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Articolo metodologico

Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

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DOI:

10.3791/52370

⸱

12 marzo 2015

 , 
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo su come determinare la quantità e la distribuzione dei metalli in un campione utilizzando la fluorescenza a raggi X di sincrotrone. Ci concentriamo sulle cellule aderenti e descriviamo il metodo di fissazione chimica per preparare questo campione. Descriviamo quindi come montare e visualizzare il campione utilizzando i raggi X di sincrotrone.

Abstract

L'imaging a fluorescenza a raggi X ci consente di misurare in modo non distruttivo la distribuzione spaziale e la concentrazione di più elementi contemporaneamente su aree di campionamento grandi o piccole. È stato applicato in molte aree della scienza, tra cui la scienza dei materiali, le geoscienze, lo studio delle opere del patrimonio culturale e la biologia chimica. Nel caso della biologia chimica, ad esempio, la visualizzazione delle distribuzioni dei metalli all'interno delle cellule ci permette di studiare sia gli ioni metallici presenti naturalmente nelle cellule, sia i metalli introdotti esogenamente come farmaci e nanoparticelle. A causa della natura completamente idratata di quasi tutti i campioni biologici, la criofissazione seguita dall'imaging a temperatura criogenica rappresenta la modalità di imaging ideale attualmente disponibile. Tuttavia, nelle circostanze in cui tale combinazione non è facilmente accessibile o pratica, la fissazione chimica a base di aldeidi rimane utile e talvolta inevitabile. Questo articolo descrive nel modo più dettagliato possibile la preparazione di cellule di mammifero aderenti mediante fissazione chimica per l'imaging fluorescente a raggi X.

Introduzione

X-ray fluorescenza consente sia l'identità e la quantità di elementi presenti in un campione da spazialmente risolto. Incidente raggi X, di una energia selezionata per essere maggiore dell'energia dell'elemento più pesante di interesse vincolante elettroni, superare l'energia di legame degli elettroni interno-shell al nucleo 1. Questo crea un 'buco' nel guscio di elettroni. Come elettroni ad alta energia cadono in questi fori, raggi X fluorescenti sono emessi cui lunghezza d'onda dipende dalla separazione dell'energia di tali orbitali. Poiché la spaziatura energia degli orbitali è caratteristica di un dato elemento, l'emissione di fluorescenza a raggi X ha anche lunghezze d'onda caratteristiche, dipendenti sull'elemento. È questa emissione alla lunghezza d'onda caratteristica che permette l'identificazione degli elementi presenti. Calibrazione dell'intensità di fluorescenza permette quantificazione degli elementi presenti.

Fluorescenza a raggi X microscopy (XFM) è diventato sempre più utilizzato, in parte a causa dello sviluppo di fonti di sincrotrone a raggi X molto brillanti, come quelle in Primavera-8 in Giappone, l'europeo di radiazione di sincrotrone (ESRF) in Francia, e l'Advanced Photon Source ( APS) negli Stati Uniti 2. Queste fonti forniscono altissima intensità fasci di raggi X. Allo stesso tempo, il miglioramento ottica a raggi X, come la tecnologia zone plate, permesso la messa a fuoco di questi fasci a macchie sub-micron, anche se piuttosto inefficiente 3. Con molto fasci ad alta intensità, anche una quantità relativamente piccola di luce che può essere messo a fuoco è sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule, producendo segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore. Pertanto, lo studio della biologia chimica di metalli nella cella è un'applicazione in particolare, che fa uso di molti dei recenti sviluppi in questa tecnica 4-10.

Ci sono molti fattori critici da considerare durante la appmentire XFM per indagare la distribuzione elementare e la quantificazione di cellule di mammifero in coltura o altri campioni biologici. In primo luogo, il campione deve essere mantenuto integro, sia strutturalmente e rispetto alla sua composizione elementare, affinché la misura sia significativo. In secondo luogo, il campione deve essere conservato in qualche modo in modo che sia resistente al danno di radiazione che può essere causato da un fascio di raggi X focalizzato. Un modo che un campione può soddisfare entrambi i criteri contemporaneamente deve essere rapidamente congelati in un vetrosa, ghiaccio amorfo 11,12. Congelamento rapido è spesso raggiunto attraverso varie tecniche di crioconservazione, come tuffo il congelamento o alta pressione congelamento 13-16. E 'generalmente accettato che la crioconservazione conserva architettura cellulare complessiva e composizioni chimiche in campioni biologici il più vicino possibile allo stato nativo. Fissaggio chimico, d'altra parte, a causa della penetrazione lenta e selettiva di fissativi in ​​cellule e tessuti come well le successive variazioni di permeabilità della membrana, possono consentire vari ioni cellulari soprattutto gli ioni diffusibili come Cl, Ca e K per essere colati, perse o ricollocate, rendendo così investigazione di questi elementi non ottimali 17-19. Nonostante il chiaro vantaggio di crio-over fissaggio fissaggio chimica in generale, per le cellule di mammifero aderenti in particolare, crioconservazione ha varie limitazioni 20-23. La più ovvia è che non tutti i laboratori di ricerca ha un facile accesso agli strumenti di crioconservazione. La maggior parte dei congelatori alta pressione correnti o anche immergono congelatori sono costosi e di proprietà solo da un sottoinsieme di strutture cryo, che può essere lontano da dove vengono incubate cellule. Il vantaggio di crioconservazione potrebbe essere scambiato per lo svantaggio di stress viaggi collocato sulle cellule. Così, mentre crioconservazione è sicuramente il modo più rigoroso per conservare campioni per analisi a raggi X di fluorescenza, non è certamente la più accessibile a tutti i ricercatori in tutte le circostanze;né è sempre essenziale - se i metalli di interesse sono strettamente legati alle macromolecole fissabili, e la risoluzione con cui viene ripreso il campione è superiore al danneggiamento del ultra-microstruttura che potrebbero verificarsi durante l'essiccazione. Memore dei caveat 24, fissaggio chimico e asciugatura può essere una scelta adatta.

Altri fattori in un esperimento di imaging di fluorescenza a raggi X di successo includono l'analisi corretta. X-ray imaging di fluorescenza è fondamentalmente spettroscopia di emissione di fluorescenza di raggi X in combinazione con raster-scanning per fornire la risoluzione spaziale. Gli spettri di emissione di fluorescenza a raggi X raccolti contengono una combinazione di sovrapposizione picchi di emissione, di fondo, e le cime di scattering elastico e anelastico del fascio incidente. Software che consente la de-convoluzione di questi contributi, e il montaggio dei picchi di emissione, è stato uno sviluppo critico per questo campo 25. Inoltre, lo sviluppo e dist commercialeribution di norme a film sottile di composizione nota, usata per calibrare intensità della fluorescenza rispetto alla quantità di materiale, è stato molto importante anche.

Questo protocollo fornisce una descrizione della preparazione di cellule aderenti da fissazione chimica ed essiccamento all'aria. Un passo fondamentale in questo processo è la crescita delle cellule alle finestre di nitruro di silicio, che spesso non aderiscono bene, rendendo dolce risciacquo in una particolare chiave di modo di successo.

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Protocollo

1. Preparazione di strumenti, Substrati, Culture Media e Piatti

  1. Gestione delle finestre nitruro di silicio (Si 3 N 4).
    1. Aprire la capsula leggermente spremitura un'estremità contenente la finestra in modo tale da non comprimere finestra stessa, ruotando l'altra estremità della capsula con l'altra mano.
    2. Controllare un paio di inversione, pinzette dalla punta sottile sotto stereomicroscopio per assicurarsi che non ci siano adesivi, lacune o curve sulla punta. In caso contrario, le finestre possono essere rotti dalle pinzette o il distacco di loro durante le fasi successive.
    3. Rimuovere la finestra dalla capsula afferrando attentamente il telaio della finestra con una pinzetta, mentre delicatamente comprimendo la capsula in prossimità dell'estremità aperta esercitando una pressione in una direzione in modo da rendere la capsula più ampio in cui i bordi della finestra devono venire fuori.
  2. Finestra pre-lavaggio (optional).
    1. Se lo si desidera, le finestre di prelavaggio per immersione delicatamentein acqua distillata per 5 sec, seguito da 2 minuti di lavaggio in 70% di etanolo e 2 min lavaggio in 100% di etanolo.
  3. L'apposizione e sterilizzazione finestre sul piatto cultura.
    1. Per fissare le finestre, impostare la finestra con lato piatto fino al fondo del piatto di coltura, posizionare un pezzo di nastro su un vetrino pulito. Tagliare su una striscia di quarto di pollice giù per il lato lungo del nastro. Prendete una fetta di nastro largo del lato corto (a ⅛ "da ¾") con una lama di rasoio pulito.
    2. Utilizzare pinzette per applicare la fetta di nastro al bordo della griglia o finestra. Usare abbastanza per aderire saldamente senza coprire l'apertura della finestra stessa. Manipolando il nastro aderito con pinzette, impostare il finestrino sul fondo del piatto di coltura. Utilizzare la punta delle pinzette di aderire il nastro al fondo del piatto cultura saldamente.
    3. Applicare un'altra striscia di nastro per l'altro bordo e rispettare questo al fondo saldamente con la punta delle pinzette.
    4. Una volta che tutte le finestre sonoregistrato, sterilizzare finestre in piastre di coltura con raggi ultravioletti (UV). Realizzare questo mettendo il piatto sotto la lampada UV in una cappa a flusso laminare per circa 1 ora.
    5. (Facoltativo) Se le finestre devono essere pre-rivestito con poli-lisina, farlo seguente finestra di sterilizzazione. Rivestire la finestra con 10 ml di soluzione sterile 0,01% poli-L-lisina per 1 ora a 37 ° C incubatore, e poi sciacquare la soluzione rimanente via con il mezzo di coltura.
  4. Preparare buffer per lavaggio finale prima XFM.
    1. Preparare sia un Tris-glucosio o piperazine- N, N '-bis (acido etansolfonico) (TUBI) -sucrose tampone privo di eventuali tracce di metalli con osmolalità e pH pari al tampone fosfato salino di Dulbecco (D-PBS) senza calcio e magnesio. Utilizzare uno di questi buffer per risciacquare celle dopo cellule vengono fissate chimicamente.
      1. Per rendere la soluzione Tris-glucosio (Tris 10 mM, glucosio 260 mM, 9 mM acido acetico,) aggiungere 1,4 g di glucosio, 36 mg di base Tris e16 ml di acido acetico e 20 ml di acqua ultrapura. Poi, regolare il volume finale di 30 ml con acqua ultrapura. Non è necessaria alcuna regolazione del pH. Conservare a temperatura ambiente fino a una settimana.
      2. Per rendere i TUBI-saccarosio (20 TUBI mM, saccarosio 200 mm) aggiungono 0,18 g di tubi e 2,0 g di saccarosio a 20 ml di acqua ultrapura e regolare il pH a 7,4 con piccole quantità di acido acetico concentrato. Poi, regolare il volume finale di 30 ml con acqua ultrapura. Conservare a temperatura ambiente fino a una settimana.
        NOTA: La ragione per evitare di utilizzare PBS nel risciacquo finale è che le concentrazioni di fosfato, cloruro e potassio in PBS sono così alti che può interferire con XFM se non viene completamente rimosso prima essiccazione all'aria.
  5. Preparare buffer per la placcatura cellulare.
    1. Preparare o estrarre tutti i media, come ad esempio RPMI medio 1640, 1x soluzione tripsina-EDTA, D-PBS, e tutti gli altri reagenti come necessario per la particolare linea cellulare aderente come normalmente fatto per passaging le cellule aderenti ointeressi f, e riscaldare a 37 ° C.

2. placcatura di Celle

  1. Per piatto di coltura sterilizzato contenente le finestre, nella cappa a flusso laminare, aggiungere delicatamente supporti (10 ml per un piatto di coltura 100 mm), lungo il lato del piatto cultura con esso inclinato ad un angolo. Evitare di creare tensione superficiale inutili o cadere supporto direttamente sulla superficie delle finestre nitruro di silicio. Come si aggiunge supporto, lentamente alleviare l'angolo di inclinazione per rivestire la griglia e la finestra con i media.
  2. Preparare la linea cellulare aderenti di interesse appropriato, trypsinizing o raschiare le cellule fuori delle piastre come al solito per passaging la linea cellulare. Eseguire una conta cellulare, o altra preparazione necessaria prima di applicare le cellule alla piastra fresca.
  3. Aggiungere cellule al piatto cultura con finestre ad una densità cellulare che è necessaria per raggiungere tipicamente il 50% -70% di confluenza entro 24-72 ore, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica.
  4. Osservare la crescita delle cellule occasionalmente, utilizzando un microscopio ottico invertito, fino alla densità cellulare desiderata (di solito 50% -70% di confluenza) è raggiunto.

3. Fissazione delle cellule

  1. Preparare freschi 4% paraformaldeide in D-PBS diluendo uno stock acquistato (ad esempio 25% paraformaldeide) e regolando il pH a 7,4 con acido acetico (per evitare l'aggiunta di eccesso di sodio al campione).
  2. Quando le cellule sono state coltivate come desiderato, e le macchie vitali (come Hoescht) sono stati applicati e ripreso, rimuovere il supporto aspirando delicatamente, inclinando il piatto in un angolo di 45 ° con una mano, e l'aspirazione con una pipetta con l'altra mano .
    NOTA: Invece di pipettaggio impiegato mezzi, l'alternativa è quella di scegliere la finestra in alto, immergere la finestra in microprovette con D-PBS due volte e poi metterlo in una nuova imbarcazione cultura con soluzioni fissativo per 20 minuti seguito da 2 tempi di lavaggio PBS per rimuovere i residui fissativi. Se questo viene scelto, andare directly al punto 3.5.
  3. Lavare il piatto delicatamente con D-PBS e sostituire immediatamente il liquido rimosso aggiungendo delicatamente il fresco 4% PFA / PBS tenendo il piatto con un angolo di 45 °, pipettaggio verso il lato del piatto, e lentamente rilassante l'angolo di inclinazione per consentire la soluzione fissativa per coprire le finestre. Conservare le celle coperte con il fissativo per 20 minuti a RT.
  4. Rimuovere il liquido mediante aspirazione delicata, ancora come sopra, inclinando leggermente il piatto ed aspirando a mano.
  5. Sostituire il liquido rimosso aggiungendo delicatamente alcuni dei tubi / soluzione di saccarosio, con il metodo di inclinazione e pipettaggio descritto nel passaggio 3.3.
  6. Ripetere i punti 3.4 e 3.5.
  7. Preparare i materiali per l'essiccazione.
    1. Raccogliere asciugamani privo di lanugine, come Kimwipes, e tirare uno fuori dalla scatola, quindi è a portata di mano molto rapidamente e facilmente.
    2. Preparare un luogo non-pulita e in piano per impostare la finestra per asciugare. Impostare su una stuoia griglia gomma del tipo usato in microscopia elettronica, che ha così crestela finestra può essere appoggiato su un'estremità mentre si asciuga. Ciò manterrà la finestra di rimanere bloccati alla superficie di essiccazione come si asciuga, e drenare qualsiasi buffer residuo al bordo del campione.
  8. Tweeze cautela il nastro collegata alla finestra per tenere la finestra fuori dal liquido. Recuperare le finestre che si staccano del nastro, applicando una piccola quantità di TUBI / saccarosio per farli galleggiare e poi raccogliere con le pinzette inversa.
  9. Cautela (senza toccare la finestra stessa) e accuratamente daub qualsiasi eccesso TUBI / saccarosio dal bordo della finestra con un Kimwipe. Daub Anche la parte posteriore zona frastagliata con una piega arrotondata di un Kimwipe.
    NOTA: L'obiettivo è di avere meno cristallizzazione di sali o buffer sulla superficie della finestra possibile.
  10. Collocare la finestra sul tappeto griglia. Assicurarsi che la finestra non è disteso sul tappeto griglia, ma appoggiato su un bordo (con le creste del tappeto griglia) e toccando il meno della grigliamat possibile. Lasciare la finestra di asciutto.

4. Montaggio del campione e Imaging

  1. Una volta che il campione è essiccato, verificare la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico. Eseguire questa verifica, prima di preparare i campioni per il trasporto di un sincrotrone.
  2. Pacchetto le finestre per il trasporto alla linea di luce di sincrotrone di hosting l'esperimento. Apporre delicatamente le finestre con nastro su due lati di un vetrino, poi fissare il vetrino con nastro sul fondo di una piastra di Petri di plastica. Nastro il piatto chiusa Petri.
    NOTA: Prima di questo punto, la procedura può essere eseguita in qualsiasi laboratorio tipico. Le seguenti operazioni dovrebbero essere meglio fatto a una linea di luce di sincrotrone.
  3. Rimuovere il nastro dalla finestra delicatamente con una pinzetta. Utilizzare smalto, in un sottile strato uniforme lungo il bordo della finestra, per fissare le finestre al possessore di alluminio fornito dai collaboratori beamline del sincrotrone.
  4. Inserire il supporto di alluminio inuna cinematica di montaggio, e poi posto in posizione al microscopio a raggi X. Montare il campione su una staffa di collegamento alla fasi motorizzati, all'interno della camera campione alla linea di luce.
  5. Dopo essere usciti dalla radiografia zona strumento microscopio campione (una gabbia fatta di muri di piombo pieno), impostare la scansione. Utilizzando il software specifico linea di luce, selezionare la zona appropriata del campione da esaminare, mentre si visualizza la posizione del fascio di raggi X sul campione utilizzando una macchina fotografica dotata di un video mirino e pre-allineata con una fotocamera scintillatore valle.
  6. Scegliere la risoluzione appropriata per il campione, sulla base di una stima della dimensione della funzione più piccolo di interesse. Per l'imaging singole cellule di mammifero (~ 20-40 micron di dimensione), utilizzare una risoluzione di 0,25-0,5 micron. Per le zone di tessuti di imaging, e distinguendo strati cellulari tra loro, utilizzare una risoluzione di 2-20 micron.
  7. Scegliere il tempo di permanenza adeguato per il campione, in base alla stima della quantità del riunitoal di interesse presenti. Per una scansione rapida panoramica, o se sono presenti elevate quantità di metalli, utilizzare scansioni Vola con tempi di sosta di 30-300 msec per pixel. Se poco materiale è presente, o per misurare i metalli di bassa abbondanza relativa, utilizzare scansioni passo con tempi di sosta di 1-2 sec per pixel.
  8. Programmare le scansioni nel software specifico per linea di luce. Acquisire un'immagine raster-scan. Lavorare insieme con i collaboratori linea di luce per analizzare i dati con il software che identificheranno i caratteristici picchi di energia per ogni elemento.

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Risultati

La capacità dell'imaging fluorescenza a raggi X per fornire informazioni sui campioni biologici è subordinato questi campioni essere preparati in modo tale che essi sono robusti alle radiazioni sulla scala temporale dell'esperimento, e tuttavia la loro caratteristiche chimiche e strutturali sono ben conservato. Nella visualizzazione del risultato di un campione che è stato preparato come sopra descritto e illustrato, è possibile vedere che c'è variazione degli elementi presenti - indica che la fissazione con...

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Discussione

X-ray imaging di fluorescenza è utile in molti campi, tra cui geoscienze, scienza dei materiali e biologia chimica 26-34. Advances in raggi X di sincrotrone, e la loro messa a fuoco, hanno prodotto molto fasci ad alta intensità. Focused X-ray travi sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule ora esistono, segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore al silicio deriva produzione. E studio della biologia chimica di metalli nella cella è un'applicazione i...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Stefan Vogt per la sua assistenza nell'adattamento dei dati rappresentativi mostrati in questo articolo, e per le utili discussioni. Gli autori ringraziano anche Chris Jacobsen per il suo sostegno a Q. J.

L'uso della sorgente di fotoni avanzata, linee di luce 2-ID-E e 8-BM-B, presso l'Argonne National Laboratory è stato supportato dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Ufficio della Scienza, Ufficio delle Scienze dell'Energia di Base, nell'ambito del Contratto No. DE-AC02-06CH11357.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Finestre in nitruro di silicioSilson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Regno UnitoSiRN-5.0-200-2.0-200. Ordina per taglia. Dimensioni della membrana: 1,5 mm x 1,5 mm. Spessore: 200  Nm. Dimensioni del telaio: 5  mm x 5 mm. Spessore del telaio: 200 µm.Fonte alternativa: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Pinzetta inversa Microscopiaelettronica Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-845078520-5XEMS 5X, NC – Pinzette ultra fini
Tappetino a griglia in gommaMicroscopia elettronica Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-845071170Tappetino a griglia rotonda
Acido aceticoSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052338826di acido acetico
TUBI per metalliin tracceSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052P6757tampone solid PIPES
Soluzione madre di formaldeideElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450RT 1711310 fiale da 10 ml di paraformaldeide acquosa al 20%
tampone concentrato

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