Articolo metodologico

Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare

DOI:

10.3791/52385

⸱

28 febbraio 2015

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1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

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Le zanzare che trasmettono la malaria hanno una serie di caratteristiche epidemiologicamente importanti che possono essere rilevate solo utilizzando tecniche molecolari. Utilizzando una piattaforma di genotipizzazione SNP basata su MALDI-TOF, abbiamo sviluppato un test per rilevare simultaneamente più tratti chiave (specie, resistenza agli insetticidi, infezione da parassiti e scelta dell'ospite) dei vettori della malaria.

Abstract

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Il complesso di specie Anopheles gambiae include il principale malaria trasmissione zanzare in Africa. Poiché queste specie sono di tale importanza medica, alcuni tratti sono tipicamente caratterizzati mediante saggi molecolari per aiutare negli studi epidemiologici. Queste caratteristiche includono l'identificazione delle specie, resistenza agli insetticidi, lo stato di infezione del parassita, e la preferenza di accoglienza. Dal momento che le popolazioni del complesso Anopheles gambiae sono morfologicamente indistinguibili, una reazione a catena della polimerasi (PCR) è tradizionalmente utilizzato per identificare le specie. Una volta che la specie è nota, alcuni saggi a valle sono regolarmente eseguiti per chiarire ulteriori caratteristiche. Ad esempio, le mutazioni note come KDR in un gene para conferiscono resistenza contro DDT e insetticidi piretroidi. Inoltre, saggi immunoenzimatici (ELISA) o Plasmodium rilevazione del DNA del parassita PCR sono utilizzati per rilevare i parassiti presenti nei tessuti di zanzara. Infine, un combination di PCR e di restrizione con enzimi può essere usato per spiegare la preferenza host (ad esempio, umano contro sangue animale) per lo screening le farine di sangue di zanzara per DNA specifiche dell'host. Abbiamo sviluppato un saggio multi-rilevamento (MDA) che unisce tutti i saggi suddetti in un singolo multiplex 33SNPs reazione genotipizzazione per 96 o 384 campioni per volta. Perché il MDA include più marcatori per le specie, il rilevamento Plasmodium, e l'identificazione del sangue di accoglienza, la possibilità di generare falsi positivi o negativi è notevolmente ridotto da saggi precedenti che comprendono un solo marcatore per tratto. Questo test robusto e semplice può rilevare questi tratti zanzara chiave conveniente e in una frazione del tempo di saggi esistenti.

Introduzione

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Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae sono i vettori principali responsabili della trasmissione della malaria in Africa 1. Queste tre specie sono morfologicamente indistinguibili 2 e si distinguono solo per saggi molecolari 3-9. In aggiunta, ci sono molti saggi a valle di routine condotte per aiutare genetica epidemiologici e demografici studi. Questi includono (1) un test di genotipizzazione per le isole di speciazione 10-12, (2) un test di genotipizzazione riconoscere SNP non sinonimo del 1014 ° aminoacido posizione codone del gene para (la resistenza knock-down, o KDR, SNP) 13 -18, (3) l'individuazione dei parassiti PCR 19-23, e (4) di screening per il DNA specifiche dell'host in midguts zanzara 24,25.

Abbiamo sviluppato un saggio multi-rilevamento (MDA) che unisce tutti questi saggi in una singola reazione multiplex con l'obiettivo di unalyzing caratteristiche epidemiologicamente importanti vettori della malaria in Africa. Il saggio MDA include più marcatori per la rilevazione (1) specie (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, o altro (nessuno dei tre)), (2) resistenza agli insetticidi rappresentato in KDR SNPs (sia L1014F e L1014S) , (3) presenza di due importanti parassiti della malaria, Plasmodium falciparum e P. vivax, e (4) fonte di sangue da un aviaria e sei ospiti mammiferi.

Tradizionalmente, questi saggi sono stati condotti in reazioni a catena della polimerasi separati. Quando tutti questi test vengono effettuati utilizzando una piattaforma tradizionale PCR, che richiede lo svolgimento di 8-10 PCR test di reazione e di accompagnamento gel elettroforesi passi. Ogni individuo reazione PCR dalla preparazione alla documentazione dei risultati richiede 4-5 ore, mentre il metodo MDA presentato qui richiede circa 5 ore nella sua totalità. Ciò equivale a un risparmio del 90% del costo del lavoro da solo. La MDA presentata qui costa 5 dollariper campione al genotipo tutti i 33 SNP. Questo è molto meno costoso che i test singoli a base di gel di agarosio, che costa circa $ 1.50 per campione. Saggi di rivelazione tutte le caratteristiche oggetto della MDA richiederebbe un minimo di 8-10 saggi basati gel di agarosio separati ad un costo di $ 12-15 per campione. Inoltre, la MDA riduce notevolmente la possibilità di generare un falso positivo o negativo utilizzando almeno tre marcatori per ogni rilevazione parassita o fonte host.

La piattaforma abbiamo utilizzato non è limitata a vettori malaria ma può essere utilizzato in un'ampia varietà di applicazioni come medicina, medicina veterinaria e biologia di base 26-28. Approfondimenti di associazione o di genetica di popolazione studi che coinvolgono un grande (in ordine di 100s) numero di campioni richiedono analisi di costo-efficacia di screening per più marcatori contemporaneamente. La maggior parte degli studi che utilizzano due o più PCR separati potrebbero attuare la MDA per risultati più rapidi a un costo inferiore.

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Protocollo

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1. PCR Amplificazione

  1. Mescolare tutti i primer PCR (Vedi Tabella supplementare S1) in una provetta 1,5 ml. Ogni SNP ha due primer (avanti e indietro). Assicurarsi che la concentrazione azione di ciascun primer PCR è mantenuta a 100 micron. Rendere abbastanza mix primer per 500-1.000 reazioni di ridurre il pipettaggio errore e il tempo al banco (Vedi Tabella supplementare S2). Se lo si desidera, preparare aliquote per 100-200 reazioni per tubo e conservare a -20 ° C.
  2. Preparare PCR cocktail come descritto nel protocollo del produttore (Tabella 1). Il volume per 96 reazioni include una sporgenza del 20%. Vortex la provetta contenente il cocktail PCR leggermente e centrifugare per 30 secondi a 2.000 x g.
  3. Dispensare 3 ml di cocktail PCR in ciascun pozzetto di una non-costeggiava 96 pozzetti. Una pipetta ripetitore può risparmiare tempo per questo processo.
  4. Aggiungere 2 ml di DNA genomico appropriato di zanzare in ciascun pozzetto.
    NOTA: Processo di ottenere DNA genomico da m tessuti osquito (testa / torace, addome o il corpo intero) vengono descritti in altre letterature 29-32. Scegli un protocollo di estrazione del DNA opportuno differenziare quelli con Plasmodium nel sangue (addome) da zanzare infettive (Plasmodium nella testa / torace). Usiamo tipicamente DNA estratto da parti del corpo (testa / torace o addome) di zanzare, quindi la concentrazione di DNA varia da 0.05-2ng / ml. Anche se l'ingresso DNA totale è inferiore a quella indicata dal produttore (5-10ng / rxn), di solito ottiene robusto SNP chiama dal 98% dei campioni di DNA, senza tutta l'amplificazione del genoma.
  5. Sigillare la piastra, delicatamente miscelare o vortex e centrifugare per 1 min a 370 x g.
  6. Utilizzare il seguente protocollo termociclatore di effettuare l'amplificazione PCR: (1) 94 ° C per 2 min, (2) 94 ° C per 30 sec, (3) 56 ° C per 30 sec, (4) 72 ° C per 1 min , (5) ripetere i (2) - (4) per 45 cicli, (6) 72 ° C per 1 min, e 4 ° C attesa.
_title "> 2. SAP Trattamento

  1. Preparare la soluzione enzimatica SAP in una piastra da 96 pozzetti (vedere Tabella 2). Processo 96 campioni in un piatto. Il volume per 96 reazioni include una sporgenza del 20%.
  2. Vortex la provetta di soluzione enzimatica SAP leggermente e centrifugare per 30 sec a 2.000 x g. Dispensare 2 ml di soluzione SAP enzima in ogni pozzetto. Ancora una volta, una pipetta ripetitore può risparmiare tempo per questo processo.
  3. Sigillare la piastra, delicatamente miscelare o vortex e centrifugare per 1 min a 370 x g. Incubare la piastra come segue: (1) 37 ° C per 40 min, (2) 85 ° C per 5 minuti per inattivare l'enzima, (3) 4 ° C attesa. Al termine di questa fase, conservare la piastra a -20 ° C prima di continuare. Elaborare il piatto memorizzato entro 2 settimane.

3. SNP Extension

  1. Se la piastra campione viene congelato dopo il trattamento SAP, consentirà di scongelare a RT prima di procedere.
  2. Preparare la miscela di primer extension (Supplemental Tabella S2). Ogni SNP ha uno extension primer. Mantenere la concentrazione azione di ciascun primer estensione a 500 micron. Facoltativamente, aliquota per 100-200 reazioni per tubo e conservare a -20 ° C.
  3. Preparare mix estensione, come descritto nella Tabella 3. Il volume di reazione 96 comprende una sporgenza di 20%.
  4. Vortex tubo di estensione cocktail leggermente e centrifugare per 30 sec a 2.000 x g. Dispensare 2 ml di cocktail estensione in ogni pozzetto. Ancora una volta, una pipetta ripetitore può risparmiare tempo per questo processo.
  5. Sigillare la piastra, delicatamente miscelare o vortex e centrifugare per 1 min a 370 x g. Thermocycle piastra come mostrato in Figura 1. A questo punto, procedere alla spettrometria di massa o conservare la piastra a -20 ° C fino a 2 settimane.

4. Condizionamento della SNP Extension prodotto per ottimizzare l'analisi Spettrometria di Massa

  1. Se la piastra campione viene congelato dopo estensione SNP, consentirà di scongelare a RT prima di procedere.
  2. Trasferire 15mg di resina dalla sua container sulla piastra fossetta utilizzando un cucchiaio allungata. Utilizzare il raschietto per diffondere la resina nei pozzetti della piastra fossetta. Sweep il raschietto da parte a parte attraverso la piastra fossetta per diffondere la resina. Assicurarsi che ci sia la resina in ogni pozzetto.
  3. Raschiare resina in eccesso dal piatto fossetta con il raschietto. Lasciate riposare la resina nella piastra fossetta per almeno 20 min. Mentre la resina lasciando riposare nella piastra fossetta, aggiungere 41 ml di acqua per HPLC a ciascun pozzetto della piastra campione.
  4. Inserire delicatamente la piastra del campione capovolta, sulla piastra fossetta. Assicurarsi che il ripristino del campione piatto contro il piccolo posto arrotondata della piastra fossetta, che allinea i pozzi nella piastra campione con i pozzi nella piastra fossetta.
  5. Tenendo la piastra del campione e la piastra fossetta insieme, delicatamente capovolgere così la resina cade dalla piastra fossetta nei pozzetti della piastra del campione. Toccare la piastra fossetta così la resina cade nel piatto del campione. Assicurarsi che tutti la resina in diPiastra mple cade nei pozzetti della piastra del campione. Centrifugare la piastra a 3.200 g per 30 sec.
  6. Ruotare piatto del campione su un rotatore per 5 minuti a RT. Rotator deve ruotare il piatto del campione a 360 ° su l'asse lungo.
  7. Centrifugare la piastra campione a 3.200 g per 5 min. Dopo questa fase, la piastra di campione a -20 ° C fino a 2 settimane prima di procedere alla fase successiva.

5. MALDI-TOF spettrometria di massa

  1. Trasferire il prodotto estensione SNP condizionata su un bioarray come SpectroCHIP secondo le istruzioni del produttore. Usiamo MassARRAY Nanodispenser per questo passo.
  2. Una volta completato il trasferimento, definire come saggi e piatti sono da istituire nel database test. Assegnare un nome al test e le piastre in modo tale che ogni piatto ha identificatore univoco che collega a specifici test di progettazione (Supplemental Tabella S3).
  3. Dopo dosaggio e la piastra sono state definite, acquisire spettri utilizzando uno spettrometro di massa.

6. Analisi dei dati

  1. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando un software in tempo reale l'interpretazione dei dati di analisi PCR come Typer Analyzer o TyperViewer (Sequenom). Ottenere i dati in formato .xml che contiene il layout di esempio, spettrogramma di massa per ogni bene, le informazioni marcatore tra cui nome, di massa prevista per ogni variante del corrispondente SNP, e qualsiasi errore o messaggi di avviso associati a ogni reazione. Vedere la Figura 2 per la risultante spettrogramma di massa.
  2. Effettuare analisi SNP genotipo di clustering impostando la soglia di rilevazione (ampiezza o rapporto segnale rumore) e la tolleranza / varianza consentita per ciascun genotipo. La figura 3 mostra un esempio di un 04707-KDR # 2 SNP cluster genotipo.
  3. Esportare le conseguenti SNP chiamate genotipo in un foglio di calcolo.

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Risultati

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Identificazione di specie:

I seguenti 5 SNPs identificano tre specie (A. arabiensis, A. coluzzii e A. gambiae) (Tabella 4). Se un campione non è una delle tre specie, i tre SNPs (01073-213, 04679-157 e 10313 -052) non riescono ad amplificare.

KDR genotipo per inferire resistenza agli insetticidi:

Il 1014 ° codone del canale del sodio voltaggio-dipendenti para...

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Discussione

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La MDA è composto da cinque fasi principali: PCR amplificazione, fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) di reazione, di estensione SNP, prodotto di estensione di condizionamento, e matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione - tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa 33-37. Il primo passo di amplificazione PCR amplifica DNA che fiancheggia ogni SNP in modo che abbastanza DNA modello sarà disponibile al passo estensione SNP. La reazione SAP neutralizza dNTP inutilizzati che possono interferire con i...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Drs. Anthony Cornel e Laura Norris alla UC Davis e il Dr. Katharina Kreppel presso l'Università di Glasgow per la fornitura di esemplari di zanzara da Tanzania. Ringraziamo la signora Smita Das e il dottor Douglas Norris dalla Johns Hopkins School of Public Health per la condivisione di campioni di zanzara da Zambia. Ringraziamo anche il signor Lee V. Millon al Veterinary Genetics Laboratorio di formazione sulla progettazione del test. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere R01AI 078.183 e R21AI062929.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MassARRAY Analyzer CompactSequenomMT9Spettrometria di massa MALDI-TOF per applicazioni genomiche per l'analisi degli acidi nucleici.
MassARRAY NanodispenserSequenomRS1000Trasferisce i prodotti di reazione iPLEX completati al set di
reagenti per genotipizzazione SpectroCHIP iPLEX GoldSequenom10158Reagenti utilizzati per il test iPLEX, incluso il kit SAP.

Riferimenti

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