Le zanzare che trasmettono la malaria hanno una serie di caratteristiche epidemiologicamente importanti che possono essere rilevate solo utilizzando tecniche molecolari. Utilizzando una piattaforma di genotipizzazione SNP basata su MALDI-TOF, abbiamo sviluppato un test per rilevare simultaneamente più tratti chiave (specie, resistenza agli insetticidi, infezione da parassiti e scelta dell'ospite) dei vettori della malaria.
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Articolo metodologico
Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il complesso di specie Anopheles gambiae include il principale malaria trasmissione zanzare in Africa. Poiché queste specie sono di tale importanza medica, alcuni tratti sono tipicamente caratterizzati mediante saggi molecolari per aiutare negli studi epidemiologici. Queste caratteristiche includono l'identificazione delle specie, resistenza agli insetticidi, lo stato di infezione del parassita, e la preferenza di accoglienza. Dal momento che le popolazioni del complesso Anopheles gambiae sono morfologicamente indistinguibili, una reazione a catena della polimerasi (PCR) è tradizionalmente utilizzato per identificare le specie. Una volta che la specie è nota, alcuni saggi a valle sono regolarmente eseguiti per chiarire ulteriori caratteristiche. Ad esempio, le mutazioni note come KDR in un gene para conferiscono resistenza contro DDT e insetticidi piretroidi. Inoltre, saggi immunoenzimatici (ELISA) o Plasmodium rilevazione del DNA del parassita PCR sono utilizzati per rilevare i parassiti presenti nei tessuti di zanzara. Infine, un combination di PCR e di restrizione con enzimi può essere usato per spiegare la preferenza host (ad esempio, umano contro sangue animale) per lo screening le farine di sangue di zanzara per DNA specifiche dell'host. Abbiamo sviluppato un saggio multi-rilevamento (MDA) che unisce tutti i saggi suddetti in un singolo multiplex 33SNPs reazione genotipizzazione per 96 o 384 campioni per volta. Perché il MDA include più marcatori per le specie, il rilevamento Plasmodium, e l'identificazione del sangue di accoglienza, la possibilità di generare falsi positivi o negativi è notevolmente ridotto da saggi precedenti che comprendono un solo marcatore per tratto. Questo test robusto e semplice può rilevare questi tratti zanzara chiave conveniente e in una frazione del tempo di saggi esistenti.
Introduzione
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae sono i vettori principali responsabili della trasmissione della malaria in Africa 1. Queste tre specie sono morfologicamente indistinguibili 2 e si distinguono solo per saggi molecolari 3-9. In aggiunta, ci sono molti saggi a valle di routine condotte per aiutare genetica epidemiologici e demografici studi. Questi includono (1) un test di genotipizzazione per le isole di speciazione 10-12, (2) un test di genotipizzazione riconoscere SNP non sinonimo del 1014 ° aminoacido posizione codone del gene para (la resistenza knock-....
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Protocollo
1. PCR Amplificazione
- Mescolare tutti i primer PCR (Vedi Tabella supplementare S1) in una provetta 1,5 ml. Ogni SNP ha due primer (avanti e indietro). Assicurarsi che la concentrazione azione di ciascun primer PCR è mantenuta a 100 micron. Rendere abbastanza mix primer per 500-1.000 reazioni di ridurre il pipettaggio errore e il tempo al banco (Vedi Tabella supplementare S2). Se lo si desidera, preparare aliquote per 100-200 reazioni per tubo e conservare a -20 ° C.
- Preparare PCR cocktail come descritto nel protocollo del produttore (Tabella 1). Il volume per 96 reazioni include una sporgenza del 20%. Vortex la provetta contenente il cocktail PCR....
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Risultati
Identificazione di specie:
I seguenti 5 SNPs identificano tre specie (A. arabiensis, A. coluzzii e A. gambiae) (Tabella 4). Se un campione non è una delle tre specie, i tre SNPs (01073-213, 04679-157 e 10313 -052) non riescono ad amplificare.
KDR genotipo per inferire resistenza agli insetticidi:
Il 1014 ° codone del canale del sodio voltaggio-dipendenti para.......
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Discussione
La MDA è composto da cinque fasi principali: PCR amplificazione, fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) di reazione, di estensione SNP, prodotto di estensione di condizionamento, e matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione - tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa 33-37. Il primo passo di amplificazione PCR amplifica DNA che fiancheggia ogni SNP in modo che abbastanza DNA modello sarà disponibile al passo estensione SNP. La reazione SAP neutralizza dNTP inutilizzati che possono interferire con i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Drs. Anthony Cornel e Laura Norris alla UC Davis e il Dr. Katharina Kreppel presso l'Università di Glasgow per la fornitura di esemplari di zanzara da Tanzania. Ringraziamo la signora Smita Das e il dottor Douglas Norris dalla Johns Hopkins School of Public Health per la condivisione di campioni di zanzara da Zambia. Ringraziamo anche il signor Lee V. Millon al Veterinary Genetics Laboratorio di formazione sulla progettazione del test. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere R01AI 078.183 e R21AI062929.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | Spettrometria di massa MALDI-TOF per applicazioni genomiche per l'analisi degli acidi nucleici. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Trasferisce i prodotti di reazione iPLEX completati al set di |
| reagenti per genotipizzazione SpectroCHIP iPLEX Gold | Sequenom | 10158 | Reagenti utilizzati per il test iPLEX, incluso il kit SAP. |
Riferimenti
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gamb....
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Ristampe e permessi
