Qui, presentiamo un protocollo su come determinare la quantità e la distribuzione dei metalli in un campione utilizzando la fluorescenza a raggi X di sincrotrone. Ci concentriamo sulle cellule aderenti e descriviamo il metodo di fissazione chimica per preparare questo campione. Descriviamo quindi come montare e visualizzare il campione utilizzando i raggi X di sincrotrone.
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Articolo metodologico
Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging a fluorescenza a raggi X ci consente di misurare in modo non distruttivo la distribuzione spaziale e la concentrazione di più elementi contemporaneamente su aree di campionamento grandi o piccole. È stato applicato in molte aree della scienza, tra cui la scienza dei materiali, le geoscienze, lo studio delle opere del patrimonio culturale e la biologia chimica. Nel caso della biologia chimica, ad esempio, la visualizzazione delle distribuzioni dei metalli all'interno delle cellule ci permette di studiare sia gli ioni metallici presenti naturalmente nelle cellule, sia i metalli introdotti esogenamente come farmaci e nanoparticelle. A causa della natura completamente idratata di quasi tutti i campioni biologici, la criofissazione seguita dall'imaging a temperatura criogenica rappresenta la modalità di imaging ideale attualmente disponibile. Tuttavia, nelle circostanze in cui tale combinazione non è facilmente accessibile o pratica, la fissazione chimica a base di aldeidi rimane utile e talvolta inevitabile. Questo articolo descrive nel modo più dettagliato possibile la preparazione di cellule di mammifero aderenti mediante fissazione chimica per l'imaging fluorescente a raggi X.
Introduzione
X-ray fluorescenza consente sia l'identità e la quantità di elementi presenti in un campione da spazialmente risolto. Incidente raggi X, di una energia selezionata per essere maggiore dell'energia dell'elemento più pesante di interesse vincolante elettroni, superare l'energia di legame degli elettroni interno-shell al nucleo 1. Questo crea un 'buco' nel guscio di elettroni. Come elettroni ad alta energia cadono in questi fori, raggi X fluorescenti sono emessi cui lunghezza d'onda dipende dalla separazione dell'energia di tali orbitali. Poiché la spaziatura energia degli orbitali è caratteristica di un dato elemento, l'em....
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Protocollo
1. Preparazione di strumenti, Substrati, Culture Media e Piatti
- Gestione delle finestre nitruro di silicio (Si 3 N 4).
- Aprire la capsula leggermente spremitura un'estremità contenente la finestra in modo tale da non comprimere finestra stessa, ruotando l'altra estremità della capsula con l'altra mano.
- Controllare un paio di inversione, pinzette dalla punta sottile sotto stereomicroscopio per assicurarsi che non ci siano adesivi, lacune o curve sulla punta. In caso contrario, le finestre possono essere rotti dalle pinzette o il distacco di loro durante le fasi successive.
- Rimuovere la finestra d....
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Risultati
La capacità dell'imaging fluorescenza a raggi X per fornire informazioni sui campioni biologici è subordinato questi campioni essere preparati in modo tale che essi sono robusti alle radiazioni sulla scala temporale dell'esperimento, e tuttavia la loro caratteristiche chimiche e strutturali sono ben conservato. Nella visualizzazione del risultato di un campione che è stato preparato come sopra descritto e illustrato, è possibile vedere che c'è variazione degli elementi presenti - indica che la fissazione con.......
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Discussione
X-ray imaging di fluorescenza è utile in molti campi, tra cui geoscienze, scienza dei materiali e biologia chimica 26-34. Advances in raggi X di sincrotrone, e la loro messa a fuoco, hanno prodotto molto fasci ad alta intensità. Focused X-ray travi sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule ora esistono, segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore al silicio deriva produzione. E studio della biologia chimica di metalli nella cella è un'applicazione i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Stefan Vogt per la sua assistenza nell'adattamento dei dati rappresentativi mostrati in questo articolo, e per le utili discussioni. Gli autori ringraziano anche Chris Jacobsen per il suo sostegno a Q. J.
L'uso della sorgente di fotoni avanzata, linee di luce 2-ID-E e 8-BM-B, presso l'Argonne National Laboratory è stato supportato dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Ufficio della Scienza, Ufficio delle Scienze dell'Energia di Base, nell'ambito del Contratto No. DE-AC02-06CH11357.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Finestre in nitruro di silicio | Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Regno Unito | SiRN-5.0-200-2.0-200. Ordina per taglia. Dimensioni della membrana: 1,5 mm x 1,5 mm. Spessore: 200 Nm. Dimensioni del telaio: 5 mm x 5 mm. Spessore del telaio: 200 µm. | Fonte alternativa: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA. |
| Pinzetta inversa Microscopia | elettronica Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – Pinzette ultra fini |
| Tappetino a griglia in gomma | Microscopia elettronica Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 71170 | Tappetino a griglia rotonda |
| Acido acetico | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | 338826 | di acido acetico |
| TUBI per metalli | in tracceSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | P6757 | tampone solid PIPES |
| Soluzione madre di formaldeide | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 fiale da 10 ml di paraformaldeide acquosa al 20% |
Riferimenti
- Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
- Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
- Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 6....
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Ristampe e permessi
