Articolo metodologico

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

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DOI:

10.3791/52408

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17 febbraio 2015

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1Neuroscience & Behavioral Disorders, Duke-NUS Graduate Medical School, 2Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Viene descritto un protocollo per generare un sistema di co-coltura costituito da neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), neuroni corticali primari e astrociti. Questo sistema di co-coltura consente di rilevare la formazione di contatti sinaptici e circuiti tra nuovi neuroni derivati da iPSC e neuroni corticali preesistenti che esprimono la canalrodopsina-2.

Abstract

Qui descriviamo un protocollo per generare una co-coltura composta da 2 diverse popolazioni neuronali. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) vengono riprogrammate da fibroblasti umani utilizzando vettori episomiali. Colonie di iPSC possono essere osservate 30 giorni dopo l'inizio della riprogrammazione dei fibroblasti. Le colonie pluripotenti vengono raccolte manualmente e coltivate in mezzo di induzione neurale per consentire la differenziazione in cellule progenitrici neurali (NPC). Le iPSC si convertono rapidamente in cellule neuroepiteliali entro 1 settimana e mantengono la capacità di autorinnovarsi se mantenute ad un'alta densità di coltura. Le NPC primarie di topo sono differenziate in astrociti dall'esposizione a un terreno contenente siero per 7 giorni e formano un monostrato su cui vengono aggiunti i neuroni corticali di ratto embrionali del giorno 18 (E18) (trasfettati con canalrodopsina-2 (ChR2)). Le NPC umane marcate con la proteina fluorescente, il pomodoro tandem dimero (tdTomato), vengono quindi seminate sulla coltura di astrociti/neuroni corticali il giorno successivo e lasciate differenziare per 28-35 giorni. Dimostriamo che questo sistema forma connessioni sinaptiche tra i neuroni derivati da iPSC e i neuroni corticali, evidenti da un aumento della frequenza delle correnti sinaptiche in seguito alla fotostimolazione dei neuroni corticali. Questo sistema di co-coltura fornisce una nuova piattaforma per valutare la capacità dei neuroni derivati da iPSC di creare connessioni sinaptiche con altre popolazioni neuronali.

Introduzione

Negli ultimi anni, la nostra comprensione del neurone e la funzione del circuito neuronale è stato rivoluzionato da diversi strumenti optogenetic che controllano l'eccitabilità neuronale. Uno di questi strumenti è il canale cationico luce attivato, channelrhodopsin-2 (ChR2): i neuroni che esprimono ChR2 potenziali d'azione il fuoco in risposta alla stimolazione luminosa 1-3. Perché i neuroni non sono normalmente sensibili alla luce, questa notevole capacità apre nuove strade per il controllo preciso temporale e spaziale delle attività delle popolazioni geneticamente definiti di neuroni 4 e ha notevolmente accelerato studi di funzione cerebrale. ChR2 è stata applicata a ricerca sulle cellule staminali per scopi diversi, dal monitoraggio dello sviluppo neuronale 5 a regolare l'attività delle reti neurali 6.

Qui abbiamo usato ChR2 per aumentare l'utilità di un sistema di co-coltura neuronale. Sistemi di co-coltura consentono la valutazione delle interazioni tra diversi tipi di cellule.Co-colture di neuroni e glia, i principali tipi di cellule del sistema nervoso, sono comunemente usati per studiare segnalazione tra questi diversi tipi di cellule, come pure per valutare la significatività di questa segnalazione per le risposte fisiologiche, la propagazione del danno e per esaminare la meccanismi molecolari che sono potenzialmente coinvolti in questa segnalazione 7. Un precedente studio ha rivelato che iPSCs umani si differenziano molto rapidamente in neuroni in presenza di ratto coltura contenente neuroni corticali primarie, astrociti, oligodendrociti, microglia e 8.

In questo protocollo, dimostriamo un metodo che utilizza ChR2 in un sistema di co-coltura di interrogare connessioni sinaptiche tra i neuroni corticali di ratto e neuroni derivati ​​da cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs). Descriviamo passi di sezionare e raccolto tessuti cerebrali 9, nonché per mantenere e differenziare le cellule progenitrici neurali topo (NPC) in astrociti e NPC umani INTo neuroni per creare il sistema di co-coltura. Per stabilire questo sistema di co-coltura, abbiamo utilizzato il metodo di riprogrammazione senza integrazione descritto da Okita et al. 10 per generare iPSCs umani. Questi iPSCs stati poi efficacemente differenziati in NPC in condizioni chimicamente definite utilizzando inibitori piccole molecole come descritto da Li et al. 11

In co-culture, le diverse popolazioni di neuroni possono essere identificate tramite il rilevamento di espressione ChR2 in neuroni corticali e tagging dei neuroni iPSC-derivati ​​tramite la proteina fluorescente, tandem dimero pomodoro (tdTomato). Combinando registrazioni elettrofisiologiche da neuroni COPSI-derivati ​​con fotostimolazione optogenetic dei neuroni corticali consente di valutare la capacità di questi due tipi di neuroni per formare circuiti con l'altro. In particolare, fotostimolazione di ChR2 esprimono neuroni corticali evocare risposte sinaptiche nei neuroni iPSC-derivati ​​che si sono formati i circuiti sinapticicon la rete neurone corticale fotostimolata. Abbiamo dimostrato che l'aumento delle correnti postsinaptiche sono infatti rilevati in neuroni iPSC-derivati ​​in tali condizioni. Questo protocollo permette di valutare circuiteria sinaptica sotto una varietà di condizioni sperimentali, inclusi ricapitolazione diversi modelli di malattie neurologiche utilizzando iPSCs derivati ​​da fibroblasti da pazienti con malattia.

Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti sono effettuati sulla base di protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale a SingHealth.

1. Brains raccolta precoce postnatale mouse

  1. Prima di dissezione, preparare la soluzione di digestione del tessuto dell'ippocampo: 10 microlitri papaina per soluzione salina bilanciata 1 ml 1x di Earle (EBSS) (+ 1% HEPES) con Deoxyribonuclease I (DNasi I) (250 U / ml) e dispasi II (1 U / ml). Rendere circa 2,5 ml della soluzione di digestione tessuti e filtrare utilizzando un'unità 0.20 micron filtro. Mantenere la soluzione calda a 37 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Anestetizzare le postnatale giorno 5 (P5) cuccioli di topi mettendoli in ghiaccio per 5 min. Togliere dal ghiaccio e di prova per il dolore reflex via punta o la coda pizzico. Spruzzare i cuccioli con il 70% di etanolo. Decapitare il cuccioli e posizionare le testine in una capsula di Petri sul ghiaccio.
  3. Effettuare una incisione nella pelle lungo la linea mediana, dalla base del cranio al naso, con un paio di piccolo scissors o pinza sottile dissezione. Sbucciare aprire la pelle e fare un'incisione simile attraverso il cranio. Fare due ulteriori tagli orizzontali su ogni lato del cranio, uno rostrali (al bregma) e una caudale (al lambda).
  4. Peel aprire il cranio lungo le linee incise per esporre il cervello sottostante. Utilizzare un paio di pinze per rimuovere il cranio sovrastante i bulbi olfattivi, e un osso linea mediana tra di loro. Fate questo mentre si tiene la testa stabile con un paio di pinze in mano non-dissezione.
  5. Facilità la parte piatta di una spatola tra la parte ventrale del cervello e la base del cranio all'estremità caudale. Mantenendo la spatola parallela alla base del cranio sotto il cervello, spostarla verso la fine rostrale del cranio di recidere eventuali aderenze tra il cervello e la base del cranio.
    1. Scoop il cervello con la spatola e mettetelo in una capsula di Petri contenente ghiacciata EBSS 1x (+ 1% HEPES). Mantenere i tessuti sommersi in ogni momento.
  6. Per tuttipassi micro-dissezione, lavoro sotto un microscopio da dissezione e utilizzare un paio di belle dissettore in ogni mano, uno per il taglio dei tessuti, e l'altro per la tenuta del tessuto stabile.
  7. Effettuare un taglio solo posteriormente alla corteccia cerebrale per separarlo dal rombencefalo. Tagliare lungo la linea mediana di separare la corteccia cerebrale nei suoi due emisferi. Rimuovere le meningi dagli emisferi cerebrali.
  8. Inserire un emisfero lato mediale e inserire le pinze nel ventricolo laterale sotto l'ippocampo. Tagliare il mesencefalo.
    1. Effettuare tagli alle estremità superiore e inferiore del ippocampo, e nei pressi del dentato / entorinale giunzione corteccia di isolare l'ippocampo dalla corteccia. Raccogliere il ippocampi in un piatto contenente ghiacciata EBSS 1x (+ 1% HEPES).

2. ippocampale Tissue Dissociazione

  1. Trasferire il dell'ippocampo di un piatto contenente la soluzione pre-riscaldato digestione del tessuto dell'ippocampo. Mince tsi ippocampali tessuti più fine possibile e incubare per 30 min a 37 ° C.
  2. Dissociare delicatamente i tessuti nelle singole cellule di cellule pipettaggio e meccanici di trasmissione in una provetta da centrifuga da 15 ml.
  3. Centrifugare a 200 xg per 5 min e rimuovere il surnatante.
  4. Pellet Risospendere in 20 ml 0.5x soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenenti saccarosio (0,9 M) e centrifugare a 200 xg per 10 min.
  5. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in 2 ml di mezzo NPC manutenzione (Tabella 1), posto sulla sommità di 10 ml di 4% Bovine Serum Albumin (BSA) in soluzione 1X EBSS e centrifugare a 200 xg per 5 min.
  6. Rimuovere il surnatante e aggiungere topo NPC terreno di mantenimento (Tabella 1) al pellet. Pipettare delicatamente su e giù per 5-10 volte a garantire pellet è suddiviso in singole cellule.
  7. Trasferire le cellule contenenti medie in piastre Matrigel pre-rivestito e aggiungere il fattore di crescita epidermico (EGF) e fibroblav fattore di crescita 2 (FGF2) (entrambi 20 ng / ml) in eparina (5 mg / ml). Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2.

3. Manutenzione di Aderente topo ippocampale NPC

  1. Preparare i piatti rivestiti / flaconi almeno un'ora prima del mouse passaging NPC dell'ippocampo. Aggiungere abbastanza Matrigel a coprire la superficie di ciascuna piastra o beuta ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  2. Rimuovere i supporti da 90% di topo confluenti culture NPC e lavare una volta con 1x tampone fosfato (PBS) quindi aspirare PBS off.
  3. Aggiungere sufficiente soluzione distacco cellulare per coprire tutti i pozzetti / palloni e incubare per 5 minuti a 37 ° C.
  4. Assicurarsi che tutte le cellule sono distaccato, cercando al microscopio in campo chiaro invertito a 10X di ingrandimento. Se ci sono ancora le cellule attaccate, incubare cultura nave per altri 1-2 minuti e verificare di nuovo le cellule. Aggiungere il doppio della quantità di Modified F-12 Nutrient Miscela Eagle Medium / di Ham di Dulbecco (DMEM / F-12)come quello della soluzione di distacco cellulare nei pozzetti / flaconi volta tutte le cellule hanno staccato.
  5. Trasferire DMEM / F-12 celle contenenti in 15 ml provetta da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 5 min.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare in 5 ml di manutenzione del mouse NPC medio (Tabella 1). Pipettare delicatamente su e giù per rompere pellet in singole cellule.
  7. Piatto un terzo di cellule totali nella nuova cultura pozzetti / fiaschi e rabboccare sufficiente terreno di coltura integrati con EGF e FGF2. Incubare recipienti di coltura a 37 ° C e 5% CO 2. Rifornire di media ogni due giorni e dividere le celle 1: 3 ogni 3 o 4 giorni. Evitare la crescita eccessiva delle culture del mouse NPC per prevenire l'aggregazione e il distacco.

4. La differenziazione di mouse NPC in astrociti

  1. Preparare poli-L-lisina (PLL) / laminina rivestito 12 millimetri vetrini almeno un giorno di anticipo prima di iniziare la differenziazione della NPC topo in astrociti. Aggiungi COVerslips in una piastra da 24 pozzetti e coprire tutta la superficie di pozzi con sufficiente PLL (1 mg / ml in tampone borato).
    1. Incubare la piastra notte a 4 ° C. Il giorno seguente, rimuovere PLL e lavare una volta con 1x PBS.
  2. Aggiungere laminina (1 mg / ml in ghiaccio freddo DMEM / F-12), di nuovo copre l'intera superficie di ogni pozzetto, incubare per almeno 4 ore a 37 ° C.
  3. Rimuovere i supporti da culture NPC topo e lavare una volta con 1x PBS quindi aspirare PBS off.
  4. Aggiungere sufficiente soluzione distacco cellulare per coprire tutti i pozzetti / palloni e incubare per 5 minuti a 37 ° C.
  5. Assicurarsi che tutte le cellule sono indipendente quindi aggiungere il doppio della quantità di DMEM / F-12 come quella della soluzione distacco cellulare ai pozzetti / beute.
  6. Trasferire DMEM / F-12 celle contenenti in 15 ml provetta da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 5 min.
  7. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5 media di differenziazione ml astrociti (Tabella 1). Delicatamente suspensio cell pipettan su e giù per rompere pellet cellulare in cellule singole. Contare il numero di singole cellule con un emocitometro.
  8. Cellule piastra a 5 x 10 4 cellule / cm 2 in 500 ml di mezzo per ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2. Sostituire la metà del mezzo con mezzo fresco ogni secondo giorno. Mouse NPC rapidamente differenziarsi in astrociti entro 2 giorni e si differenziano per una settimana prima di iniziare ulteriori esperimenti.

5. Brains raccolta embrionali di ratto e corticale Tissue Dissociazione

  1. Rimuovere differenziazione astrocyte medio (Tabella 1) da colture di astrociti e sostituirlo con il mezzo neurone primario (tabella 1), almeno 4 ore prima di iniziare la raccolta di cervello dei topi embrionali.
  2. Prima di dissezione, preparare la soluzione di digestione tessuto corticale: 10 microlitri papaina per 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES) con 12,1 mg / ml di L-cisteina. Fare circa 2.5 Ml di soluzione di digestione dei tessuti e filtrare utilizzando una unità di 0.20 micron filtro. Mantenere la soluzione calda a 37 ° C fino al momento dell'uso.
  3. Euthanize la diga incinta per asfissia di anidride carbonica con gas compresso. Test per il dolore riflesso via punta o la coda pizzico.
  4. Posare il lato ventrale degli animali su un tampone assorbente e bagnare la sua zona addominale con il 70% di etanolo. Pizzicare la pelle con un paio di pinze e fare una incisione laterale con un paio di forbici chirurgiche, sufficientemente ampia per esporre l'addome. Afferrare il peritoneo con le pinze e tagliare aprire la cavità addominale.
  5. Sollevare il corno uterino con le pinze e tagliare gratuitamente lungo la mesometrio. Inserire l'utero sezionato in una capsula di Petri su ghiaccio. Separare ogni embrione tagliando il tessuto uterino tra loro.
    1. Fare un'incisione nel sacco embrionale. Shell delicatamente il feto attraverso l'apertura. Decapitare il feto e posizionare la testa in una capsula di Petri sul ghiaccio.
  6. Per raccogliere embryonic cervello dei topi, seguono la descrizione da passaggi 1,3-1,5.
    1. Per analizzare i tessuti corticali, inserire un cervello emisfero laterale alto. Tagliare l'emisfero in due lateralmente dal centro. Eliminare il mezzo più vicino alla base del cervello. Tagliare il tessuto asportato per rimuovere il mesencefalo.
  7. Trasferire i tessuti corticali di un piatto contenente la soluzione pre-riscaldato digestione tessuto corticale. Macinare i tessuti corticali a più fine possibile e incubare per 30 min a 37 ° C.
  8. Trasferire i tessuti corticali dalla soluzione di digestione del tessuto in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 10 ml medie neurone primario pre-riscaldato (Tabella 1). Dissociare il tessuti corticali ripetutamente loro pipettando su e giù in una pipetta sierologica, fino ad ottenere una soluzione omogenea senza pezzi di tessuto.
  9. Far passare la soluzione di tessuto attraverso un colino cella di 70 micron per filtrare i restanti grumi di tessuto. Aliquota della soluzione del tessuto in 15 mlprovette, aggiungendo circa 3 ml in ogni provetta.
  10. Aggiungere 800 microlitri 7,5% BSA in PBS 1x al fondo di ciascun tubo, formando due strati con la soluzione di tessuto in alto e in basso BSA.
  11. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante, aspirando dall'interfaccia dei due strati. Evitare disturbare il pellet di cellule sul fondo della provetta.
  12. Risospendere ciascun pellet cellulare in 1 ml di mezzo neurone primario (Tabella 1) e combinarle in una provetta da centrifuga da 15 ml. Determinare la densità cellulare utilizzando un emocitometro.

6. elettroporazione e placcatura di primaria neuroni corticali

NOTA: Il trasferimento genico può essere ottenuta utilizzando vari metodi, tra cui elettroporazione, fosfato di calcio trasfezione e trasduzione virale. In questo protocollo, si descrive l'elettroporazione di consegnare ChR2 costruire in neuroni corticali primarie.

  1. Centrifuga 6 x 10 6 neuroni corticali di ratto aT 200 xg per 5 min e rimuovere il surnatante. Almeno 6 x 10 6 neuroni corticali sono necessari per elettroporazione per assicurare la formazione di una rete neuronale sopravvivendo neuroni.
  2. Aggiungere 100 ml di soluzione di elettroporazione alla cella pellet e risospendere delicatamente. Combina 100 ml di sospensione cellulare con 6 mg di Plenti-Sinapsina-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmide e trasferire nella cuvetta certificata. Evitare di produrre bolle d'aria durante il trasferimento.
  3. Selezionare e applicare il programma appropriato per elettroporazione secondo le istruzioni del produttore.
  4. Dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 ml di MEM per sospensione cellulare / DNA alla provetta. Trasferire il campione in 11,5 ml di mezzo neurone primario (tabella 1) e risospendere delicatamente. L'importo totale dei mezzi di comunicazione è sufficiente per un intero 24-pozzetti. Aliquotare 500 ml di media per ogni pozzetto di una 24-pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO 2.

7. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte

NOTA:. Questo metodo è stato adattato da Okita et al 10

  1. Cultura fibroblasti umani in DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) in 6 pozzetti.
  2. Prima di iniziare riprogrammazione dei fibroblasti, cappotto 6 pozzetti con Matrigel e incubare per almeno un'ora a temperatura ambiente. A 80% confluenza, rimuovere i supporti da colture di fibroblasti e lavare una volta con 1x PBS.
  3. Aggiungere sufficiente 0,25% tripsina-EDTA per coprire tutta la piastra e incubare a 37 ° C per 10 min.
  4. Una volta che le cellule hanno staccato dai pozzi, aggiungere il doppio della quantità di DMEM con 10% FBS a quella di tripsina per spegnerai tripsina digestione. Delicatamente pipetta cellule sospensione su e giù per rompere le cellule. Contare il numero di singole cellule con un emocitometro.
  5. Trasferimento 7 x 10 5 cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare la sospensione cellulare a 200 xg per 5min.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare in soluzione elettroporazione. Elettroporazione i fibroblasti secondo le istruzioni del produttore. Risospendere le cellule in 100 ml di buffer di elettroporazione e aggiungere 1 mg di ogni episomiale vettoriale. Cellule elettroporazione con impostazioni di 1.650 V, 10 ms e 3 impulsi di tempo.
  7. Sospensione cellulare Trasferimento in DMEM integrato con il 10% FBS e piastra 5 x 10 4 cellule per pozzetto di un 6-pozzetti. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2.
  8. Dopo 48 ore, rimuovere i supporti da colture di fibroblasti transfettate e sostituirlo con mTeSR media. Sostituire terreni di coltura tutti i giorni fino cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) colonie sono pronti per essere isolato. colonie IPSC possono essere osservati dopo 28-35 giorni.
  9. Quando si è pronti per l'isolamento, tagliati meccanicamente una colonia iPSC e reseed in mTeSR media con 10 pM Rho-associata proteina chinasi (ROCK) inibitore (Y-27632) su un rivestito 6-pozzetti Matrigel 12. Sostituire terreno di coltura al giorno.

8. neurale induzione e mantenimento di NPC umani

NOTA:. Questo metodo è stato descritto da Li et al 11

  1. Quando le culture IPSC sono circa il 20% di confluenza, rimuovere mTeSR media e sostituirlo con il mezzo di induzione neurale (Tabella 1). Rifornire di media ogni due giorni.
  2. Dopo 7 giorni, rimuovere medie induzione neurale e sostituirlo con terreno di mantenimento NPC umano (Tabella 1). Rifornire di media ogni due giorni fino a 7 giorni prima della passaging culture.
  3. Prima passaging culture, piatti cappotto / palloni con Matrigel a temperatura ambiente per almeno un ora.
  4. Rimuovere i supporti da confluenti culture NPC umani e lavare una volta con 1x PBS quindi aspirare PBS off.
  5. Aggiungere la soluzione il distacco delle cellule sufficiente a coprire tutti i pozzetti e quindi incubare per 5 minuti a 37 ° C.
  6. Assicurarsi che tutte le cellule hanno staccato. Aggiungere doppio della quantità di DMEM /F-12 come quella della soluzione distacco cellulare ai pozzetti / beute.
  7. Trasferire DMEM / F-12 celle contenenti in 15 ml provetta da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 5 min.
  8. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5 ml di mezzo umano NPC manutenzione (Tabella 1). Delicatamente pipetta cellule sospensione su e giù per rompere le cellule.
  9. Piatto un terzo di cellule totali in Matrigel rivestite cultura pozzetti / fiaschi e top up medio sufficiente supplementato con 10 micron Y-27632. Incubare recipienti di coltura a 37 ° C e 5% CO 2.
    1. Culture Split 1: 3 ogni 3 o 4 giorni e rifornire di media ogni due giorni. Mantenere culture NPC umane ad alta densità per evitare la differenziazione.

9. Differenziazione dei NPC umani in neuroni in co-culture

  1. Aggiungere il vettori lentivirali Synapsin1-tdTomato alla cultura NPC umana prima di iniziare la differenziazione in neuroni. Preparare astrocyte / neurone corticale co-cultureun giorno di anticipo prima differenziazione NPC umani.
  2. Lavare le culture NPC umani una volta con 1x PBS e aggiungere abbastanza soluzione distacco cellulare per coprire tutti i pozzetti / palloni poi incubare per 5 minuti a 37 ° C.
  3. Assicurarsi che tutte le cellule hanno staccato. Aggiungere doppio della quantità di DMEM / F-12 come quella della soluzione distacco cellulare ai pozzetti / beute. Trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 200 xg per 5 min.
  4. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5 ml di mezzo differenziazione neuronale (Tabella 1). Delicatamente pipetta cellule sospensione su e giù per rompere pellet in singole cellule. Contare il numero di singole cellule con un emocitometro.
  5. Con attenzione aspirare media da corticali culture neuroni astrociti /. Piatto NPC umani a 5 x 10 3 cellule / cm 2 in 500 ml di terreno di differenziamento neuronale (Tabella 1) supplementato con 10 mM Y-27632 per ogni 24 pozzetti. Aggiungere delicatamente terreno contenente NPC umani in ciascun pozzettoper evitare di disturbare gli astrociti e neuroni corticali.
  6. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2. Sostituire la metà della media con terreno fresco ogni due o tre giorni per almeno 28 giorni.

10. elettrofisiologici registrazioni di neuroni iPSC-derivati

  1. Verificare se iPSCs umani si comportano come neuroni maturi.
    1. Trova cellule differenziate da iPSCs umani da parte di visualizzazione di tdTomato utilizzando un microscopio confocale verticale dotato di 60X (0,9 NA) dell'obiettivo immersione in acqua.
    2. Estrarre registrazione pipetta ad una resistenza di 4 a 6 cellule M. Perfuse a temperatura ambiente in una soluzione esterna (Tabella 1) gorgogliare costantemente con il 95% O 2/5% CO 2. Riempire il micropipetta registrazione con la soluzione interna (Tabella 1).
    3. Patch tdTomato + cellulare in modalità whole-cell e azione di registrazione potenziale cottura in risposta alla iniezione di corrente (1 durata sec, 10 incrementi Pa) in curAffitto morsetto.
  2. Confermare se potenziale d'azione delle cellule corticali esprimono ChR2 è affidabile evocata dalla stimolazione della luce.
    1. Trova le cellule corticali esprimono ChR2 per la visualizzazione di GFP sotto un microscopio confocale. Eseguire cellula intera registrazione patch clamp su cellule corticali seguendo i passaggi da 10.1.2 a 10.1.3.
    2. Potenziale Controllare azione è affidabile evocata da illuminazione luce con lampada a vapori di mercurio (100 W). La lunghezza d'onda del filtro di eccitazione è 480/40 nm.
  3. Eseguire stimolazione optogenetic.
    1. Patch tdTomato + cellulare in modalità tutto-cell e impostare morsetto tensione -70mV. Filtro segnali di corrente a 2 kHz e digitalizzare a 10 kHz. Monitorare resistenze serie da 10 a 20 M per consistenza durante le registrazioni.
    2. Stimolare intero campo da 100 W Filtro lampada al mercurio con 480/40 nm di eccitazione per 30 sec.
    3. Correnti postsinaptiche Record (PSC) di cellule patch indotta da fotostimolazione di ChR2 esprimono cor presinapticaneuroni tici. Rilevare e misurare PSC. Impostare la soglia per l'ampiezza e la zona correnti a 5 Pa e 20 pc, rispettivamente. Controllare manualmente questi eventi per eliminare eventuali tracce non-PSC.

Risultati

Qui, un protocollo che descrive i diversi passaggi necessari per generare una co-coltura costituito astrociti, neuroni corticali e neuroni umani è illustrato. IPSCs umani sono stati ottenuti riprogrammando fibroblasti utilizzando vettori episomiale 10 e specificati in un lineage neurale con un cocktail di inibitori di piccole molecole, rendendo NPC 11 che sono stati mantenuti ad alta densità (Figura 1A). Diversi passi sono necessari per generare il co-coltura: differenziazione dei NPC topo in astrociti, placcatura di ratto neuroni corticali esprimono ChR2, e semina di NPC umani taggati con tdTomato (Figura 1B). Al giorno 2 di differenziazione, gliale fibrillare acida Protein (GFAP) + astrociti possano essere prontamente rilevate nelle nostre culture (Figura 1C). Mouse NPC è stato permesso di differenziare per almeno una settimana prima di placcatura neuroni corticali esprimono ChR2 sul monostrato astrociti (Figura 1D). Dopo 3a 4 settimane di differenziazione NPC umana, tdTomato + neuroni sono stati individuati nelle culture (Figura 1E).

Questo sistema di co-coltura consente il rilevamento coerente di correnti provenienti da singoli neuroni postsinaptici COPSI-derivati ​​in risposta alla stimolazione luminosa (Figura 2A). Quando stimolata dalla luce, potenziali d'azione sono stati generati in neuroni corticali esprimono ChR2 (Figura 2B). iPSC-derivati ​​neuroni sono eccitabili (Figura 2C), che mostra un aumento del potenziale d'azione di tiro come l'ampiezza di impulsi di corrente depolarizzante è stato aumentato (Figura 2D). Così, queste cellule mature presentano proprietà neuronali. In assenza di luce, i neuroni iPSC-derivati ​​hanno ricevuto ingressi sinaptici spontanei (Figura 2E). Queste correnti verso l'interno postsinaptiche sono stati prevalentemente mediati dai recettori AMPA, perché le correnti attraverso i recettori GABA sarebbe andata e recettori NMDA non portano corrente unt il potenziale di -70 mV in possesso. Almeno alcuni di questi ingressi erano di neuroni corticali presinaptici esprimono ChR2, perché stimolazione luminosa aumenta notevolmente la frequenza di correnti postsinaptici (figura 2E). La durata di questo aumento di ingresso sinaptica è mostrato in Figura 2F: fotostimolazione dei neuroni corticali è stato sostenuto tra 30 sec luce flash lungo. Mentre la frequenza di PSC era elevato quando ChR2 esprimenti neuroni corticali stati fotostimolata (figura 2G), l'ampiezza è stata influenzata (Figura 2H). In sintesi, questi risultati indicano che i neuroni iPSC-derivati ​​esposti maturi proprietà neuronali e potrebbero formare connessioni sinaptiche con neuroni corticali presinaptici.

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Figura 1: diagrammi schematici per la generazione di co-colturasistema. (A) Timeline per riprogrammare fibroblasti umani in iPSCs e induzione neurale di NPC. (B) Timeline per la differenziazione terminale di NPC umani in neuroni maturi sui neuroni e astrociti culture corticali. (C) del mouse NPC rapidamente differenziarsi in GFAP + astrociti dopo 2 giorni in vitro. (D) Dopo una settimana, neuroni corticali esprimono ChR2 stati placcati su GFAP + astrociti. (E) Alle 4 a 5 settimane dopo la differenziazione di NPC umani, registrazioni elettrofisiologiche sono stati eseguiti su tdTomato + neuroni. Barre di scala rappresentano 100 micron.

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Figura 2: analisi optogenetic della connettività sinaptica funzionale. (A) iPSC-derivato cellule taggati con tdTomato (rosso) sono stati co-coltura con neuroni corticali che esprime la luce attivatoCanale, ChR2 (verde). Le registrazioni da neuroni iPSC-derivati ​​rivelato correnti (PSC) risposte post-sinaptici, che potrebbero venire da entrambi i neuroni corticali o altri neuroni iPSC-derivati. (B) Illuminazione (barra blu) evoca una serie di potenziali d'azione nei neuroni corticali esprimono ChR2. ( cellule C) iPSC-derivati ​​sono evocati da iniezione di corrente. (D) Firing vs attuale curva di cellule iPSC-derivate. (E) Fotostimolazione delle ChR2 esprimono neuroni corticali (barra blu) sono aumentate la frequenza di PSC in neuroni iPSC-derivati . corso (F) Tempo di aumento della frequenza PSC prodotto da fotostimolazione. Blu barra indica il tempo di fotostimolazione. (G, H) mentre la frequenza PSC è stato incrementato di fotostimolazione (G), l'ampiezza PSC è stata influenzata (H). * Indica p <0,05 rispetto al controllo con t-test di Student.

Discussione

Optogenetics fornisce precisione spaziale e temporale per l'attivazione di popolazioni di neuroni definiti 13. Nei nostri esperimenti, l'intero campo dell'obiettivo del microscopio è stato illuminato per 30 secondi per foto-stimolare solo neuroni corticali esprimono ChR2. Questo ci ha permesso di determinare se le connessioni sinaptiche sono formate tra le diverse popolazioni di neuroni all'interno della co-coltura. I nostri risultati hanno rivelato che fotostimolazione aumenta la frequenza PSC in neuroni iPSC-derivati, il che dimostra che questi neuroni ricevono input sinaptico dei neuroni corticali presinaptici esprimono ChR2. Questo, a sua volta, ha stabilito che i neuroni iPSC-derivati ​​incorporati con successo nei circuiti con i neuroni corticali.

Ci sono diversi passaggi critici per la generazione di questo sistema di co-coltura. È importante assicurare che le colture di astrociti topo NPC-derivati ​​sono sani, con morte cellulare minima, prima di procedere con la placcaturadi altri tipi di cellule. Neuroni corticali e NPC umani attaccano bene su astrociti sani e registrazioni elettrofisiologiche dipendono fortemente dalle condizioni di coltura. Gli altri passaggi fondamentali in questo protocollo sono l'elettroporazione e la placcatura dei neuroni corticali in colture di astrociti. Come un gran numero di cellule muoiono dopo l'elettroporazione, è importante assicurare che almeno 6 milioni di neuroni corticali sono elettroporate per la placcatura in colture astrociti in piastre da 24 pozzetti. Abbiamo osservato che quando sono state elettroporate meno di 6 milioni di cellule, il numero di neuroni che sopravvivono non formano una rete neuronale densa, che ha colpito registrazioni elettrofisiologiche. Il numero di neuroni corticali elettroporate dovrebbe essere coerente per ogni esperimento di co-coltura per consentire il confronto tra i diversi studi. Per tutte le iniziative che coinvolgono la digestione enzimatica, è fondamentale non lasciare le cellule in soluzione digerente troppo a lungo in quanto può portare alla morte cellulare.

Questoapproccio può essere utilizzato per schermare la capacità di neuroni derivati ​​da fibroblasti specifici del paziente per formare contatti sinaptici con altri neuroni. I neuroni derivati ​​da fibroblasti di pazienti affetti da disturbo dello sviluppo neurologico Sindrome di Rett (RTT) presentano difetti di trasmissione sinaptica: neuroni RTT mostrano una significativa riduzione della frequenza PSC ed ampiezza rispetto a neuroni sani, presumibilmente a causa della minore connettività sinaptica 14. Il nostro sistema di co-coltura permette esame degli effetti dei farmaci sui neuroni che mostrano difetti di sviluppo. Questo può essere effettuato tramite l'aggiunta di composti di interesse durante la semina di NPC umani malate nonché durante l'esposizione continua a composti per tutto il tempo di differenziazione neuronale.

Mentre questo sistema di co-coltura può anche essere utilizzato come modello per il test della droga, un limite di questo approccio è che il processo di studio degli effetti di ciascun composto candidato può essere lunga e noiosa comenon è un metodo di screening ad alto rendimento. Dopo il trattamento con i composti candidati, neuroni COPSI derivate devono essere patch individualmente per determinare gli effetti di ciascun composto in PSC. Inoltre, ci sono attualmente non sono molti fibroblasti disponibili e iPSCs di pazienti. Pertanto, sarà di interesse nel prossimo futuro di avere cellule più pazienti e anche di adattare questo protocollo per lo screening ad alta produttività. Ad esempio, etichettando neuroni COPSI-derivati ​​con un indicatore di attività, quali sensori geneticamente codificati di ioni o potenziale di membrana, sarebbe possibile aumentare la velocità di flusso sostanzialmente by-side passo della procedura elettrofisiologica richiede tempo. Come l'intero processo di generazione di questo sistema di co-coltura, dalla riprogrammazione fibroblasti di eseguire registrazioni elettrofisiologiche, richiede più di 90 giorni, si raccomanda che sia le iPSCs o NPC umani essere ampliato, dopo la riprogrammazione e fasi di induzione neurale, rispettivamente,e crioconservati per ridurre il tempo necessario per futuri esperimenti.

Nei nostri esperimenti, abbiamo espresso ChR2 in neuroni corticali sotto il promotore synapsin1. Perché questo promotore è pan-neuronale, siamo stati presumibilmente fotostimolante entrambi i neuroni corticali inibitorie ed eccitatorie. Se l'obiettivo di esperimenti futuri è interrogare specificamente circuiti sia inibitori o eccitatori, potrebbero essere utilizzati promotori più specifici. In alternativa, i neuroni corticali potrebbero essere ottenuti da transgenici (o virus iniettato topi), dove l'espressione ChR2 è specificamente mirato a sottopopolazioni geneticamente definiti di neuroni. Ad esempio, i tessuti corticali raccolta da un mouse che ha Cre ricombinasi espresse in interneuroni-parvalbumin contenente (interneuroni PV) che viene attraversato con un mouse con floxed ChR2 produrrà una situazione in cui gli unici neuroni corticali esprimenti ChR2 saranno interneuroni PV 15. L'uso di tali ChR2 esprimono interneuroni nella nostra co-cuSistema lture consentirà determinare se una patch neurone iPSC-derivato è in grado di integrare in un circuito con interneuroni fotovoltaici.

Sulla base di uno studio precedente 9, neuroni corticali sono maturi con dendriti sovrapposizione dopo 14 giorni in vitro. Così, se fotostimolazione non suscita una risposta da un neurone patch COPSI-derivata, esso dovrebbe indicare che il neurone non ha la capacità di effettuare connessioni sinaptiche con neuroni corticali. Un neurone iPSC-derivato è in grado di ricevere input sinaptico o da altri neuroni iPSC-derivati ​​o neuroni corticali. Se sono stati usati toppa tradizionale registrazioni clamp, non sarebbe possibile distinguere se l'ingresso sinaptica proviene. Il vantaggio del nostro sistema è che le risposte post-sinaptici di ingresso presinaptica corticale possono essere selettivamente evocati e identificati. Le procedure descritte qui forniscono un approccio semplice per valutare la capacità dei neuroni COPSI derivate integrarein una rete neuronale definito.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

Ringraziamo K. Deisseroth e S. Je per i costrutti lentivirali ChR2 e Synapsin1-tdTomato rispettivamente C. Chai per la condivisione di know-how e il protocollo sulla generazione iPSC, WY Leong per il supporto tecnico, i membri del laboratorio Goh per la condivisione di reagenti e competenze. Questo lavoro è stato sostenuto da Abbott Nutrition e il Centro Accademico di Eccellenza (ACE) premio di ricerca da GlaxoSmithKline (GSK) per ELG, dal National Research Foundation di Singapore sotto la sua Competitive Research Program (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) a ELG e GJA, e dalla Classe World Institute (WCI) Programma della Fondazione di Ricerca Nazionale di Corea (NRF), finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia di Corea (MEST) (NRF Concessione numero: WCI 2009-003) a GJA

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit per la proliferazione di Neurocult (Mouse)STEMCELL Technologies5702Contiene il Terreno basale NSC e l'integratore per la proliferazione delle NSC
Epi5 Kit di riprogrammazione iPSC episomialeInvitrogenA15960
DMEM/F12Lonza12719F
MatrigelBD Biosciences354277
Medium neurobasaleInvitrogen
MEM senza glutamminaInvitrogen11090081
N2Invitrogen17502048
B27Invitrogen17504044
L-glutamminaInvitrogen25030081
integratore GlutaMAXInvitrogen 35050061
PenStrepInvitrogen15140122
BSASigmaA7906
Human LIFInvitrogenPHC9484
CHIR99021Miltenyi Biotech130103926
SB431542SigmaS4317
Compound EMerck Millipore565790
EGFMerck Millipore324856
FGF2R& D Systems233FB025
Research Grade FBSThermo ScientificSV30160.03Per il mezzo di differenziazione degli astrociti
Definito FBSThermo ScientificSH30070.03Per il mezzo del neurone primario
PBSThermo ScientificSH30028.02
GlucosioSigma G8270Per il mezzo del neurone primario
SaccarosioSigmaS0389
eparinaEMD Millipore375095
papainaWorthington3126
HBSSInvitrogen14175095
DNase IRoche10104159001
Dispase IISTEMCELL Technologies7923
HEPESGibco15630080per cervelli di raccolta
EBSSInvitrogen14155063
L-CisteinaSigmaC7352
Tripsina-EDTAInvitrogen25200056
70 &; filtro cellulare mBD Biosciences   352350
20 µ m unità filtranteSartorius Stedim16534K
NaClSigmaS7653
KClSigmaP5405
NaHCO3SigmaS5761
NaH2PO4Fluka71505
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
D(+)-GlucosioSigmaG7520Per studi elettrofisiologici
K-gluconatoSigmaP1847
KOHKANTO Chemical3234400
HEPESSigmaH3375Per studi elettrofisiologici
EGTASigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaG8877
Capillari in vetro borosilicato Worldprecision instruments, Inc1604323
provetta da centrifuga da 15 mlBD Biosciences 
provetta da centrifuga da 50 mlBD Biosciences352070
piastre da 24 pozzettiCorning9761146
piastre da 6 pozzettiCorning720083
Palloni T25Corning430641
vetri di copertura da 12 mmMarienfeld-Superior111520
AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit& nbsp;LonzaVPG1003Per l'elettroporazione dei neuroni corticali primari
Sistema di trasfezione al neon.InvitrogenMPK5000Per l'elettroporazione di fibroblasti umani
Mini Analisi SynaptosoftMini Analysis v.6Per la misurazione di PSC
Fibroblasti umani dermici normaliPromoCellC12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPREAddgene20945
Lampada ad arco cortoal mercurio OSRAMHBO 103 W/2
21103049352096

Riferimenti

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