Articolo metodologico

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in

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DOI:

10.3791/52345

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5 aprile 2015

 , 
1Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un metodo economico per definire le interazioni chimico-genetiche nel lievito in gemmazione. L'approccio si basa su tecniche fondamentali nella biologia molecolare del lievito ed è adatto per l'interrogazione meccanicistica di piccole e medie collezioni di sostanze chimiche e altri ambienti multimediali.

Abstract

Determinare la modalità di azione delle sostanze chimiche bioattive è di interesse per una vasta gamma di accademici, farmaceutico, e gli scienziati industriali. Saccharomyces cerevisiae, o lievito in erba, è un modello eucariote che una collezione completa di ~ 6.000 mutanti di delezione genica e hypomorphic gene essenziale mutanti sono disponibili in commercio. Queste collezioni di mutanti possono essere utilizzati per rilevare sistematicamente interazioni chimico-gene, cioè geni necessari a tollerare una sostanza chimica. Queste informazioni, a sua volta, riporta sulla modalità probabile di azione del composto. Qui si descrive un protocollo per la rapida identificazione di interazioni chimiche-genetico in erba lievito. Noi dimostriamo il metodo utilizzando l'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU), che ha un meccanismo ben definito di azione. I nostri risultati mostrano che il vagabondo nucleare rna exosome e riparazione del DNA enzimi sono necessari per la proliferazione in presenza di 5-FU, che è coerente con le precedenti microarray approcci basati su codice a barre chimico genetiche e le conoscenze che il 5-FU influisce negativamente sia il metabolismo RNA e DNA. Sono descritti anche i protocolli di validazione richieste di questi schermi ad alto rendimento.

Introduzione

Gli strumenti e le risorse disponibili nel organismo modello Saccharomyces cerevisiae genetici hanno permesso grandi studi di genomica funzionale che forniscono insieme nuovi indizi su come i geni funzionano come reti per soddisfare i requisiti dei sistemi biologici. La pietra angolare di questi strumenti è stata la creazione collaborativa di un set completo di delezioni geniche non essenziali di tutte le fasi di lettura aperte nel lievito 1,2. Un'osservazione sorprendente è che solo il ~ 20% dei geni di lievito sono necessari per la vitalità quando cresciuto come aploidi in condizioni standard di laboratorio. Ciò evidenzia la capacità di una cellula per tamponare contro perturbazioni genomiche attraverso l'utilizzo di percorsi biologici alternativi. Mutanti genetici che sono vitali singolarmente, ma letali in combinazione, segnalano percorsi biologici paralleli collegati o convergenti e formano reti di interazione genetica che descrivono la funzione biologica. Con lo sviluppo di te condizionalealleli mperature-sensibili e hypomorphic di geni essenziali della tecnologia non è stato limitato allo studio di geni non essenziali 3,4. Questo concetto è stato applicato su scala genomica produce un imparziale mappa interazione genetica che illustra come i geni coinvolti in processi cellulari simili raggruppano 5.

Perturbazioni chimiche di reti genetiche delezioni geniche mimici (Figura 1) 6. Interrogazione composti inibitori della crescita contro una matrice ad alta densità di ceppi di eliminazione per ipersensibilità identifica un profilo di interazione chimico-genetico, cioè una lista di geni che è richiesto di tollerare lo stress chimico. Come interazioni genetiche, schermi di grandi dimensioni di librerie chimiche hanno dimostrato che i composti con una modalità d'azione simile grappolo insieme 7. Pertanto, stabilendo il profilo interazione chimica-genetica di un composto della modalità di azione può dedurre confrontandola con larinterazione genetica e chimica sintetica ge scala genetica Dataset 8,9.

Schermi chimico-genetico su larga scala, in cui vengono interrogati decine di composti, sono stati eseguiti da saggi concorrenza barcode. In questo approccio, la raccolta aggregata dei ceppi di delezione è coltivato in massa per diverse generazioni in un piccolo volume di supporti contenenti una sostanza chimica. Dal momento che ogni mutante eliminazione nasconde un codice a barre genetico unico, la redditività / crescita dei singoli mutanti nel pool di ceppi cancellazione è monitorata da microarray o high-throughput sequencing 10.

La presunzione di idoneità monitorando dimensioni colonia di mutanti fisicamente Arrayed coltivate su agar solido contenente un composto bioattivo è anche un metodo efficace per identificare interazioni chimiche-genetica 11,12. Questo approccio offre un'alternativa conveniente per lo screening basato sulla concorrenza ed è adatto per saggiare le piccole librerie di sostanze chimiche.Delineato qui è una semplice metodologia per la produzione di un elenco di interazioni chimico-genetico in S. cerevisiae che non si basa su manipolazioni biologia molecolare o infrastrutture. Si richiede solo una collezione di eliminazione di lievito, un apparato pinning robotizzato o manuale, e liberamente disponibili software di analisi dell'immagine.

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Protocollo

NOTA: Il flusso generale di questa procedura è illustrata nella figura 2.

1. Determinazione della Dose Growth-inibitorio

  1. Preparazione del lievito cultura durante la notte
    NOTA: I media la crescita del lievito estratto-peptone-destrosio (YEPD) utilizzato in questo protocollo è una ricetta standard 13.
    1. Streak out BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) le cellule su un piatto agar YEPD e incubare per 48 ore a 30 ° C o fino a formare colonie visibili.
    2. Preparare culture durante la notte inoculando 5 ml di YEPD mezzi liquidi in un recipiente di coltura sterile con una singola colonia. Incubare una notte a 30 ° C con rotazione continua o agitazione. La cultura tipicamente raggiungere la saturazione del mattino (~ 2 × 10 8 cellule / ml).
  2. Preparazione agar solido contenente vari dosaggi chimici
    1. Preparare alcuni stock diil prodotto chimico da testare a 100x la concentrazione finale desiderata in un solvente appropriato.
      NOTA: Le concentrazioni efficaci dipendono dalla chimica, e devono essere determinati empiricamente. Si consiglia pertanto di verificare inizialmente un'ampia gamma concentrazione finale, vale a dire, dal basso all'alto mM mM.
    2. Per ciascuna concentrazione della sostanza chimica da testare, un'aliquota 3 ml di agar fuso YEPD ad un vari provetta sterile. Luogo in 55 ° C bagnomaria per evitare di solidificazione.
    3. Per ogni concentrazione di sostanza chimica da testare aggiungere 30 ml di composto 100x ai media fusi, vortice 2-3 secondi per mescolare, e pipetta 1 ml in ogni coppia di pozzetti duplicati in un 12-pozzetti. Assicurati di includere un solo veicolo di controllo. Lasciare piastre di impostare notte a temperatura ambiente. Eliminare qualsiasi supporto aggiuntivo.
  3. Cellule spread placcatura
    1. Seminare 10 ml di YEPD mezzi liquidi con 2 ml di una cultura lievito saturo, coltivate durante la notte, come nella fase 1.1.2.
    2. Piatto 25 ml di cultura lievito diluito per pozzetto, distribuiti in modo uniforme con perline di vetro sterili o asta, e permettono la piastra si asciughi sotto una fiamma. Incubare la piastra a 30 ° C per 48 ore.
    3. Valutare la crescita del lievito (sia numero totale e la dimensione delle colonie) sulle piastre. Selezionare una concentrazione sub-letale di composto che non inibisce la crescita di oltre l'10% -15% per eseguire lo schermo.

2. sistematica schermo chimica genetica

  1. Manutenzione di delezione-mutante-array (DMA) e preparazione della Sorgente Piastra
    1. Per una descrizione dettagliata sulla costruzione di matrici mutanti cancellazione dalle scorte glicerolo consultare Baryshnikova et al. 14. Una volta mutanti di delezione sono schierati con una densità di 384 colonie per piastra, il DMA può essere conservato per parecchi mesi a 4 ° C. Replica su agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418, se necessario, per evitare le colonie di crescere in ognialtro.
      NOTA: Multiple repliche di serie dovrebbero essere evitati per prevenire la perdita dei ceppi a crescita lenta e ridurre al minimo la comparsa di mutanti soppressori. Ciò è particolarmente importante se il mantenimento delle collezioni come aploidi.
    2. Eseguire il replica-placcatura usando un microbica arraying sistema robotico. In alternativa, manipolare le colonie usando strumenti pinning manuali schierati.
      NOTA: La collezione cancellazione lievito è disponibile come aploidi e diploidi da diverse fonti commerciali e in genere viene fornito come scorte glicerolo in piastre da 96 pozzetti.
  2. Condensazione la matrice delezione mutante
    1. Preparare 250 ml di agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418. La concentrazione effettiva dei G418 può variare e ciascuna partita deve essere testato empiricamente.
    2. Preparare cinque piastre di agar YEPD versando 50 ml di agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418 per piastra. Fare questo un giorno prima condensazione matrice e consentono le piastre raffreddare a temperatura ambienteerature durante la notte su una superficie piatta.
      NOTA: Quattro piastre saranno necessari per la raccolta a densità 1.536-deformazione, il quinto piatto viene versato come un extra.
    3. Rimuovere le 16 piastre Petri contenenti raccolta delezione mutante con una densità di 384 colonie per piastra e lasciare riposare a temperatura ambiente (~ 1 ora).
    4. Asciugare la condensa che si è formata sul coperchio di ogni piatto con un compito delicato pulire. In caso contrario si può causare gocce d'acqua depositato sulla matrice e la contaminazione incrociata dei mutanti schierati.
    5. Utilizzando una matrice pinning robot microbica, condensare il DMA da una densità di 384 colonie per piastra (16 piatti Petri) a 1.536 colonie per piastra (4 piatti Petri). Eseguire questo in modo che il 1 ° colonia dalla piastra 1 perni alla riga 1 colonna 1 della matrice condensata, il 1 ° colonia di piastra 2 alla riga 1, colonna 2, 1 ° colonia di piastra 3 alla riga 2 e colonna 1, e la colonia 1 ° piatto 4 a Row 2colonna 2.
    6. Incubare la matrice consolidato a 30 ° C per una notte.
    7. Esaminare la matrice di garantire il trasferimento uniforme delle colonie da lastre di origine. Ci saranno diverse posizioni vuote, appositamente incorporate nella matrice, che fungono da guida per garantire la DMA è stato condensato correttamente (Figura 4A).
      NOTA: Questi saranno i piatti di origine per la placcatura replica sul supporto contenente il composto in esame. Una piastra singola fonte può essere utilizzata per più pinnings. Anche molti robot avranno una funzione di compensazione, che garantirà un numero simile di lievito vengono trasferiti ogni volta.
  3. Piastra Replica matrice eliminazione mutante
    1. Preparare 700 ml di controllo (solo veicolo) e 700 ml di mezzi sperimentali (-chimici contenenti). Questo è sufficiente per l'esecuzione del test in triplice copia (12 piastre per condizione, più due extra).
    2. Versare 50 ml di YEPD agar contenenti test chimico o di controllo per piastra. Lasciare le piastre to raffreddare a temperatura ambiente per una notte su una superficie piatta.
    3. Utilizzando il robot piatto replica, inoculare il DMA su tre serie di piastre contenenti sostanze chimiche a concentrazione determinato sperimentalmente, così come tre set di piastre contenenti il ​​controllo del veicolo. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 24-48 ore.

3. piastrine e analisi dei dati

  1. Rimuovere le piastre da incubatore e permettere loro di venire a temperatura ambiente (~ 1 ora) prima di imaging. Questo consentirà di evitare la formazione di condensa, mentre l'imaging le piastre.
  2. Fosfori a 24 e 48 ore rimuovendo il coperchio e mettendo la faccia in giù su un letto piano dello scanner. Catturare immagini con una risoluzione di almeno 300 dpi. In alternativa, utilizzare una fotocamera digitale per catturare le immagini. Se così facendo, piatti segnaposto faccia in su uno sfondo scuro e rimuovere i coperchi di immagine.
    NOTA: Il formato del file e posizionamento delle piastre dipenderanno dal programma di quantificazione utilizzato.
  3. Eseguire la quantificazione e il confronto delle dimensioni della colonia di matrice utilizzando uno dei numerosi programmi open source, tra cui Balony 15, SGAtools 16, e ScreenMill 17.

4. Validazione di schermo

NOTA: In questa fase diverse eliminazioni di lievito mutanti segnerà come ipersensibili alla chimica di interesse. Queste interazioni chimiche-genetici devono essere convalidati prossimo in due modi. Innanzitutto l'identità di ceppi sensibili dovrebbe essere confermata mediante PCR. In secondo luogo, la sensibilità chimica deve essere segnato in modo indipendente. Per eseguire un breve protocollo per l'esecuzione di test avvistamento per convalidare ceppo ipersensibilità, una tecnica comune in lievito biologia.

  1. Streak out desiderato (ipersensibilità) mutanti della collezione eliminazione lievito su agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418. Incubare a 30 ° C fino formano colonie. Verificare il genotipo del ceppo mediante PCR diagnostico con primer secondoprotocollo del produttore.
  2. Seminare 5 ml del liquido YEPD per ogni ceppo e incubare una notte a 30 ° C con rotazione o agitazione.
  3. Misurare OD 600 e diluire ogni ceppo di OD 600 = 1 in dH sterile 2 O. Queste sono oggi le colture di lieviti normalizzati.
  4. Dispensare 100 l di normalizzato wild-type di lievito (BY4741) cultura e A1 di una piastra a 96 pozzetti. Dispensare 100 l di fino a sette ceppi supplementari per pozzi B1-H1.
  5. Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 90 ml di dH 2 O sterile per pozzi A2-H2 attraverso A6-H6. Infine, preparare una serie di diluizioni 1:10 di colture di lieviti normalizzati. Inizia in serie pipettando 10 ml di colonna 1, colonna 2, con una pipetta multicanale, e continuare attraverso la piastra a 96 pozzetti prima di aver effettuato sei diluizioni (ie, 10 0-10 -5).
  6. Trasferire 2-5 ml di colture di lievito diluito in una griglia con un multicanalepipetta su terreni solidi YEPD contenenti prodotti chimici e dei veicoli di controllo. Incubare le piastre a temperatura appropriata per 24-48 ore.
  7. Ispezionare le piastre e confrontare la sensibilità di selezionare mutanti ad agenti chimici (rispetto al BY4741 controllo). Fosfori a 24 e 48 ore come al punto 3.2.
    NOTA: Mentre l'identificazione di diversi ceppi ipersensibili con ontologie geniche correlate o funzioni presta fiducia alla validità dello schermo, la trasformazione di un ceppo delezione ipersensibile con un plasmide contenente una copia del gene wild-type è necessaria per stabilire formalmente che un gene cancellazione di interesse (e le mutazioni non nascosti secondo sito) provoca la sensibilità ai farmaci.

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Risultati

Come una convalida di questo approccio abbiamo effettuato un rappresentante chimica schermo interazione genetica dell'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU) seguendo il protocollo descritto sopra. 5-FU si caratterizza per interrompere timidilato sintasi così come DNA e RNA metabolismo 18. Le interazioni genetiche chimiche su 5-FU sono ben studiati e sono stati studiati con tecniche di lievito barcode microarray utilizzando collezioni cancellazione eterozigoti e omozigoti 8,19. Qui mostria...

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Discussione

Delineato qui è un approccio per la generazione di profili di interazione chimico-genetico. Il metodo è semplice: confrontando le dimensioni delle colonie di ciascun ceppo in complete collezioni delezione genica in presenza e in assenza di una sostanza chimica, tutti i geni necessari per tollerare un insulto chimica sono identificati. Analisi annotazione arricchimento della lista risultante dei ceppi sensibili può quindi essere utilizzato per fornire una visione in una modalità di azione chimica. Mentre questo protocoll...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

La ricerca in laboratorio CJN è sostenuto da sovvenzioni di funzionamento dal NSERC, la Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI), e la Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Estratto di lievitoBioBasicG0961Per terreni liquidi/solidi YEPD aggiungere alla concentrazione finale dell'1% (p/v)
Polvere di tyrptoneBD Biosciences211820Per terreni liquidi/solidi YEPD aggiungere alla concentrazione finale del 2% (p/v)
DestrosioAnachemia31096-380Per i mezzi liquidi/solidi YEPD aggiungere al 2% di concentrazione finale (p/v) — Non sterilizzare in autoclave. Preparare la soluzione madre al 20%, filtrare e sterilizzare e aggiungere al terreno dopo la sterilizzazione in autoclave.
Agar ABio BasicFB0010Per YEPD solidi aggiungere al 2% di concentrazione finale (p/v)G418
A.G. Scientific Inc.G-1033Prepara 1.000 stock a 200  mg/ml in dH2O e filtro sterilizzare.
piastra a 12 pozzettiGreiner Bio One655180
provette per coltura da 5 mlEvergreen Scientific222-2376-080
piastra Petri da 10 cmVWR25384-302
ROTOR HDASinger Instruments ROT-001robot di spillatura per array microbici ad alta produttività
PLUSPLATE© Petri DishSinger Strumenti PLU-001Scatola da 200 piatti
384 RePad a perno cortoStrumenti SingerRP-MP-384Scatola da 1.000 pad
1536 RePad a pin cortoStrumenti Singer RP-MP-1536Scatola da 1.000 pastiglie
Strumenti di spillatura alternativi:
Sistemi Robtic completamente automatizzatiS& P roboticshttp://www.sprobotics.comSono disponibili diversi sistemi robitici e di imaging automatizzati per la gestione delle colonie.
Strumenti di bloccaggio manualeV& P Scientifichttp://www.vp-scientific.comStrumenti e accessori per la replica portatile.

Riferimenti

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