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Articolo metodologico

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

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⸱

DOI:

10.3791/52343

⸱

4 gennaio 2015

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

In questo articolo

Sommario

Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Abstract

Tessuti tumorali rigidi sono stati fortemente implicati nella regolazione della migrazione delle cellule del cancro e l'invasione. Migrazione invasiva attraverso i tessuti reticolati è facilitato da sporgenze ricchi di actina chiamati Invadopodi che proteoliticamente degradano la matrice extracellulare (ECM). Attività Invadopodi ha dimostrato di essere dipendente da rigidità ECM e il cancro delle cellule contrattili forze che suggeriscono che i segnali di rigidità possono regolare queste strutture subcellulari attraverso actomiosina contrattilità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Mentre esistono delle differenze tra i due test, il protocollo qui presentata fornisce un metodo per la creazione di PAA thin può essere utilizzato in entrambi i test e sono facilmente adattabili alle esigenze biologiche e tecniche specifiche dell'utente.

Introduzione

La rigidità del ECM associati al tumore è stato identificato come un fattore significativo nel determinare comportamenti maligni aumentando actomiosina contrattilità 1-3. Anche se questo effetto è stato dimostrato soprattutto con le cellule del cancro al seno, la rigidità matrice è stato trovato per modificare le proprietà invasive di cellule derivate da una varietà di tumori 4-8 che suggeriscono che la rigidità del tumore può svolgere un ruolo in altri tipi di tumori. Per penetrare i tessuti reticolati durante la migrazione invasivo, le cellule tumorali utilizzano sporgenze adesive ricche di actina conosciuti come Invadopodi che localizzare proteasi a degradare focally ECM 9. Invadopodi sono considerati un segno distintivo di cellule invasive e sono stati implicati in invasione delle cellule tumorali e metastasi 10,11. Il lavoro precedente ha mostrato che la rigidità matrice può regolare numeri Invadopodi e associati ECM degrado 4,12 attraverso l'attività miosina II e proteine ​​meccanosensibili 12. Dato checorrelazione tra la densità del tumore e cancro aggressività 13,14, questi risultati suggeriscono un meccanismo attraverso il quale le cellule tumorali possono rispondere ai tessuti tumorali rigidi guidare invasione e metastasi attraverso actomiosina contrattilità.

In vitro rigidità ECM e nella densità del tessuto vivo hanno dimostrato di regolare il comportamento invasivo delle cellule tumorali 1,15-17. Mentre actomiosina contrattilità sembra essere importante in questo processo, gli studi in corso il conflitto come se la capacità metastatica è correlata ad un aumento o diminuzione forze contrattili 6,18-20. Inoltre, resta noto se queste forze mediare direttamente l'attività Invadopodi 21. Abbiamo recentemente scoperto che le forze contrattili cellula tumorale dipendevano rigidità matrice ed erano predittivi di ECM degrado da Invadopodi 5. Questi risultati suggeriscono che le forze cellulari possono svolgere un ruolo importante nella progressione del cancro mediando Invadopodi actività in risposta alle proprietà meccaniche del microambiente tumorale.

Al fine di correlare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali 5, abbiamo modificato un protocollo per la creazione di ZAP con differenti rigidità precedentemente utilizzati per studiare l'attività Invadopodi rigidità-dipendente 4,12,22. Con reticolazione chimica fibronectina plasma umano durante ZAP, questi idrogel modificati possono essere utilizzate come base per entrambi Invadopodi e forza di trazione saggi per assicurare che le cellule sperimentato le stesse rigidità in entrambi gli esperimenti 5. Nei saggi Invadopodi, la fibronectina fornisce un dominio di legame naturale per la gelatina di collegare la ECM sovrapposto alla ZAP per rilevare degradazione della matrice. Nei saggi di forza di trazione, la fibronectina fornisce un ligando per adesione cellulare diretta per rilevare spostamenti microsfere utilizzate per calcolare le forze di trazione cellulari. Questo metodo comporta quello che abbiamo chiamato morbido, duro,e CPA rigidi che sono legati ai piatti fondo di vetro e hanno moduli elastici, E, di 1.023, 7.307, e 22.692 Pa 5 che abbracciano la gamma di proprietà meccaniche segnalate per i tessuti normali e tumorali 23.

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Protocollo

1. Preparazione di vetrini di vetro per PAA

  1. Pulire 12 millimetri coprioggetto con panni bassi lint.
  2. Flame i coprioggetti 12 mm e il coprioggetto 14 millimetri nel micropozzetto di ogni piatto di vetro fondo 35 millimetri facendoli passare attraverso una fiamma becco Bunsen con una pinzetta.
  3. Trattare i pozzetti con 200 ml di 0,1 N NaOH per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min.
  5. Trattare i pozzetti con 50-100 ml di 3-amminopropiltrimetossisilano per 10 minuti a temperatura ambiente nella cappa. Questo prodotto chimico reagisce con plastica; quindi, utilizzare pipette di vetro e non riempire completamente i pozzetti per evitare il contatto con la plastica piatto.
  6. Lavare i pozzetti con acqua ultrapura per circa 10 minuti fino a quando il 3 amminopropiltrimetossisilano diventa chiaro.
  7. Sciacquare i pozzetti con acqua ultrapura due volte con una bottiglia a spruzzo.
  8. Lavare i pozzetti con 2 ml di acqua ultrapura unt temperatura ambiente su un bilanciere fissato a una velocità media (~ 1 Hz) per 10 min.
  9. Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min.
  10. Trattare i pozzetti con 2 ml di soluzione di glutaraldeide allo 0,5% a temperatura ambiente su un bilanciere fissato a una velocità media (~ 1 Hz) per 30 min.
  11. Lavare i micropozzetti con 2 ml di acqua ultrapura a temperatura ambiente su un bilanciere funzionante a velocità media (~ 1 Hz) per 10 min. Ripetere altre due volte per un totale di 30 min.
  12. Pozzetti a secco con un angolo ripido (60 ° o superiore) per 30 minuti.
    Nota: I piatti possono essere conservati per 2 mesi in un essiccatore.

2. Preparazione del PAA per Invadopodi saggi

  1. Per una soluzione del PAA molle (8% acrilammide e 0,05% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 25 ml di 2% BIS, e 574 ml di acqua ultrapura (Tabella 1).
  2. Per una soluzione del PAA disco (8% acrilammide e 0,35% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 175 e #181; l del 2% BIS, e 409 ml di acqua ultrapura (Tabella 1).
  3. Per una soluzione del PAA rigida (12% acrilammide e 0,60% BRI) 1 ml, 300 ml di combinare 40% acrilammide, 300 ml di 2% BIS, e 169 ml di acqua ultrapura (Tabella 1).
  4. Degassare le soluzioni per 15 min. Aggiungere 200, 215, e 230 ml di 1 mg / ml di fibronectina plasma umano in acqua ultrapura alle molli, duri, rigidi e soluzioni di PAA, rispettivamente. Per tutte le soluzioni, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml di acido acrilico N-idrossisuccinimmide (NHS) estere, 5 microlitri di 100 mg / ml, persolfato di ammonio e 2 ml di N, N, N ', N'-tetrametiletilendiammina (TEMED Tabella 1). Mescolare con dolce pipettaggio e evitare di creare bolle in soluzioni.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(Ml) 		2%
BIS
(Ml) 		Ultrapure
Acqua
(Ml) 		1 mg / ml
FN
(Ml) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Ml) 		100 mg / ml
APS
(Ml)
TEMED
(Ml) 		Elastico
Modulo
(Pa)
Morbido 200 25 574 200 1 5 2 1023
Duro 200 175 409 215 1 5 2 7307
Rigido 300 300 169 230 1 5 2 22692

Tabella 1: Ingrediente voluMES e conseguente moduli elastici per ZAP morbide, dure e rigide utilizzati nei test Invadopodi. AA = acrilamide, FN = fibronectina, APS = persolfato di ammonio.

  1. Pipettare 8,48 ml di soluzione di PAA al centro di ciascun pozzetto.
    Nota: Questo volume produce teoricamente PAA di 75 micron di spessore.
  2. Abbassare delicatamente il lato fiammato del vetrino 12 mm appoggiata al droplet del micropozzetto con una pinzetta.
  3. Lasciare che la soluzione PAA sandwich per polimerizzare per 15-30 min. Verificare polimerizzazione controllando la soluzione rimanente.
  4. Aggiungere 2 ml di PBS 1x per ogni piatto e rimuovere i 12 millimetri coprioggetto con una pinzetta.
    Nota: 10x PBS viene effettuata in laboratorio e composto da 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M di NaCl, e 0,056 M Na 2 HPO 4.
  5. Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.

3. Priparazione del PAA per forza trazione saggi

  1. Per una soluzione del PAA molle (8% acrilammide e 0,05% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 25 ml di 2% BIS, e 566 ml di acqua ultrapura (Tabella 2).
  2. Per una soluzione del PAA disco (8% acrilammide e 0,35% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 175 ml di 2% BIS, e 401 ml di acqua ultrapura (Tabella 2).
  3. Per una soluzione del PAA rigida (12% acrilammide e 0,60% BRI) 1 ml, 300 ml di combinare 40% acrilammide, 300 ml di 2% BIS, e 161 ml di acqua ultrapura (Tabella 2).
  4. Degassare le soluzioni per 15 min. Aggiungere 200, 215, e 230 ml di 1 mg / ml di fibronectina plasma umano ai morbidi, duri, rigidi e soluzioni di PAA, rispettivamente. Sonicare 8 ml di 200 nm microsfere rosse fluorescenti (eccitazione / emissione di 580/605 nm) per 30 sec. Per ogni soluzione, aggiungere 8 ml di 200 microsfere fluorescenti rossi nm,1 ml di 10 mg / ml di acido acrilico estere NHS, 5 microlitri di 100 mg / persolfato di ammonio ml e 2 microlitri di TEMED (Tabella 2). Mescolare con dolce pipettaggio e evitare di creare bolle in soluzioni.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(Ml) 		2%
BIS
(Ml) 		Ultrapure
Acqua
(Ml) 		1 mg / ml
FN
(Ml)
Microsfere
(Ml) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Ml) 		100 mg / ml
APS
(Ml)
TEMED
(Ml) 		Elastico
Modulo
(Pa)
Morbido 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Duro 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Rigido 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Tabella 2:. Volumi ingrediente e conseguente moduli elastici per ZAP morbide, dure e rigide utilizzati nei test di forza di trazione AA = acrilamide, FN = fibronectina, APS = persolfato di ammonio.

  1. Pipettare 8,48 ml di soluzione di PAA al centro di ciascun pozzetto.
    Nota: Questo volume produce teoricamente PAA di 75 micron di spessore.
  2. Abbassare delicatamente il lato fiammata di the 12 millimetri coprioggetto al droplet del micropozzetto con una pinzetta.
  3. Lasciare che la soluzione PAA sandwich per polimerizzare per 15-30 min. Verificare polimerizzazione controllando soluzione rimanente.
  4. Aggiungere 2 ml di PBS 1x per ogni piatto e rimuovere i 12 millimetri coprioggetto con una pinzetta.
  5. Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.

4. Preparazione di ECM per Invadopodi saggi

  1. Riscaldare la soluzione di gelatina (1% gelatina e 1% di saccarosio) a 37 ° C.
  2. Trattare le PAA con 150 microlitri della soluzione di gelatina per 1 min poi accuratamente aspirato dal fondo dei pozzetti quando si tiene i piatti fondo di vetro con un angolo di 45 °.
  3. Essiccare il sottile strato residuo di gelatina sulle PAA ai pozzetti con un angolo ripido (60 ° o maggiore) per ottimizzare l'essiccazione per 60 min.
  4. Trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di glutaraldeide allo 0,5% in refrigerate iCe per 15 minuti seguita da temperatura ambiente per 30 min.
  5. Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
  6. Trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di boroidruro di sodio per 1 min. Battere delicatamente piatti sul banco per rimuovere le bolle che si formano sulla superficie della gelatina.
  7. Aspirare e lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
  8. Diluire una soluzione fibronectina plasma umano marcato con FITC a 50 pg / ml con PBS 1x e centrifugare a 175.000 xg a 4 ° C per 15 min. O acquistare in commercio fibronectina etichettati o etichettarlo come segue:
    1. Disciogliere 5 mg di fibronectina in 10 ml di tampone borato (170 mM di sodio tetraidrato metaborato e 40 mM NaCl) e posto in tubi di dialisi.
    2. Etichetta la fibronectina posizionando il tubo in 200 ml di tampone borato contenente 6 mg di FITC disciolto a temperatura ambiente su un agitatore magneticoimpostare al minimo per 1,5 ore al buio.
    3. Dializzare con 500 ml di PBS 1x su un agitatore magnetico impostato al minimo per 3 giorni in una stanza buia fredda (4 ° C) con due volumi cambia un giorno.
    4. Concentrazione fibronectina Calcolare FITC-marcato sulla base della densità ottica di aliquote diluito (1: 200) a 280 nm e 493 nm come [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 volte il fattore di diluizione di 200 volte 2 (che rappresenta per il glicerolo concentrare la fibronectina nel passaggio successivo) conseguente unità mg / ml.
    5. Dializzare notte in una soluzione di glicerolo al 50% su un agitatore magnetico impostato al minimo durante la notte in una camera fredda buio a 4 ° C.)
  9. Trattare i pozzetti con 150 microlitri della soluzione di fibronectina FITC-marcato a temperatura ambiente per 60 minuti al buio.
  10. Aspirare accuratamente la soluzione fibronectina coniugati con fluoresceina dal fondo dei pozzetti quando si tiene i piatti fondo di vetro aun angolo di 45 ° e quindi riempire il vetro piatti inferiori con soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente per 10 min in una cappa di coltura cellulare scuro per la sterilizzazione. Anche riempire vetro fondo coperchi piatto o pulire con panni imbevuti lint bassi nel 70% di etanolo.
  11. Lavare i piatti fondo di vetro da riempire con 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte con 2 ml di PBS 1x per un totale di 15 min.

5. Preparazione e Imaging di Invadopodi Assays

  1. Aggiungere 25.000 cellule tumorali in 2 ml di terreno Invadopodi (1: 1 DMEM e RPMI 1640 con 5% di siero a basso contenuto proteico, siero bovino fetale al 10%, e 20 ng / ml di fresco aggiunto del fattore di crescita epidermico) ai piatti fondo di vetro e incubare una notte.
  2. Aspirare e trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di paraformaldeide 3,7% a temperatura ambiente al buio per 20 minuti per fissare le cellule.
  3. Dopo due lavaggi rapidi con 2 ml di 1x PBS, trattare i pozzetti con 2 ml di Triton X-100 soluzione 0,1% a camera temperatura al buio per 5 min a permeabilize cellule.
  4. Dopo un lavaggio rapido con 2 ml di 1x PBS, trattare i pozzetti con 3% di albumina sierica bovina soluzione bloccante a temperatura ambiente al buio per 60 minuti per bloccare le cellule.
  5. Incubare le micropozzetti con 150 ml di anticorpo anti-topo cortactin (1: 750) in soluzione a temperatura ambiente al buio blocco per 60 min.
  6. Lavare pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
  7. Incubare i pozzetti con 150 ml di capra anti-topo 633 anticorpi (1: 500) e 546 falloidina (1: 750) in soluzione a temperatura ambiente al buio blocco per 60 min.
  8. Lavare pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
  9. Aggiungere sei gocce di mezzo di montaggio per riempire ogni micropozzetto e coprire con 22 x 22 lamelle.
  10. Immagine cortactin e actina per identificare Invadopodi con eccitazione e di emissione filtri di 632/647 nm e556/570 nm, rispettivamente, con un obiettivo ad immersione in olio ad alta NA, 40X su un ampio campo di microscopio invertito. Analogamente, immagine fibronectina identificare degrado ECM utilizzando un filtro di eccitazione ed emissione di 492/518 nm.

6. Preparazione e Imaging di forza trazione Assays

  1. Aggiungere 15.000 cellule tumorali in 2 ml di terreno Invadopodi ai piatti fondo di vetro e incubare durante la notte.
  2. Aspirare media nei piatti fondo di vetro e sostituire con 2 ml di mezzo L-15, con le stesse integratori (siero ipoproteica 5%, siero bovino fetale al 10%, e 20 ng / ml di fresco aggiunto del fattore di crescita epidermico), pre -warmed a 37 ° C.
  3. Incubare i piatti inferiori vetro in una camera ambientale su un microscopio invertito pre-equilibrati a 37 ° C con umidità elevata per 1 ora.
  4. Prendere quattro serie di immagini con un elevato NA, 40X obiettivo su un microscopio a grande campo invertito, con una fase automatizzata per marcare posizioni cellulari:
    1. Celle di immagine su dip dei PAA con contrasto di fase (immagine "fase").
    2. Microsfere fluorescenti immagine utilizzando filtri di eccitazione ed emissione di 560/645 nm concentrandosi leggermente sotto le celle fino al primo strato di microsfere nella parte superiore del PAA è a fuoco (immagine "sottolineato").
    3. In aggiunta, si concentrano al fondo del PAA (utilizzando le microsfere come marcatori) e prendere una immagine (un'immagine "bottom"). Nota: Lo scopo di questa immagine è di registrare la z-posizione per ottenere lo spessore effettivo PAA in ciascuna posizione per i calcoli forza di trazione come descritto in Risultati rappresentativi.
    4. Dopo queste immagini sono state acquisite a più posizioni, mescolare delicatamente in 220 ml di soluzione al 10% Triton-X per rimuovere le cellule. Microsfere fotografia in cima ZAP in ciascuna posizione come precedentemente descritto (immagine "nullo").

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Risultati

Nel saggio Invadopodi, Invadopodi sono in genere identificato da colocalizzazione di marcatori come actina e cortactin a strutture puntiformi all'interno del corpo cellulare (Figura 1). Sia attivamente degradante e non degradanti Invadopodi può essere contato e si differenziano per se queste strutture sono colocalized con aree nere prive segnale fluorescente nella fibronectina coniugati con fluoresceina (Figura 1). Invadopodi vengono contati manualmente, e la degradazione ECM per ce...

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Discussione

Vi presentiamo un metodo per la fabbricazione di PAA che possono essere utilizzati come base per Invadopodi e forza di trazione saggi di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili. Mentre CPA sono stati a lungo utilizzati per osservare gli effetti sulle cellule rigidità e calcolare le forze di trazione 18,24,27, questo protocollo è il primo a sviluppare test paralleli basati su CPA con le stesse rigidità di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili in risposta alla matrice pro...

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Dichiarazioni

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health in premio Numero K25CA143412 (Parekh). Vorremmo riconoscere che un ulteriore sostegno è stato fornito dal Dipartimento di Otorinolaringoiatria. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Ringraziamenti

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-AminopropiltrimetossisilanoSigma-Aldrich281778
Acrilammide (40%)Bio-Rad161-0140
Acido acrilico Estere NHSSigma-AldrichA8060preparare fresco in cappa aspirante 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 falloidinaLife TechnologiesA22283può anche utilizzare rodamina
ammonio persolfatoBio-Rad161-0700preparare una soluzione fresca al 10% in 1x PBS
Aqua Poly/MountPolysciences18606utilizzare 6 gocce per riempire i micropozzetti
BIS (2%)Bio-Rad161-0142
Albumina sierica bovinaRPIA30075fare il 3% per la soluzione bloccante in 1x PBS e conservare in 4 ° C
Vetrini coprioggetti (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
tubo per dialisiSigma-AldrichD9777pre-equilibrato in tampone borato per 15 - 30 min
DMEMCellgro10-013-CVuso per fare invadopodia medio
DMSOSigma-AldrichD8418uso per fare acido acrilico NHS soluzione estere
Fattore di crescitaepidermico Vita TecnologiePHG0311utilizzare per rendere il mezzo di invadopodia
EtanoloPHARMCO-AAPERE200diluito con acqua ultrapura al 70%
FBSThermo ScientificSH30070.03utilizzare per rendere il mezzo di invadopodia
FITCSigma-AldrichF7250proteggere dalla luce
GelatinaPolysciences00639in genere preparare 10 ml di soluzione di saccarosio all'1% e gelatina all'1% in PBS e conservare a 4 gradi C (preriscaldare il PBS per sciogliere facilmente la gelatina)
Piatti con fondo in vetro (vetrini da 35 mm)I vetrini coprioggettiMatTekP35G-0-14-C
glutaraldeide non rivestita (25%)Polysciences01909diluire con 1x PBS allo 0,5%Anticorpo
anti-topo di capra Alexa Fluor 633 LifeTechnologiesA21050
Fibronectina plasmatica umanaLife Technologies33016-015aggiungere 5 ml di acqua ultrapura per ottenere 1 mg/ml; aliquotare in volumi in base all'uso per evitare eccessivi cicli di congelamento e scongelamento
KH2PO4EMD MilliporePX-1565-1utilizzare per produrre 10 stock di PBS
Anticorpo anti-cortactina 4F11 di topoEMD Millipore05-180
Na2HPO4EMD MilliporeSX-0720-1utilizzare per produrre 10 stock di PBS
NaClRPIS23020utilizzare per produrre 10 tamponi stock PBS e borato
NaOH (1 N)Sigma-AldrichS2770diluire con acqua ultrapura a 0,1 N
Nu-Serum (siero a basso contenuto proteico)BD Biosciences355500utilizzare per rendere invadopodia medio
ParaformaldeideAcros416785000in genere fare il 10% di stock in 1x PBS, preparare in cappa aspirante e aggiungere alcuni ml di NaOH forte per sciogliere facilmente la paraformaldeide, quindi riportare a pH 7,4 con forte HCl)
PBS (sterile)Cellgro21-040-CVutilizzare per colture cellulari
RPMI 1640Cellgro10-040-CVutilizzare per rendere invadopodia medio
Boroidruro di sodioSigma-Aldrich452882preparare fresco in cappa aspirante 1 mg/ml in 1x PBS
Il metaborato di sodio tetraidratoSigma-AldrichS0251utilizza per fare il tampone borato
SaccarosioRPIS24060in genere produce 10 ml di soluzione di saccarosio all'1% / gelatina all'1% in PBS e conserva a 4 ° C (preriscaldare il PBS per sciogliere facilmente la gelatina)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa AesarA16046produce il 10% di stock in 1x PBS e utilizzare così com'è per la rimozione delle cellule nel saggio della forza di trazione o diluire con 1x PBS per la colorazione
sono

Riferimenti

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