Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.
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Articolo metodologico
Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tessuti tumorali rigidi sono stati fortemente implicati nella regolazione della migrazione delle cellule del cancro e l'invasione. Migrazione invasiva attraverso i tessuti reticolati è facilitato da sporgenze ricchi di actina chiamati Invadopodi che proteoliticamente degradano la matrice extracellulare (ECM). Attività Invadopodi ha dimostrato di essere dipendente da rigidità ECM e il cancro delle cellule contrattili forze che suggeriscono che i segnali di rigidità possono regolare queste strutture subcellulari attraverso actomiosina contrattilità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Mentre esistono delle differenze tra i due test, il protocollo qui presentata fornisce un metodo per la creazione di PAA thin può essere utilizzato in entrambi i test e sono facilmente adattabili alle esigenze biologiche e tecniche specifiche dell'utente.
Introduzione
La rigidità del ECM associati al tumore è stato identificato come un fattore significativo nel determinare comportamenti maligni aumentando actomiosina contrattilità 1-3. Anche se questo effetto è stato dimostrato soprattutto con le cellule del cancro al seno, la rigidità matrice è stato trovato per modificare le proprietà invasive di cellule derivate da una varietà di tumori 4-8 che suggeriscono che la rigidità del tumore può svolgere un ruolo in altri tipi di tumori. Per penetrare i tessuti reticolati durante la migrazione invasivo, le cellule tumorali utilizzano sporgenze adesive ricche di actina conosciuti come Invadopodi che localizzare pro....
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Protocollo
1. Preparazione di vetrini di vetro per PAA
- Pulire 12 millimetri coprioggetto con panni bassi lint.
- Flame i coprioggetti 12 mm e il coprioggetto 14 millimetri nel micropozzetto di ogni piatto di vetro fondo 35 millimetri facendoli passare attraverso una fiamma becco Bunsen con una pinzetta.
- Trattare i pozzetti con 200 ml di 0,1 N NaOH per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min.
- Trattare i pozzetti con 50-100 ml di 3-amminopropiltrimetossisilano per 10 minuti a temperatura ambiente nella cappa. Questo prodotto chimico reagisce con plastica; quindi, utilizzare pipette di vetro e non ri....
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Risultati
Nel saggio Invadopodi, Invadopodi sono in genere identificato da colocalizzazione di marcatori come actina e cortactin a strutture puntiformi all'interno del corpo cellulare (Figura 1). Sia attivamente degradante e non degradanti Invadopodi può essere contato e si differenziano per se queste strutture sono colocalized con aree nere prive segnale fluorescente nella fibronectina coniugati con fluoresceina (Figura 1). Invadopodi vengono contati manualmente, e la degradazione ECM per ce.......
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Discussione
Vi presentiamo un metodo per la fabbricazione di PAA che possono essere utilizzati come base per Invadopodi e forza di trazione saggi di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili. Mentre CPA sono stati a lungo utilizzati per osservare gli effetti sulle cellule rigidità e calcolare le forze di trazione 18,24,27, questo protocollo è il primo a sviluppare test paralleli basati su CPA con le stesse rigidità di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili in risposta alla matrice pro.......
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Dichiarazioni
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health in premio Numero K25CA143412 (Parekh). Vorremmo riconoscere che un ulteriore sostegno è stato fornito dal Dipartimento di Otorinolaringoiatria. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropiltrimetossisilano | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrilammide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acido acrilico Estere NHS | Sigma-Aldrich | A8060 | preparare fresco in cappa aspirante 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 falloidina | Life Technologies | A22283 | può anche utilizzare rodamina |
| ammonio persolfato | Bio-Rad | 161-0700 | preparare una soluzione fresca al 10% in 1x PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | utilizzare 6 gocce per riempire i micropozzetti |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Albumina sierica bovina | RPI | A30075 | fare il 3% per la soluzione bloccante in 1x PBS e conservare in 4 ° C |
| Vetrini coprioggetti (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| tubo per dialisi | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrato in tampone borato per 15 - 30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | uso per fare invadopodia medio |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | uso per fare acido acrilico NHS soluzione estere |
| Fattore di crescita | epidermico Vita Tecnologie | PHG0311 | utilizzare per rendere il mezzo di invadopodia |
| Etanolo | PHARMCO-AAPER | E200 | diluito con acqua ultrapura al 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | utilizzare per rendere il mezzo di invadopodia |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | proteggere dalla luce |
| Gelatina | Polysciences | 00639 | in genere preparare 10 ml di soluzione di saccarosio all'1% e gelatina all'1% in PBS e conservare a 4 gradi C (preriscaldare il PBS per sciogliere facilmente la gelatina) |
| Piatti con fondo in vetro (vetrini da 35 mm) | I vetrini coprioggetti | MatTek | P35G-0-14-C |
| glutaraldeide non rivestita (25%) | Polysciences | 01909 | diluire con 1x PBS allo 0,5%Anticorpo |
| anti-topo di capra Alexa Fluor 633 Life | Technologies | A21050 | |
| Fibronectina plasmatica umana | Life Technologies | 33016-015 | aggiungere 5 ml di acqua ultrapura per ottenere 1 mg/ml; aliquotare in volumi in base all'uso per evitare eccessivi cicli di congelamento e scongelamento |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | utilizzare per produrre 10 stock di PBS |
| Anticorpo anti-cortactina 4F11 di topo | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | utilizzare per produrre 10 stock di PBS |
| NaCl | RPI | S23020 | utilizzare per produrre 10 tamponi stock PBS e borato |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | diluire con acqua ultrapura a 0,1 N |
| Nu-Serum (siero a basso contenuto proteico) | BD Biosciences | 355500 | utilizzare per rendere invadopodia medio |
| Paraformaldeide | Acros | 416785000 | in genere fare il 10% di stock in 1x PBS, preparare in cappa aspirante e aggiungere alcuni ml di NaOH forte per sciogliere facilmente la paraformaldeide, quindi riportare a pH 7,4 con forte HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | utilizzare per colture cellulari |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | utilizzare per rendere invadopodia medio |
| Boroidruro di sodio | Sigma-Aldrich | 452882 | preparare fresco in cappa aspirante 1 mg/ml in 1x PBS |
| Il metaborato di sodio tetraidrato | Sigma-Aldrich | S0251 | utilizza per fare il tampone borato |
| Saccarosio | RPI | S24060 | in genere produce 10 ml di soluzione di saccarosio all'1% / gelatina all'1% in PBS e conserva a 4 ° C (preriscaldare il PBS per sciogliere facilmente la gelatina) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | produce il 10% di stock in 1x PBS e utilizzare così com'è per la rimozione delle cellule nel saggio della forza di trazione o diluire con 1x PBS per la colorazione |
Riferimenti
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M.
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Ristampe e permessi
