Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Sommario

Qui presentiamo un metodo economico per definire le interazioni chimico-genetiche nel lievito in gemmazione. L'approccio si basa su tecniche fondamentali nella biologia molecolare del lievito ed è adatto per l'interrogazione meccanicistica di piccole e medie collezioni di sostanze chimiche e altri ambienti multimediali.

Abstract

Determinare la modalità di azione delle sostanze chimiche bioattive è di interesse per una vasta gamma di accademici, farmaceutico, e gli scienziati industriali. Saccharomyces cerevisiae, o lievito in erba, è un modello eucariote che una collezione completa di ~ 6.000 mutanti di delezione genica e hypomorphic gene essenziale mutanti sono disponibili in commercio. Queste collezioni di mutanti possono essere utilizzati per rilevare sistematicamente interazioni chimico-gene, cioè geni necessari a tollerare una sostanza chimica. Queste informazioni, a sua volta, riporta sulla modalità probabile di azione del composto. Qui si descrive un protocollo per la rapida identificazione di interazioni chimiche-genetico in erba lievito. Noi dimostriamo il metodo utilizzando l'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU), che ha un meccanismo ben definito di azione. I nostri risultati mostrano che il vagabondo nucleare rna exosome e riparazione del DNA enzimi sono necessari per la proliferazione in presenza di 5-FU, che è coerente con le precedenti microarray approcci basati su codice a barre chimico genetiche e le conoscenze che il 5-FU influisce negativamente sia il metabolismo RNA e DNA. Sono descritti anche i protocolli di validazione richieste di questi schermi ad alto rendimento.

Introduzione

Gli strumenti e le risorse disponibili nel organismo modello Saccharomyces cerevisiae genetici hanno permesso grandi studi di genomica funzionale che forniscono insieme nuovi indizi su come i geni funzionano come reti per soddisfare i requisiti dei sistemi biologici. La pietra angolare di questi strumenti è stata la creazione collaborativa di un set completo di delezioni geniche non essenziali di tutte le fasi di lettura aperte nel lievito ^1,2. Un'osservazione sorprendente è che solo il ~ 20% dei geni di lievito sono necessari per la vitalità quando cresciuto come aploidi in condizioni standard di laboratorio. Ciò evidenzia la capacità di una ....

Protocollo

NOTA: Il flusso generale di questa procedura è illustrata nella figura 2.

1. Determinazione della Dose Growth-inibitorio

1. Preparazione del lievito cultura durante la notte
   NOTA: I media la crescita del lievito estratto-peptone-destrosio (YEPD) utilizzato in questo protocollo è una ricetta standard ^13.
   1. Streak out BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) le cellule su un piatto agar YEPD e incubare per 48 ore a 30 ° C o fino a formare colonie visibili.
   2. Preparare culture durante la notte inoculando 5 ml di YEPD mezzi liquidi in un recipiente di coltura sterile con un....

Risultati

Come una convalida di questo approccio abbiamo effettuato un rappresentante chimica schermo interazione genetica dell'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU) seguendo il protocollo descritto sopra. 5-FU si caratterizza per interrompere timidilato sintasi così come DNA e RNA metabolismo ^18. Le interazioni genetiche chimiche su 5-FU sono ben studiati e sono stati studiati con tecniche di lievito barcode microarray utilizzando collezioni cancellazione eterozigoti e omozigoti ^8,19. Qui mostria.......

Discussione

Delineato qui è un approccio per la generazione di profili di interazione chimico-genetico. Il metodo è semplice: confrontando le dimensioni delle colonie di ciascun ceppo in complete collezioni delezione genica in presenza e in assenza di una sostanza chimica, tutti i geni necessari per tollerare un insulto chimica sono identificati. Analisi annotazione arricchimento della lista risultante dei ceppi sensibili può quindi essere utilizzato per fornire una visione in una modalità di azione chimica. Mentre questo protocoll.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Estratto di lievito	BioBasic	G0961	Per terreni liquidi/solidi YEPD aggiungere alla concentrazione finale dell'1% (p/v)
Polvere di tyrptone	BD Biosciences	211820	Per terreni liquidi/solidi YEPD aggiungere alla concentrazione finale del 2% (p/v)
Destrosio	Anachemia	31096-380	Per i mezzi liquidi/solidi YEPD aggiungere al 2% di concentrazione finale (p/v) — Non sterilizzare in autoclave. Preparare la soluzione madre al 20%, filtrare e sterilizzare e aggiungere al terreno dopo la sterilizzazione in autoclave.
Agar A	Bio Basic	FB0010	Per YEPD solidi aggiungere al 2% di concentrazione finale (p/v)G418
	A.G. Scientific Inc.	G-1033	Prepara 1.000 stock a 200  mg/ml in dH2O e filtro sterilizzare.
piastra a 12 pozzetti	Greiner Bio One	655180
provette per coltura da 5 ml	Evergreen Scientific	222-2376-080
piastra Petri da 10 cm	VWR	25384-302
ROTOR HDA	Singer Instruments	ROT-001	robot di spillatura per array microbici ad alta produttività
PLUSPLATE© Petri Dish	Singer Strumenti	PLU-001	Scatola da 200 piatti
384 RePad a perno corto	Strumenti Singer	RP-MP-384	Scatola da 1.000 pad
1536 RePad a pin corto	Strumenti Singer	RP-MP-1536	Scatola da 1.000 pastiglie
Strumenti di spillatura alternativi:
Sistemi Robtic completamente automatizzati	S& P robotics	http://www.sprobotics.com	Sono disponibili diversi sistemi robitici e di imaging automatizzati per la gestione delle colonie.
Strumenti di bloccaggio manuale	V& P Scientific	http://www.vp-scientific.com	Strumenti e accessori per la replica portatile.