Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l'analisi di linfociti infiltranti

Summary

Questo protocollo descrive la rapida dissociazione non enzimatica di frammenti di tessuto umano fresco per la valutazione qualitativa e quantitativa delle cellule CD45⁺ (linfociti/leucociti) presenti in vari tessuti umani normali e maligni. Inoltre, il surnatante ottenuto dall'omogenato del tessuto primario può essere raccolto e conservato per ulteriori analisi o sperimentazioni.

Abstract

La capacità delle cellule maligne di eludere il sistema immunitario, caratterizzata dalla fuga del tumore da entrambe le risposte immunitarie innate e adattative, è ormai accettato come un importante segno distintivo di cancro. La nostra ricerca sul cancro al seno si concentra sul ruolo attivo che tumorali infiltranti linfociti svolgono nella progressione tumorale e outcome dei pazienti. Verso questo obiettivo, abbiamo sviluppato una metodologia per la rapida isolamento delle cellule linfoidi intatte dai tessuti normali e anormali nel tentativo di valutarli in prossimità al loro stato originario. Omogenati preparati utilizzando un dissociatore spettacolo meccanico sia aumentata la vitalità delle cellule e di recupero, mantenendo l'espressione del recettore di superficie rispetto tessuti enzima-digerite. Inoltre, la digestione enzimatica del materiale insolubile restante non ha recuperato CD45 ⁺ cellule supplementari indicano che le misurazioni quantitative e qualitative nella omogeneizzato primario probabile riflettano effettivamente sottopopolazioni infiltrano nel Fragm tessutient. Le cellule linfoidi in questi omogenati possono essere facilmente caratterizzata usando immunologica (fenotipo, proliferazione, etc.) o molecolare (DNA, RNA e / o proteine) approcci. Cellule CD45 ⁺ possono essere utilizzati anche per la purificazione sottopopolazione, l'espansione in vitro o crioconservazione. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è che il supernatante tessuto primaria da omogenati può essere utilizzato per caratterizzare e confrontare citochine, chemochine, immunoglobuline e antigeni presenti in tessuti normali e maligni. Questa funzione di protocollo estremamente bene per i tessuti mammari umani e dovrebbero essere applicate a una vasta gamma di tessuti normali e anormali.

Introduction

Il microambiente tumorale è composto da vari tipi di cellule con numerosi studi che dimostrano che ognuno di essi svolge un ruolo distinto e importante nella tumorigenesi^1,2. Questi includono, ma non sono limitati a, cellule immunitarie infiltranti, cellule stromali, cellule endoteliali e cellule tumorali³. Studi ex vivo sui linfociti infiltranti il tumore (TIL; Le cellule CD45⁺ o leucociti, che sono prevalentemente linfociti nei tumori al seno) da campioni di tessuto umano fresco sono rese difficili dalla loro bassa frequenza, dalle piccole dimensioni dei campioni spesso disponibili per la ricerca e dalla potenziale perdita di vitalità durante l'estrazione. Poiché le cellule immunitarie che infiltrano i tumori sono solitamente presenti come passeggeri piuttosto che come residenti permanenti, in generale sono più facili da rilasciare dalla matrice tissutale.

Dissociare il tessuto tumorale mantenendo l'integrità cellulare è tecnicamente impegnativo ed è stato tradizionalmente eseguito utilizzando una combinazione di passaggi meccanici ed enzimatici per preparare sospensioni a singola cellula^4-8. Questo approccio comporta lunghi periodi di incubazione ed è associato a una significativa riduzione della vitalità cellulare, nonché alla perdita dei recettori della superficie cellulare per scissione enzimatica. Gli studi di citofluorimetria di alta qualità che caratterizzano la TIL nel microambiente tumorale, così come le purificazioni pulite delle sottopopolazioni CD45⁺ mediante citometria a flusso o perle rivestite di anticorpi, sono più difficili da ottenere dal tessuto tumorale digerito con enzimi. Inoltre, il surnatante (SN) dell'omogenato tumorale risultante non è suscettibile di ulteriori analisi, compresa la quantificazione delle proteine secrete (citochine, chemochine, immunoglobuline o antigeni tumorali) o il trattamento sperimentale di cellule normali, a causa del potenziale di degradazione delle proteine nei digestati enzimatici.

Nella nostra ricerca di un metodo per preparare omogeneizzati a singola cellula da tessuti mammari [inclusi tessuti mammari tumorali, non tumorali non adiacenti (NANT) e normali (da riduzioni mammarie)] senza digestione enzimatica, abbiamo testato una varietà di tecniche di omogeneizzazione meccanica. Gli omogenati preparati utilizzando un dissociatore meccanico hanno aumentato la vitalità cellulare (2 volte) e il recupero cellulare totale (2 volte), preservando l'espressione del recettore di superficie. La digestione enzimatica del materiale insolubile rimanente non ha recuperato ulteriori cellule CD45⁺, suggerendo che sono state tutte rilasciate nell'omogeneizzato iniziale. Pertanto, questo approccio rapido e semplice consente una valutazione sia qualitativa che quantitativa delle sottopopolazioni CD45⁺ presenti in vari tessuti umani normali e maligni. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è che il SN dell'omogenato iniziale (SN del tessuto primario) può essere raccolto e conservato per ulteriori analisi o sperimentazioni.

Protocol

NOTA: Tutti i campioni sono stati acquisiti utilizzando un protocollo approvato dal Comitato Etico Medico dell'Istituto Jules Bordet con il consenso informato scritto ottenuto da ogni paziente.

1. Preparazione del tessuto omogenato

1. Sezionare tessuti asportati (tessuto maligno e normale resezione dalla sala operatoria) sono nel laboratorio di patologia da personale qualificato per il ritiro immediato. Tumore, NANT (presa la distanza maggiore dal tumore possibile) e frammenti di tessuto normale sono comunemente trattati nell'ambito 1 - 3 ore di escissione chirurgica in un laboratorio BSL2 utilizzando le procedure di biosicurezza standard per tessuti umani. Un diagramma di flusso del protocollo è illustrato in Figura 1.
2. Pesare tutti i frammenti di tessuto (normali, NANT e tumorali) e misurare la lunghezza, la larghezza e l'altezza (lunghezza x larghezza x altezza). Questo è un passo importante per la successiva normalizzazione delle sottopopolazioni di cellule, RNA estratto, etc.
   NOTE: La gamma di dimensione del campione è di 100 a 10.000 mm ³ senza grassi, se possibile.
3. Colophon il frammento tumorale su un vetrino per H & E colorazione per verificare che il tessuto è in realtà parte del tumore.
   1. Fare questo premendo un microscopio vetrino sul frammento tumore e applicando una leggera pressione con le dita per qualche secondo.
   2. Fissare la diapositiva con isopropanolo per 2 min seguita da una fase di lavaggio in acqua. Controcolorare il tessuto per 30 secondi con ematossilina di Mayer.
   3. Lavare il vetrino in sei vasche di acqua. Colorare in Floxina B 2% per 15 sec.
   4. Lavare in un bagno di acqua seguita da quattro bagni di isopropanolo e finire con un bagno di acqua.
   5. Incubare in isopropanolo per 1 min e scarico. Chiaro in due bagni di xilene.
   6. Montare con mezzo di montaggio a base di xilene. Esaminate per cellularità tumorale (Figura 2).
      NOTA: Principalmente, le cellule tumorali attaccano alla diapositiva impresso - stromale, linfoide o annuncioipose cellule rimangono raramente, lasciando spazi tra le cellule tumorali (Figura 2).
4. Posizionare il frammento di tessuto in un piccolo piatto di coltura contenente 1 ml di, mezzo di cellule ematopoietiche senza siero chimica definita (di seguito denominato medio) a temperatura ambiente e tagliare a dadini in piccoli pezzi (~ 1 - 2 mm ²⁾ con una sterile bisturi.
5. Trasferire tutto (frammenti di tessuto + media) per un tubo meccanico dissociatore C.
6. Lavare la piastra di Petri e bisturi con 2 ml di terreno con una pipetta Pasteur e aggiungere questo al tubo C (volume del mezzo per la dissociazione = 3 ml).
7. Utilizzare il A.01 meccanica programma dissociatore per tubi C (il programma più delicato) per rendere omogenei i frammenti di tessuto in una sospensione di cellule singole. Posizionare il tubo C nell'apparato ed eseguire il programma due volte in successione (un ciclo = 25 sec).
   NOTA: Questa procedura omogeneizzazione è stata stabilita e convalidato per il tessuto mammario umano, altro tumo o tessuto tipi può essere necessario utilizzare un programma diverso e dovrebbe essere testato prima.
8. Rimuovere il tubo C dall'apparato e decantare l'omogenato direttamente in una cella di filtro 40 micron seduto su un tubo da 50 ml. Utilizzando la stessa pipetta Pasteur come al punto 1.6, trasferire eventuali residui di liquido nel tubo C al filtro cella.
9. Trasferire il liquido filtrato in un tubo da 15 ml con una punta micropipetta 1 ml. Mantenere temporaneamente il filtro delle cellule e il suo tubo da 50 ml.
10. Risciacquare il tubo C con ulteriori 3 ml di terreno e trasferire questo, sempre con la stessa pipetta Pasteur come al punto 1.6, al filtro cella ancora seduto sul tubo 50 ml. Spremere un importo massimo del liquido residuo intrappolato nel tessuto unhomogenized nel tubo 50 ml muovendo delicatamente attorno al filtro con una pipetta Pasteur pulita o 1 ml punta che viene successivamente gettato via per evitare di contaminare l'eluato.
11. Posizionare il filtro cellulare a testa in giù su tegli tubo C originale e lavare con 3 ml di terreno in modo che il tessuto unhomogenized scende nel tubo C.
12. Re-omogeneizzare come al punto 1.7 per due cicli del programma A.01.
13. Versare questa seconda omogenato attraverso il filtro cellulare seduto sul tubo 50 ml, risciacquare il tubo C nuovo con 3 medio ml (passo 1.10) e trasferire con la pipetta Pasteur al filtro cellulare seduto sul tubo 50 ml nuovo spremitura massimo quantità di liquido dal tessuto connettivo residua rimasta intrappolata nel filtro cella.
14. A questo punto, un volume di 2,5 ml è ~ nel tubo 15 ml e ~ 9 ml nel tubo 50 ml.

2. Separazione del surnatante tessuti e cellule

1. Centrifugare omogenati nei 15 ml e 50 ml provette per 15 min a 600 xg a temperatura ambiente.
2. Decantare il SN dal tubo 15 ml in una provetta pulita e memorizzare temporaneamente a 4 ° C. Questo surnatante = tumore primario, o ti NANT normaleSSUE SN (volume finale di 2,5 ml) viene successivamente chiarito e aliquotati prima di conservazione a -80 ° C per le analisi future (vedi sotto).
3. Eliminare il surnatante dal tubo 50 ml.
4. Risospendere delicatamente entrambi pellet di cellule in un volume finale di 1 ml di mezzo. Brevemente, prima delicatamente rompere il pellet cellulare in entrambi i tubi (toccando il tubo su una superficie dura). Risospendere il pellet di cellule sciolto in 50 ml con 500 ml di medio e trasferire la sospensione cellulare al tubo 15 ml per risospendere il pellet secondo. Ripetere questo passaggio una volta con il secondo 500 ml di media per il massimo recupero di cellule.
5. Trasferire 10 ml di sospensione cellulare per un piccolo tubo, mescolare con 10 ml di trypan blu (diluizione 1: 1) e contare il numero di cellule vitali mediante un emocitometro.
   NOTA: A questo punto una frazione della sospensione cellulare può essere analizzata mediante citometria di flusso per valutare la dimensione della cella, granularità ed eventualmente un numero limitato di marcatori sottopopolazione per maggiori precvalutazione ise della distribuzione cella relativa nel omogeneizzato prima vasta analisi o sperimentazioni. Tutte le analisi di citometria a flusso incorporano etichettatura CD45 per la normalizzazione delle sottopopolazioni.
6. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule del tumore, NANT, o tessuti normali sono ora pronti per essere ulteriormente purificati o analisi. Questi passaggi aggiuntivi sono migliori quando eseguite nello stesso giorno come la chirurgia.
   NOTA: Per l'analisi di citometria di flusso, ma non di separazione delle cellule dei globuli rossi residue dovrebbero essere lisati dopo etichettatura anticorpo aggiungendo 0,4 ml di tampone di lisi dei globuli rossi per il pellet, immediatamente vortex per 1 sec e incubando un minimo di 10 min a camera temperatura (protetto dalla luce) prima dell'analisi.

3. Precisazione del surnatante Tissue

1. Centrifugare le provette da 1,5 ml con SN tessuto a 15.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
2. Rimuovere accuratamente tegli surnatante senza toccare o disturbare il pellet. Trasferire in una provetta pulita (o tubi) a seconda del numero e del volume di aliquote desiderati.
3. Conservare il supernatante a -80 ° C per un uso futuro.

4. Il sangue del paziente

1. Raccogliere un campione di sangue da ogni paziente come un controllo mediante prelievo venoso in provette eparinizzate il giorno prima dell'intervento. Centrifugare il sangue a 400 xg per 10 min a 20 ° C con il freno fuori per ottenere plasma e un buffy coat.
2. Rimuovere il plasma e chiarire che per centrifugazione a 10.000 xg per 15 min a 20 ° C. Aliquotare e conservare plasma a -80 ° C per un uso futuro. Diluire il buffy coat in mezzo
3. Separare le cellule mononucleari utilizzando standard di Ficoll-Hypaque gradiente centrifugazione prima dell'analisi immediata, isolamento sottopopolazione, DNA / RNA estrazione / proteine ​​o crioconservazione.

5. Citometria a flusso

1. Cellule etichetta secondo la produzioneistruzioni di r a 4 ° C, al riparo dalla luce. Lisare globuli rossi in sospensioni cellulari da frammenti di tessuto dopo l'etichettatura di anticorpi con l'aggiunta di 0,4 ml di tampone di lisi cellulare al pellet.
2. Vortex immediatamente per 1 sec e incubare un minimo di 10 min a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Passare le cellule marcate in un citofluorimetro per l'acquisizione dei dati senza lavaggio.

Results

La digestione enzimatica di frammenti di tessuto sia con soluzioni disponibili in commercio dissociazione tessuto o varie miscele di laboratorio di collagenasi, DNasi e / o inibitori ialuronidasi, unirà un'ampia varietà di recettori presenti sulla superficie delle cellule. I nostri studi, inizialmente concentrati sulle cellule CD4 ⁺ T infiltranti i tumori al seno, sono stati rapidamente presentati con un grave problema tecnico dovuto alla scissione dei recettori CD4 superficie utilizzando enzimatici standard ...

Discussion

Questo studio descrive un metodo ottimizzato per la rapida preparazione di normali e maligne omogenati di tessuto mammario senza digestione enzimatica per la successiva separazione delle cellule, l'estrazione, la crioconservazione e / o l'analisi fenotipica di CD45 ⁺ sottopopolazioni. L'obiettivo di questo approccio sperimentale è quello di produrre immagini della TIL che riflettono strettamente il loro stato in vivo e confrontarle con tessuti normali con la manipolazione minima dei tessu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine è in qualche modo equivalente
Centrifuga 5810 R	Eppendorf		o altra centrifuga da tavolo standard
Centrifuga 5417 R	Eppendorf		o altra microcentrifuga standard
Esco Classe II A2 Biosafety Cabinet	ESCO globale		o altra cappa
BSL2 standardMicroscopio invertito	Nikon eclipse TS100		o altro microscopio compatibile per un emacitometro
Bü Camera di	Marienfield	640210	o altro ematocitometro standard
Citometro a flusso Navios	Beckman Coulter		o altro citometro a flusso (8-10 colori consigliati)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine utilizza Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72.710	o altri materiali plastici non pirogeni
Bisturi monouso	Swann-Morton	0510	o bisturi sterile monouso standard
BD Cell Strainer 40 & micro; m	Becton Dickinson	734-0002	o altra plastica apirogena
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	o altra plastica apirogena
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	o altra plastica apirogena
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	o altra plastica apirogena
Sterile Pasteur Pipetta 5 ml	VWR	612-1685	o altra plastica apirogena
Tubo per microfuga 1,5 ml	Eppendorf	7805-00	o altra plastica apirogena
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	terreno privo di siero consigliato
Soluzione salina tamponata con fosfato	Lonza	BE17-516F	fisiologico standard PBS
Blu di tripano	VWR	17942E	o altra macchia vitale
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	per esperimenti di citometria a flusso
Fattibilità fissabile Colorante eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	per esperimenti di citometria a flusso
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	per esperimenti di citometria a flusso
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	per esperimenti
di citometria a flussoanti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	per esperimenti di citometria a flusso
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	per esperimenti di citometria
a flusso anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	per esperimenti di citometria a flusso
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	per esperimenti di citometria a flusso
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	per esperimenti di citometria a flusso
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	per esperimenti di citometria a flusso