gibco Invitrogen	10829-018
Matrigel	BD Biosciences	354234
Noggin	R& D Systems	719-NG
PBS	Biochrom AG	L1825
Progesterone	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescina	Sigma-Aldrich	P-5780
Inibitore ROCK Y-27632	Tocris Biosciences	1254
SB431542	Tocris Biosciences	1614
SDS	Bio-Rad	161-0416
Selenio	Sigma-Aldrich	S-5261
β-Mercaptoetanolo	Gibco Invitrogen	31350-010
[header]
Elenco dei kit
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Kit di ibridazione, lavaggio e colorazione GeneChip	Affymetrix	900721, 22, 23	Questo kit fornisce tutti i reagenti necessari per l'ibridazione, il lavaggio e la colorazione dei microarray.
Set DNase senza RNASI	QIAGEN	79254
[header]
Elenco delle apparecchiature
Microscopio invertito	Genechip Olympus		IX71
- 645	Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450	Affymetrix Affymetrix
Scanner Gene-Chip-3000-7 G	Affymetrix
Spectramax M5	Molecular Devices
[header]
Elenco dei software
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Strumenti online per l'annotazione funzionale DAVID Onto-tools Laboratorio