Articolo metodologico

Metodi per valutare citotossicità e immunosoppressione di combustibile di tabacco preparati prodotti

DOI:

10.3791/52351

⸱

10 gennaio 2015

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

In questo articolo

Sommario

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Utilizzando saggi ottimizzati di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) ex vivo, abbiamo dimostrato che una preparazione di prodotti del tabacco combustibile sopprime marcatamente le citochine secrete intracellulari mediate dal recettore e la capacità citolitica delle PBMC effettrici. Questi saggi rapidi possono essere utili nella valutazione del prodotto e nella comprensione dei potenziali effetti a lungo termine dell'esposizione al tabacco.

Abstract

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Tra le altre modifiche fisiopatologiche, l'esposizione cronica al fumo di sigaretta provoca l'infiammazione e la soppressione immunitaria, che sono stati collegati a una maggiore suscettibilità dei fumatori a infezioni microbiche e di tumori. Ex vivo soppressione delle risposte immunitarie recettoriali nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) trattato con componenti del fumo è un approccio interessante per studiare i meccanismi e valutare i probabili effetti a lungo termine dell'esposizione ai prodotti del tabacco. Qui, abbiamo ottimizzato metodi per eseguire test ex vivo utilizzando PBMC stimolate da lipopolisaccaride batterico, una Toll-like receptor-4 ligando. Gli effetti di tutto a medio-fumo condizionata (WS-CM), una preparazione prodotto del tabacco combustibili (TPP), e la nicotina sono stati esaminati sulla secrezione di citochine e obiettivo l'uccisione delle cellule dai PBMC nelle ex vivo saggi. Abbiamo dimostrato che le citochine secrete IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 e citochine intracellulari IFN-47 ;, TNF-α, e MIP-1α sono stati soppressi in PBMC WS-CM-esposte. La funzione citolitica di PBMC effettrici, come determinato da un saggio di cellula bersaglio K562 uccidere è stato ridotto da esposizione a WS-CM; nicotina era minimamente efficace in questi test. In sintesi, vi presentiamo una serie di migliori test per valutare gli effetti delle centrali termiche nel ex vivo saggi, e questi metodi potrebbero essere facilmente adattato per testare gli altri prodotti di interesse.

Introduzione

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Un numero consistente di punti di conoscenza per gli effetti negativi per la salute del fumo di sigaretta cronica, tra cui malattie cardiovascolari (CVD), broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e il cancro 1,2. Il fumo di sigaretta cronica è stato conosciuto per causare infiammazione e la soppressione immunitaria, e queste alterazioni sono segnalati per contribuire ad un aumento del rischio di infezioni microbiche e cancro nei fumatori 3. In vitro e ex vivo le tecniche sono utili a chiarire le basi molecolari degli effetti fisiopatologici di fumo di sigaretta 4-9 (Tabella 1) e sono riconosciuti come importanti strumenti per guidare la regolamentazione emergente di vari prodotti del tabacco 10,11.

Ad esempio, abbiamo dimostrato che sostanze infiammabili prodotti del tabacco (centrali termiche) come complesso medio-fumo condizionata (WS-CM) e particolato totale (TPM) sono di gran lunga più citotossici e dannoso perDNA di centrali termiche non combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, è stato recentemente riportato che le centrali termiche combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, abbiamo recentemente riportato che centrali termiche combustibili causato marcata immunosoppressione. Ciò è stato dimostrato dalla soppressione del numero verde come recettore (TLR) -ligands, stimolata la secrezione di citochine, e mirata delle cellule (K562) l'uccisione da PBMC in un modello ex vivo 14. Data l'importanza di infiammazione in processi di malattia fumo-indotta sigaretta, un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di analisi per valutare gli effetti modulatori immunitari del fumo di sigaretta è presentata in questo rapporto.

Gli ex vivo saggi tipicamente misurate intracellulare e citochine, nonché la funzione citolitica di T citotossici e le cellule NK nella cella K562 uccidendo 14 saggi secreti. I saggi coinvolti pre-incubazione con WS-CM e nicotina e successiva stimolazione di PBMCs con TLR agonisti per un periodo di 3 giorni; le letture finali sono eseguite utilizzando saggi immunoenzimatica (ELISA) e / o di citometria a flusso. Abbiamo utilizzato lipopolisaccaride batterico (LPS), che si lega a recettori TLR-4 e stimola PBMC conseguente produzione di citochine intracellulari e secrezione di citochine. Oltre all'ottimizzazione dei vari passaggi del test per valutare gli effetti immunomodulatori di centrali termiche, abbiamo anche i metodi attuali per PBMCs isolamento, saggi di morte cellulare, e IL-8 quantificazione. Questi metodi possono essere applicati per affrontare altre questioni di ricerca e ulteriormente raffinato per valutare i prodotti del tabacco nel contesto normativo.

Tabella 1. Pubblicato segnalazioni di in vitro e ex vivo i metodi utilizzati per studiare varilus effetti fisiopatologici di preparati prodotti tabacco CS, media fumo di sigaretta.; CSC, fumo di sigaretta condensa; CSE, estratto di fumo di sigaretta; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi; qPCR, reazione a catena della polimerasi quantitativa; RT, in tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa; TS, fumo di tabacco.

Autore (Anno di corso) Laan et al. (2004) Moodie et al. (2004) Oltmanns et al. (2005) Vayssier (1998) Witherden et al. (2004) Birrell et al. (2008)
Le cellule utilizzate Le cellule umane bronchiali endoteliali (BEAS-2B), neutrofili umani Cellule epiteliali alveolari umani (A549) Vie aeree liscio cellule muscolari umane (HASMC) U937 premonocytic umane, monociti umani Tipo alveolare II cellule epiteliali (ATII) Monocitica umanalinea cellulare (THP-1), macrofagi polmonari umane
TPP usato CSE CSC CSE TS CSE CS
Metodo utilizzato ELISA, qPCR, immigrazione, spostamento elettromobilità Immunoistochimica-chimica, elettroforesi, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA ELISA, RT-PCR, qPCR, elettroforesi Spostamento Gel-mobility La microscopia ottica, microscopia elettronica, elettroforesi, ELISA qPCR, ELISA, kit E-toxate (Sigma), piastra di p65 dosaggio (Transam), elettroforesi, vari kit immunodosaggio
Misura IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migrazione Acetiltransferasi istoni, istone deacetilasi, NF-kB, IL-8, pI kB-α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotassina Calore scossa / di stress proteine ​​(HSP / Hsp70), HF fattore di trascrizione NF-kB,TNF-α Tensioattivo proteina (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, α-TNF, IL-1β, IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK fosforilazione, cJun: legame al DNA, il glutatione, p65: legame al DNA
Risultato finale CSE down-regola la produzione di citochine mediante la soppressione di AP-1 attivazione. H 2 O 2 e CSC migliorare acetilazione delle proteine ​​istoniche, diminuire l'attività dell'istone deacetilasi, differenziale regolano il rilascio di citochine proinfiammatorie. Il fumo di sigaretta può causare il rilascio di IL-8 da HASMC, arricchito da TNF-α, il 20% CSE meno di IL-8 rilascio, inibizione di eotassina e RANTES dal fumo di sigaretta. TS attivati ​​fattore HF di trascrizione, che è stato associato con Hsp70 sovraespressione e l'inibizione di NFkB attività e di rilascio del TNF-α vincolante. Ridotto ATII livelli chemochine derivati ​​dalle cellule compromesso alveoriparazione lar, contribuendo al fumo di sigaretta indotto danno alveolare e l'enfisema. I dati forniscono spiegazione meccanicistica del perché i fumatori sono aumentate le infezioni respiratorie. Soppressione della risposta innata è accompagnata da un aumento di IL-8.

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Protocollo

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NOTA: consenso informato scritto per fare questo studio è stato ottenuto in una unità di ricerca clinica locale in corso di approvazione IRB, per Good Clinical Practices. Lavorazione di sangue, l'isolamento delle PBMC e altri esperimenti di coltura cellulare sono eseguite in condizioni sterili, utilizzando forniture microbiologicamente sterili e reagenti.

1. WS-CM Preparazione

  1. Generare WS-CM 12 come precedentemente descritto.
    1. Preparare WS-CM passando fumo di quattro sigarette 3R4F riferimento attraverso Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium senza rosso fenolo utilizzando il seguente regime di fumare: 35-60-2, il volume in ml soffio, soffio intervallo in secondi, e la durata puff in sec, rispettivamente. Ogni preparazione genera un campione di 20 ml.
  2. Tubo Label (s) con data, ora completato, e il nome e il numero di sigarette. Conservare i 500 microlitri aliquote a -80 ° C subito dopo il fumo è completato.
  3. Analizzare aliquote di WS congelate-CM Per determinare i livelli di nicotina, nitrosammine specifiche del tabacco, e gli idrocarburi policiclici aromatici come descritto in precedenza 12.

2. Isolamento di PBMC

  1. Prelevare il sangue fresco da donatori sani (che sono non consumatori di prodotti del tabacco) Isolare PBMC da sangue fresco come descritto di seguito nella sezione separata approvazione da Wake Forest Baptist Health IRB 15.
    1. Prima dell'arrivo della sacca di sangue, avere una bottiglia da 500 ml, forbici, buffer di isolamento, e tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) (RT) pronto in un livello di biosicurezza 2 (BSL-2) cappa coltura cellulare. Buffer di isolamento deve essere protetto dalla luce.
    2. Tenere la sacca di sangue capovolta e tagliare il tubo appena sotto dove è stato bloccato lasciando almeno 3 cm di tubo.
    3. Togliere il tappo dalla bottiglia da 500 ml e mantenere il tubo sopra l'apertura della bottiglia. Raccogliete la sacca di sangue e capovolgere per permettere al sangue di fluire liberamente dal sacchetto in tegli bottiglia fino al sacchetto è vuoto. Lasciare il sangue di fluire sulla parete interna della bottiglia rispetto verso il basso da evitare la creazione di bolle.
    4. Versare buffer di isolamento nella bottiglia in un rapporto 1: 5 di tampone di isolamento al sangue. Tappare il flacone e capovolgere delicatamente, end-over-end, 10 volte. Lasciare la bottiglia nella cappa coltura cellulare ad incubare con luci spente, per 1 ora a RT.
    5. A, strato di colore paglierino chiaro costruirà sopra il sangue. Rimuovere questo livello con un 25 ml pipetta sierologica in 50 ml provette coniche. La quantità raccolte possono variare 50-300 ml, a seconda del soggetto che sangue donato.
    6. Centrifugare le provette a 200 xg per 10 min a RT.
    7. Aspirare il surnatante trasparente, lasciando il pellet di sangue di colore scuro. Il pellet sarà sciolto ma viscoso.
    8. Pipettare 3 ml di tampone isolamento in 15 ml provette coniche.
    9. Per il pellet risospendere, aggiungere 20 ml di DPBS per ogni 50 ml di liquido color paglierino raccolti in sTep 2.1.5. Vortex a mescolare bene, e consolidare il liquido risospeso da più tubi. Questo liquido contiene globuli sospeso.
    10. Con una pipetta di trasferimento, trasferimento 5 ml di globuli sospesi su 3 ml di tampone di isolamento nel passaggio 2.1.8. Inclinare il tubo da 15 ml contenente lentamente e delicatamente la sospensione cellulare per creare due livelli separati. Centrifugare le provette a 400 xg per 40 min a RT con accelerazione minima e senza freno.
    11. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lo strato risultante torbida centrale (buffy coat) contenente PBMC in una provetta conica da 50 ml. Evitare disegno altri livelli chiari di sotto di essa. Trasferimento non più di 25 ml in ciascun tubo da 50 ml.
    12. Aggiungere 25 ml di tampone fredda (o più per riempire l'intero volume rimanente del tubo conico 50 ml) per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a 4 ° C.
    13. Risospendere il pellet con 10 ml di tampone di corsa. Questo contiene PBMC. Contare le celle e utilizzare immediatamente o posto in ghiaccio per congelamento.

3. gelo e disgelo il PBMC

  1. Centrifuga le PBMC che sono stati raccolti in fase 2.1.13 per 10 min a 400 x g.
  2. Riempire il contenitore congelamento con alcool isopropilico per le istruzioni del produttore. ATTENZIONE: alcol isopropilico è infiammabile e altamente tossici.
  3. Risospendere il pellet con terreno RPMI 1640 (4 ° C) contenente siero bovino fetale 20% (FBS) e il 10% dimetilsolfossido (DMSO). Questo è RPMI 1640 medium di congelamento. Risospendere il pellet con una quantità di congelamento mezzo che si tradurrà in una sospensione con circa 5 x 10 7 cellule / ml. Il numero di cellule disponibili per il congelamento varierà.
  4. Dispensare 1 ml aliquote di sospensione cellulare in 2 ml cryotubes e posizionare i cryotubes nel contenitore di congelamento. Posizionare il contenitore congelamento con cryotubes in un congelatore a -80 ° C per memorizzare O / N e quindi rimuovere i cryotubes e trasferire per memorizzare in uncongelatore criogenico tra -150 ° C a -190 ° C.
  5. Rimuovere il cryotube dallo stoccaggio criogenico e scongelare rapidamente con agitazione in un bagno d'acqua a 37 ° C.
  6. Trasferire immediatamente le PBMC scongelati nel cryotube in una provetta conica da 15 ml con 10 ml RPMI 1640 medium completa (4 ° C) contenente 10% FBS, 1% Pen / Strep e 1% di L-glutammina. Il contenuto del cryotube scongelata devono essere trasferite quanto prima possibile avere la vitalità cellulare massima 15.
  7. Centrifugare le PBMC a 400 xg per 10 min.
  8. Risospendere il pellet con 5 ml RPMI 1640 completo e contare le cellule.
  9. Misurare la vitalità delle cellule con metodi consolidati come trypan metodo di esclusione blu. Generalmente vitalità cellulare con questo metodo è circa il 90 - 95%. Le PBMC sono ora pronti per l'uso negli esperimenti.

4. Cella Morte Determinazione

NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo study. Le diluizioni possono essere modificati di conseguenza.

  1. Diluire WS-CM o nicotina in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto, come indicato di seguito.
  2. Diluire WS-CM alle seguenti concentrazioni: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, e 5 mg / mL di unità equi-nicotina (in base al contenuto di nicotina in WS-CM) 12.
  3. Diluire nicotina nel mezzo RPMI alle seguenti concentrazioni: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 e 3000 mg / ml. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l'ambiente.
  4. Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo a ciascun pozzetto ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto.
  5. Ai fini di questo studio, preparare due serie di piastre come sopra. Coprire le piastre e incubare una piastra per 24 ore e una piastra per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Regolare punti di tempo, se necessario.
  6. Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine risospendere le cellule con 200 ml di ghiaccio freddo tampone di corsa, e ripetere la fase di lavaggio una volta.
  7. Aggiungere 95 ml di tampone di corsa seguiti da 5 ml di 7-aminoactinomycin D (7AAD) a ciascun pozzetto per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 15 min.
  8. Aggiungere 100 ml di tampone di corsa ai tubi del cluster. Trasferire l'intero volume di sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra a tubi di cluster e acquisire i campioni al citofluorimetro.
  9. Determinare la percentuale di cellule 7AAD-positive in citometria a flusso software di analisi.

5. EC 50 Determinazione

  1. I valori di EC 50 di WS-CM e nicotina sono determinati da 7AAD-positivo colorazione dei PBMC.
  2. Il valore EC50 è definito come il concentration alla quale il 50% delle cellule non erano più vitali in un saggio di 24 ore, ed i valori sono espressi come pg di equi-nicotina unità / ml.
  3. Ai fini di questo studio, i valori di EC 50 sono stati determinati per essere 1,56 mg / ml e 1.650 mg / ml per WS-CM e la nicotina, rispettivamente.

6. citochine secrete

NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo studio. Le diluizioni possono essere regolati di conseguenza.

  1. Diluire WS-CM in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto alla concentrazione di 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml di unità equi-nicotina.
  2. Diluire nicotina alle seguenti concentrazioni: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 e 3000 mg / mL. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l'ambiente.
  3. Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo a ciascun pozzetto ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto.Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto.
  4. Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
  5. Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine sospensione cellule con 200 ml di tampone di corsa ghiacciata e ripetendo la fase di lavaggio una volta.
  6. Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo, e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
  7. Aggiungere 200 pl di 10 ug / ml di mezzo LPS in ciascun pozzetto.
  8. Coprire la piastra ed incubare per 4 ore, 24 ore, 48 ore, o 72 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. Regolare tempi di incubazione, se necessario.
  9. Centrifugare la piastra a 300 g per 3 min.
  10. Prendete 175 ml di surnatante da ogni bene e conservare in un freezer a -80 ° C per eseguire i test in step 7 e 8.

7. citometria Bead Array Assay

  1. Scongelare i supernatanti cellulari preparati dal punto 6.10 e l'uso nel saggio CBA. Eseguire il test di matrice tallone di citometria (CBA) come da istruzioni del produttore.

8. IL-8 ELISA

  1. Scongelare i supernatanti cellulari dal punto 6.10 e l'uso in IL-8 ELISA. Eseguire il test ELISA secondo le istruzioni del produttore.

9. intracellulare colorazione e Citometria a Flusso

NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo studio. Le diluizioni possono essere regolati di conseguenza.

  1. Diluire WS-CM in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto alla concentrazione di 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml di unità equi-nicotina.
  2. Nella stessa piastra, diluire nicotina alle seguenti concentrazioni: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 mg / ml. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e Hazar dell'ambientedous.
  3. Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto.
  4. Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
  5. Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine risospendere le cellule con 200 ml di ghiaccio freddo tampone di corsa, e ripetere la fase di lavaggio una volta.
  6. Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo alla piastra, e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
  7. Preparate le concentrazioni di lavoro di 2 ml / ml GolgiPlug e 10 mcg / LPS ml con RPMI terreno completo e aggiungere 200 microlitri di ogni bene.
  8. Incubare la piastra per 6 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
  9. Al termine della fase 9.8, lavare le cellule con tampone di corsa (4 ° C) e centrifugazione a 300xg per 3 min a 4 ° C.
  10. Aggiungere 100 ml di Cytofix a ciascun pozzetto e incubare per 20 minuti a 4 ° C.
  11. Lavare le cellule 3 volte come descritto al punto 9.9 con 1x Permwash (4 ° C) a 300 xg per 3 min a 4 ° C.
  12. Aggiungere 45 ml di 1x Cytoperm ciascun pozzetto seguito da 5 ml di ciascuna di uno dei seguenti anticorpi in ciascun pozzetto: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubare a 4 ° C per 30 min.
  13. Lavare le cellule due volte come descritto al punto 9.9 con 1x Permwash (4 ° C) e una volta con tampone di corsa (4 ° C) a 300 xg per 3 min a 4 ° C.
  14. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% paraformaldeide (4 ° C). Trasferire le cellule in provette 12 × 75 mm, e analizzare i campioni citofluorimetro. ATTENZIONE: Paraformaldeide è corrosivo, acutamente tossico e pericoloso per la salute.

10. K562 Assay Uccidere

NOTA: K562 devono essere coltivatein coltura a 37 ° C e 5% CO 2 con mezzo completo RPMI fino a raggiungere 80% di confluenza prima del dosaggio.

  1. Preparare una 5mM carbossifluoresceina estere succinimidil (CFSE) stock soluzione con l'aggiunta di 18 ml di DMSO al flacone.
  2. Diluire WS-CM o nicotina in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto per ottenere le unità equi-nicotina desiderati o concentrazioni di nicotina per ciascun pozzetto. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l'ambiente.
  3. Aggiungere 100 ml di PBMC in terreno RPMI completo ad una concentrazione di 1,5 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule con WS-CM o nicotina sarà di 200 microlitri / pozzetto.
  4. Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
  5. Lavare le cellule K562 con l'aggiunta di 10 ml di DPBS e centrifugare a 400 xg per 8 minuti a temperatura ambiente.
  6. Risospendere le cellule con 10 ml di DPBS e contare le cellule K562.
  7. Preparare CFSE workisoluzione ng aggiungendo 1 ml di soluzione madre CFSE a 1 ml DPBS.
  8. Aggiungere 1 ml della soluzione di lavoro CFSE a 1 ml di sospensione cellulare K562 contenente 1 -, 2 x 10 7 cellule. Vortex e incubare proprio per 2 minuti a temperatura ambiente.
  9. Aggiungere immediatamente 200 ml di FBS. Vortex e incubare proprio per 2 minuti a temperatura ambiente.
  10. Aggiungere 10 ml di RPMI terreno completo e centrifugare la provetta a 400 xg per 8 minuti a temperatura ambiente.
  11. Rimuovere il surnatante RPMI e rompere il pellet e risospendere le cellule con 10 ml di mezzo RPMI completo e contare le cellule K562-CFSE etichettati.
  12. Lavare le PBMC mediante centrifugazione la piastra a 300 xg per 3 min a RT. Aspirare il surnatante per decantazione del liquido. Riposizionare il coperchio e agitare la parte inferiore della piastra. Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo e ripetere lavaggio ancora una volta.
  13. Aggiungere cellule K562-CFSE etichettati con un rapporto di 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) a ciascun pozzetto della piastra di PBMC e in seguito incubate per 5 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
  14. Lavare il mix cellule per centrifugazione a 300 xg per 3 min a RT. Aspirare il supernatante scartando il liquido. Posizionare il coperchio e agitare la parte inferiore della piastra.
  15. Aggiungere 200 ml di tampone di corsa e ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 10.14 ancora una volta.
  16. Aggiungere 95 ml di tampone di corsa seguiti da 5 ml di 7AAD a ciascun pozzetto un volume totale di 100 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 15 min.
  17. Aggiungere 100 microlitri di tampone di corsa a ciascun pozzetto e trasferire l'intero volume di sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra a tubi di cluster e acquisire i campioni al citofluorimetro.
  18. Determinare la percentuale di cellule 7AAD-positivi e CFSE positivi citometria a flusso software di analisi.

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Risultati

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I risultati sono stati presentati come media ± errore standard della media (quattro campioni dei donatori). T-test di Student tra i campioni trattati e di controllo non trattati è stata effettuata utilizzando il software Excel nonché comparazioni t-test per tutti i trattamenti ai rispettivi controlli corrispondenti. La significatività statistica è stata indicata da: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.

Per misurare l'effetto dell'esposizione alla WS-CM e nicotina, PBMC sono sta...

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Discussione

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Noi e altri abbiamo già dimostrato che il trattamento dei PBMC con centrali termiche sopprime diverse risposte, tra cui l'espressione e la secrezione di citochine e misure funzionali come cellula bersaglio uccidendo 14. I metodi sperimentali descritti nel precedente lavoro richiedono periodi di incubazione più lunghi e sono stati modesti in grandezza 14. Date le potenziali applicazioni di questa affascinante ex vivo modello di ricerca di base e applicata, abbiamo studiato se nessuno de...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è finanziato da RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) nell'ambito di un accordo di ricerca in collaborazione con la Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad è un dipendente a tempo pieno di RJRT.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
12 tubi da 75 mmBD Falcon352058
tubi conici da 15 mlCorning430790
microtubi da 2 mlAxygenMCT-150-C-S
3R4F sigarette di riferimentoUniv. of Kentucky, College of Agriculture3R4F
Tubi conici da 50 mlCorning430828
flaconeda 500 mlCorning430282
7AADBD Pharmingen 559925
Piastra a fondo piatto a 96 pozzettiTermo Nunc439454
Piastre a fondo rotondo a 96 pozzettiBD Falcon353077
Cappa per colture cellulariThermo Scientific1300 Series A2
CentrifugeEppendorf58110R
CFSESonde molecolari Life TechnologiesC34554
Provette a grappoloCorning4401Nocivo se ingerito, cancerogeno
Cytofix/Cytoperm (Permwash)BD Biosciences555028DMSO (
dimetilsolfossido infiammabile)Sigma-AldrichD8418
DPBSLonza17-512F
FBSSigma-AldrichF2442
FCAP ArrayBD Biosciences652099Software analizza i dati CBA
Unità di filtroNalgene156-4020
Citometro a flussoBD BiosciencesFACS Canto II8 colori, a Ex 405 e Em 785.
Citometro a flussoBD BiosciencesFACS Calibur4 colori a Ex 495 e Em 785.
Software di analisi per citometria a flussoTree StarFlowJo
Contenitore di congelamentoNalgene5100-0001Contiene DMSO, irritante
GogliPlugBD Biosciences555029Cancerogeno, irritante, corrosivo
H2SO4Sigma-Aldrich339741 Kit di
citochineinfiammatorie umaneBD Biosciences551811
IFN-γ V-500 AnticorpoBD Horizon561980sensibilizzante cutaneo
IL-8 ELISA KitR e D Sistemi R e DDY208
Tampone di isolamentoIsolinfa, CTL Scientific Corp.1114868Liquido infiammabile, irritante
Alcool isopropilicoSigma-AldrichW292907
L-GlutamminaGibco Life Technologies25030-081
LPSSigma-AldrichL2630
MIP1-&alfa; PE AnticorpoBD Pharmingen554730Tossicità acuta,
orale MonensinSigma-AldrichM5273
NaClSigma-AldrichS7653
NicotinaSigma-AldrichN3876Tossicità acuta, pericolo ambientale
ParafilmBemis" M"
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148Infiammabile, irritazione cutanea
Pen/streptococcoGibco Life Technologies15140-122
RPMI 1640Gibco Life Technologies11875-093
Tampone di corsaMACS Running Buffer, Miltenyi Biotech130-091-221
Kit CBA Th1/Th2BD Biosciences551809
TNF-&alfa; Alexa Fluor 488 AnticorpoBioLegend502915
Pipetta di trasferimentoFisher Scientific13-711-20
Tris BaseSigma-AldrichT1503

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
  2. Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
  3. Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
  4. Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
  5. Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
  6. Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
  7. Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74(2005).
  8. Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
  9. Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
  10. Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
  11. Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
  12. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
  13. Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
  14. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
  15. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
  16. Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
  17. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
  18. Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).

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