Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Sommario

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Abstract

Le cellule staminali neurali (NSC) sono in grado di auto-rinnovamento e la differenziazione in neuroni, astrociti e oligodendrociti sotto specifici microambienti locali. Qui, vi presentiamo una serie di metodi utilizzati per tridimensionale (3D) la differenziazione e l'analisi miRNA di una cellula staminale neurale umana (hNSC) linea clonale, attualmente in studi clinici per la disabilità ictus (NCT01151124 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs sono stati ricavati da un etico approvato primo trimestre corteccia fetale umano e condizionale immortalati con integrazione retrovirale di una singola copia del c-mycER ^TAM costruire. Descriviamo come misurare processo assonale di hNSCs differenziati sulle impalcature 3D e come quantificare i cambiamenti associati nella espressione dei miRNA con matrice PCR. Inoltre rappresentiamo analisi computazionale, con l'obiettivo di selezionare miRNA target putativi. SOX5 e NR4A3 sono stati identificati come idonei bersaglio putativo miRNA di selezionati in modo significativo down-regolanod miRNA in hNSC differenziata. Validazione del target Mirna è stata effettuata su SOX5 e NR4A3 3'UTRs da dual trasfezione plasmide reporter e doppio test luciferasi.

Introduzione

La ricerca sulle cellule staminali ha un ruolo centrale nella medicina rigenerativa, che si estende anche le discipline di ingegneria dei tessuti, biologia cellulare dello sviluppo, terapie cellulari, terapia genica, e biomateriali (scaffold e matrici). Le cellule staminali sono importanti sia in organo riparazione dei tessuti Sviluppoe; capire come le cellule staminali funzionano è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti a base di cellule staminali nuovo ^1. CTX0E03 è un clonale, cellule staminali neurali umane condizionalmente immortalato (hNSC) Linea ² isolati dal primo trimestre corteccia fetale umano. CTX0E03 ha definito le caratteristiche di qualità che sono essenziali per il settore bancario cella clinica in buone pratiche di fabbricazione (GMP) ^3. HNSCs possono differenziarsi spontaneamente in neuroni, glia, e oligodendrociti e hanno dimostrato di migliorare i deficit neurologici quando trapiantati in un modello di roditore di focale ischemia ^2,4,5. Il CTX0E03 hNSCs sono attualmente in studi clinici per l'ictus Disabillità (NCT01151124 ⁶ e NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

MiRNA hanno una media di 22 nucleotidi di lunghezza e hanno dimostrato molecole regolatrici ^7, non codificano proteine, ma piuttosto legare 3 prime untranslated regione (3'UTR) di mRNA, regolando la loro stabilità e la traduzione in proteine. MiRNA sono segnalati per partecipare alla regolamentazione di un certo numero di processi cellulari, tra cui lo sviluppo, la proliferazione e la differenziazione ^8. Molti miRNA sono stati implicati nella regolazione del destino e la specifica delle cellule staminali neurali ^9.

In bidimensionale (2D) cultura ambiente standard complessità dell'ambiente in vivo non corrisponde, e quindi l'induzione e regolazione di hNSC differenziazione non è ottimale. In vivo, le cellule sono circondate da un tridimensionale (3D) microambiente tre composta da altri cellule e ligandi extracellulari, tra cui moltitipi di collagene, laminina, e altre proteine ​​della matrice (matrice extracellulare, ECM). Hanno riferito Studi precedenti che la topografia architettonica dei materiali che mimano ECM e il loro fenotipo cellulare geometria influenza e il destino ^10-15. Un certo numero di commercialmente disponibili scaffold 3D sono disponibili; abbiamo usato un ponteggio polistirene altamente porosa progettato con un'architettura ben definita ed uniforme in una membrana di spessore 200 micron che fornisce uno spazio 3D in cui le cellule possono invadere e differenziarsi ^16-18.

Ivi saggi di differenziazione 2D e 3D sono utilizzati per valutare axonprocess escrescenza. Inoltre, si descrive un metodo per profilare l'espressione miRNA di una linea di grado hNSC clinica per studiare ulteriormente gli effetti dei miRNA sulla sua differenziazione. I metodi qui illustrati sono basati su quelli originariamente descritti in ^19.

Protocollo

1. HNSC differenziazione su Tridimensionale (3D) Culture

NOTA: Isolare e derivare hNSCs, da un tessuto etico approvato, descritto in una pubblicazione precedente ^2. Si prega di seguire le linee guida etiche ed istituzionali seguendo questa procedura.

1.1) La cultura 3D Utilizzando 12 pozzetti

1. Utilizzare una tecnica asettica durante tutta la procedura. In un armadio di sicurezza biologica, impalcature reidratare aggiungendo 2 ml / pozzetto di etanolo al 70% preparate con acqua per l'irrigazione (WFIr). Evitare di toccare i ponteggi erogando l'etanolo del 70% il muro di ogni bene.
2. Aspirare accuratamente la etanolo al 70% e lavare immediatamente i ponteggi con 2 ml / pozzetto DMEM: F12 per 1 min. Ripetere la procedura di lavaggio due volte. Aspirare accuratamente il DMEM: F12 dopo il lavaggio finale.
3. Ponteggi Coat aggiungendo 2 ml / pozzetto di laminina (10 mg / ml) in DMEM: F12. Incubare la piastra a 37 ° C in un CO ₂ ronzio 5%incubatrice idified per un minimo di 2 ore. Piastra Lavare con DMEM caldo: F12.
4. Seed ogni scaffold con circa 500.000 hNSCs in un volume di 150 ml di RMM + GF.
5. Incubare la piastra per 3 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5% per permettere alle cellule di stabilirsi nei ponteggi.
6. Aggiungere 3,5 ml di RMM per ciascun bene facendo attenzione a non staccare le cellule da impalcature.
7. Incubare la piastra per 7 giorni; sostituire RMM medie (3,5 ml / pozzetto) dopo 1 giorno (prima alimentazione) e dopo 2-3 giorni dalla prima alimentazione.
8. Dopo 7 giorni, rimuovere le medie e fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) per immunocitochimica (ICC) o aggiungere 500 ml / pozzetto di reagente di lisi per l'estrazione di RNA totale (piastra di conservare a ≤ -80 ° C o procedere con l'estrazione totale RNA) .

1.2) Misura della Axon Process escrescenza

1. Stain 4% PFA fissato hNSCs differenziati secondo un protocollo standard ICC ²⁰ con β3-tubulina (TUBB3) anticorpo primario rilevato con un anticorpo secondario coniugato fluorocromo. Nuclei delle cellule di contrasto con Hoechst (1 micron).
2. Cattura immagini rappresentative di cellule colorate β3-tubulina usando un microscopio a fluorescenza; salvare le immagini come tiff o jpeg. Misura del processo assonale utilizzando uno strumento di misurazione del software (ad esempio, immagine-Pro Plus).
3. Aprite l'immagine, opzione di selezionare le misurazioni nella barra degli strumenti, e selezionare la funzione di traccia.
4. Per avviare la traccia, selezionare il punto di partenza sul conseguenza assone facendo clic sul pulsante del mouse. Tracciare lungo l'intera lunghezza del escrescenza assone; fare clic destro per terminare ogni traccia. Ripetere per misurare tutto outgrowthswith assone nel campo visivo.
5. Esprimere misure come pixel o micron (in attesa di calibrazione impostato). Misure di lunghezza esportare in un programma di foglio di calcolo per l'analisi comparativa e statistica del campione.

2. Mirna espressione utilizzando una Cellule Staminali ePercorsi di sviluppo Focused Array miRNA PCR

2.1) estrazione di RNA totale miRNA

1. Eseguire estrazione miRNA sui ponteggi e campioni cresciuti 2D (differenziato e indifferenziato, il controllo hNSC).
2. Scongelare ponteggi, inseriti in una piastra ben 12, se necessario. Combina contenuti reagenti di lisi (500 microlitri) di 2 pozzi nella stessa 1,5 ml provetta Eppendorf, volume finale 1 ml di Lysis reattivo. Fare attenzione a lasciare il palco nel pozzo.
3. Per i campioni raccolti in precedenza secche cellulari pellettato 2D cresciuto (differenziate culture hNSC 2D e controllo indifferenziato) aggiungere 1 ml di reagente di lisi e trasferire il contenuto in 1,5 ml provetta.
4. Omogeneizzare ogni campione con una siringa da 1 ml e una breve 20 a 25 gauge. Far passare il lisato attraverso l'ago utilizzando una siringa da 1 ml fino a 5 volte fino ad ottenere un lisato omogenea.
5. Aggiungere 200 ml di cloroformio in ogni provetta Eppendorf e tappare saldamente. Tubi Inverti e vortex permescolare il contenuto.
6. Centrifugare ogni 1,5 ml provetta contenente omogeneizzato per 15 minuti a ≥12,000 x g.
7. Trasferire la fase acquosa superiore di ciascun campione (evitare di trasferire ogni interfase, rosa liquido colorato) ad una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 750 ml di etanolo al 100%. Miscelare bene per capovolgimento.
8. Pipetta fino a 700 ml di ogni campione di prova, comprese eventuali precipitato, in un mini colonna in un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a ≥8,000 xg per circa 30 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through. Ripetere questa operazione utilizzando il resto del campione.
9. Eseguire un digest DNA per 15 min.
10. Aggiungere 700 microlitri di buffer RWT alla mini colonna e centrifugare per circa 30 secondi a ≥8,000 x g. Gettare il flow-through.
11. Lavare mini colonna aggiungendo 500 microlitri di buffer RPE e centrifugazione per circa 30 secondi a ≥8,000 x g. Gettare il flow-through. Ripetere wash.Centrifuge a ≥12,000 xg per 1 min per asciugare ulteriormente la membrana.
12. Eluire RNA totale in una provetta Eppendorf da 1,5 ml aggiungendo 40 ml di acqua RNase-free alla mini colonna e centrifugando per 1 min a ≥8,000 x g. Misurare concentrazione totale RNA con l'ausilio di uno spettrofotometro adeguato.

2.2) miRNA cDNA Preparazione

1. Preparare la master mix trascrizione inversa. Ogni campione richiede 4 ml di tampone 5x miScript Hispec, 2 ml di 10x nucleics mix, 2 microlitri miScript inversa mix trascrittasi.
2. Aliquota 8 ml di master mix in un tubo di PCR, aggiungere il volume richiesto di RNA totale (250 ng), e aggiungere acqua senza RNase ad un volume finale di 20 ml.
3. Incubare per 60 min a 37 ° C.Incubate per 5 minuti a 95 ° C per inattivare miScript trascrittasi inversa Mix.
4. Aggiungere 200 acqua priva di RNasi microlitri per ogni reazione di 20 microlitri inversa trascrizione, conservare a -20 ° C, o procedere con real-tiMi Pcr immediatamente.

2.3) Cellule staminali e dello sviluppo Pathways focalizzata miRNA PCR Array

1. Preparare la componenti mix PCR in una provetta da 15 ml con l'aggiunta di 1375 ml di 2x SYBR master mix verde, 100 ml miRNA cDNA preparazione, 275 ml di 10x miScript Primer universale, e 1000 ml di acqua RNase-free (volume totale 2.750 ml).
2. Trasferire PCR componenti mix su un carico serbatoio PCR. Rimuovere con attenzione il 96 pozzetti PCR schiera dalla confezione sigillata.
3. Aggiungere 25 ml componenti PCR mix in ogni pozzetto del Array PCR utilizzando una pipetta a 8 canali, o una pipetta 12 canali utilizzando solo 8 punte. Cambiare puntali seguenti ogni semina per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti.
4. Sigillare piastra con pellicola adesiva ottica, e centrifugare per 1 min a 1000 xg a temperatura ambiente (15-25 ° C) per rimuovere bolle. Ispezionare visivamente la piastra dal basso per garantire l'assenza di bolle sono presenti nei pozzetti.
5. Posizionare la 96 pozzetti PCR array in tempo reale cycler.
6. Programmare il tempo reale cycler conseguenza: 1 ciclo a 95 ° C per 10 minuti, e 45 cicli di 15 secondi a 95 ° C, e 1 min a 60 ° C impostata una singola (raccolta dei dati di fluorescenza).
7. Esportare i valori Ct per tutti i pozzetti di un vuoto foglio di calcolo Excel per l'utilizzo con la PCR Array Data Analysis Template Excel e software web-based.
   NOTA: Il software è disponibile in www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php .

3. Analisi computazionale per miRNA target Previsione e Validazione di Target mRNA da Reporter plasmidi Transfection e Ddual luciferasi Assay.

3.1) Analisi computazionale per la previsione miRNA target

1. Sfoglia PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) ^21, disponibile online algoritmo per l'identificazione di miRNA bersaglio mRNA di previsione.
2. Clicca su "clicca qui per la previsione PicTar su vertebrati". Una nuova pagina si aprirà.
3. Nella nuova pagina, interfaccia web PicTar, scegliere specie nel menu a tendina e inserire miRNA di interesse nella casella di miRNA ID. Clicca ricerca di obiettivi di miRNA.
4. Osservare un elenco di mRNA bersaglio ordinati per punteggio aPicTar.
   NOTA: PicTar calcola un punteggio che riflette la probabilità che un determinato UTR sarà destinata dal miRNA selezionati, e si basa sulla complementarità delle sementi, termodinamica e una previsione combinatoria per obiettivi comuni in gruppi di co-espressi miRNA ^22.
5. Allo stesso modo recuperare l'elenco di mRNA bersaglio utilizzando DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) ^23, e TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) ^24, alternativa on line disponibile algoritmi.
6. Compilare una tabella comparativa di miRNAs sulla base di classifica ottenute utilizzando diversi strumenti software. PicTar classifica in base al punteggio, DianaLab per la precisione (sulla base di rapporto segnale-rumore e un punteggio di precisione per la valutazione della significatività dei risultati previsti), e TargetScan da PCT aggregato (basato sulla complementarità delle sementi, termodinamico energia libera di legame, conservazione su diverse specie), vedi tabella 1.

3.2) Validazione dei target mRNA da Reporter plasmidi Transfection e Dual Luciferase Assay.

NOTA: 3 'UTR reporter luciferasi per la validazione del target mRNA è stato descritto in precedenza ^25.

1. Transfection
   1. Seme cellule HeLa con una densità di 10 ⁵ cellule / pozzetto in 24-pozzetti.
   2. Dopo 24 ore, co-trasfezione le cellule HeLa con 1,5 ml di reagente di trasfezione eo 100 ng di NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTR plasmide, nonché imita 20 nM miRNA (HSA-miR-96-5p per SOX5 3217; UTR, e HSA-miR-7-5p, e HSA-miR-17-5p per NR4A3 3 'UTR, rispettivamente) per bene.
   3. Pozzetti di controllo Co-trasfezione con NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmid e fluorocromi etichettata siRNA controllo negativo. La trasfezione di pozzetti di controllo con fluorocromi etichettata siRNA controllo negativo consente la valutazione di efficienza di trasfezione e rappresenta mimica miRNA 3'UTR bind specificità.
2. Misurazione del doppio luciferasi Attività
   1. Misurare Firefly e Renilla attività luciferasi 24 ore dopo la trasfezione. Togliere terreno di coltura cellulare.
   2. Preparare la soluzione di lavoro I aggiungendo 50 ml di substrato I in 10 ml di soluzione di I; mescolare accuratamente. Aggiungere 300 ml di soluzione di lavoro che in ogni 24 bene.
   3. Trasferire il contenuto di ogni 24 e in 3 pozzetti di una piastra bianca 96, 100 ml ciascuna. Attendere 10 min e misurare Firefly luciferasi in set luminometro per l'acquisizione luminescenza.
   4. Preparare solut lavoroion II aggiungendo 50 ml di substrato II in 10 ml di soluzione II; mescolare accuratamente. Aggiungere 100 ml di soluzione di lavoro che in ogni 96 e già contenente 100 ml di soluzione di lavoro I.
   5. Attendere 10 min e misurare Renilla luciferasi in set luminometro per l'acquisizione luminescenza. Calcolare il rapporto della luminescenza della luciferasi Firefly al luciferasi Renilla.

Risultati

Nella figura 1 viene visualizzata la ricerca e quantificazione di hNSC differenziazione su scaffolds 3D rispetto alle culture tradizionali superficie piana (2D) e expressedas assoni misurazioni processo escrescenza. Nella figura 2 è representedthe flusso di lavoro e risultati per la quantificazione miRNA utilizzando cellule staminali e percorsi di sviluppo focalizzati matrice miRNA PCR per indagare l'espressione differenziale dei miRNA in hNSCs differenziate 2D e 3D rispetto al controllo di indifferenziata. A seguito di analisi comparativa tra miRNA hNSCs differenziati e indifferenziati, e analisi computazionale per la previsione di destinazione, SOX5 e NR4A3 (Nor1) sono stati identificati come presunti mRNA bersaglio. Per studiare l'interazione diretta tra i miRNA ei loro sito putativo sul 3'UTR dell'mRNA abbiamo usato 2 plasmidi disponibili in commercio che contengono sia SOX5 o sequenza NR4A3 3'UTR inserito a valle del lucciola luciferasi gene reporter, un nd contenente nello stesso plasmide renilla luciferasi gene per la normalizzazione. I risultati rappresentativi di 3 'UTR attività luciferasi down-regolazione è presentato in figura 3.

Figura 1:. Differenziazione delle hNSCs su impalcature 3D, e la misurazione della crescita degli assoni processo es (A) seguito colorazione ICC standard per β3-tubulina (verde) e nuclei di contrasto con Hoechst (blu) microfotografie rappresentativi sono stati acquisiti e misurazione dei processi assoni erano eseguita con l'ausilio di un software di analisi di immagine. (B) Schemi di segnalazione la misura del processo di estensione assonale eseguita in hNSCs differenziati 2D e 3D per 1 (1W) o 3 settimane (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. Workflow Schema di miRNA profiling in hNSCs differenziate RNA totale, tra cui miRNA, è stato estratto da entrambi hNSCs differenziati sulle impalcature 3D e culture 2D standard o di controllo indifferenziata. 250 ng di RNA totale sono stati retro-trascritto con un metodo che facilita la conversione selettiva dei miRNA maturi in cDNA adatto per miRNA quantificazione con la differenziazione delle cellule umane e lo sviluppo miScript miRNA PCR array. La geo-media di SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, e RNU6-2 è stato utilizzato per l'analisi dei dati in base al metodo 2 ^-ΔΔct. Cambiamenti significativi sono stati definiti come +/- 1,5 ripiegare e regolazione fino a una stain misura statisticamente significativa. I dati sono stati analizzati utilizzando il software web-based disponibile presso risultati sono espressi come clustergram. Modificato da Figura 3 ^19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: convalida del target miRNA previsto mRNA utilizzando un doppio test rapporto luciferasi. (A) diagramma rappresentante di una duplice plasmide giornalista luciferasi utilizzato come strumento per convalidare sequenza 3'UTR come bersaglio diretto di un miRNA. (B) Micrografia Rappresentante mostrando efficienza di trasfezione. (C)   Segnali, espressi come attività relativa luciferasi, da umano 3 & #39; giornalisti UTR ofSOX5 e NR4A3 geni erano significativamente abbattuti in presenza di HSA-miR-96, e HSA miR-7-e 17 imita miRNA rispettivamente. Modificato dalla figura 5 ^19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

		DIANALAB		PicTar	TargetScan
miRNA	Gene bersaglio	Siti target / geni trovati	Precisione	Punto	Aggregato P CT
HSA-miR-96	SOX5	1214/763	1	6.74	0.94
HSA-miR-183	DUSP10	302/190	0.72	4.75	0.85
HSA-miR-302A	NR4A3	863/473	0.84	3.05	NF
HSA-miR-182	FOXN3	1358/794	0.94	NF	0.96
HSA-miR-7	NR4A3	NF	NF	1.61	0.17
HSA-miR-7	FOXN3	399/136	0.17	NF	0.88
HSA-miR-20a	NR4A3	1650/841	0.85	5.87	0.63
	NR4A3	1955/973	0.9	5.87	0.63
HSA-miR-17	NR4A3	1928/961	0.9	5.38	0.63 + 0.37
HSA-miR-20a	EIF4G3	1650/841	0.97	NF	NF
HSA-miR-20b	EIF4G3	1955/973	0.94	NF	NF
HSA-miR-17	EIF4G3	1928/961	0.94	NF	NF

Tabella 1: Elenco dei miRNA mRNA previsione di destinazione. Tavolo Rappresentante dei miRNA, bersaglio geni predittivi, e l'analisi di algoritmi (prevedereion / partitura / aggregati forniti utilizzando rispettivamente Diana Lab, PicTar, e TargetScan). Modificato dalla tabella 3 ^19.

Discussione

Lo sviluppo di nuovi test in vitro per valutare e migliorare la differenziazione delle cellule staminali ha sempre rappresentato una sfida per lo studio delle loro funzionalità e capacità terapeutiche. A lungo termine e l'attaccamento stabile di hNSCs, necessaria per lo sviluppo di un robusto 3D in vitro la differenziazione, è stata affrontata analizzando diversi substrati 3D con caratteristiche diverse in termini di materiali e strutture. Come parte dello sviluppo test abbiamo anche valutato concentrazione ottimale di semina cellulare e identificato l'obbligo per i ponteggi da laminina rivestite. Sebbene i nostri hNSCs possono differenziarsi spontaneamente upon 4-OHT e il fattore di crescita di rimozione, l'implementazione di un sistema di coltura 3D mostrato un miglioramento significativo nella loro capacità di differenziazione come misurato da assonale processo rispetto a hNSCs 2D differenziato standard.

Per studiare l'effetto di differe 3D indottantiation sull'espressione hNSC miRNA abbiamo usato un array di PCR. Rispetto ai chip di microarray standard di matrice PCR offre i vantaggi di una quantificazione diretta e validazione di miRNA di interesse. Sebbene l'array PCR è limitata in termini di numero totale di miRNA per elemento, per esempio qui meno di 96, può essere adattato per includere specificamente miRNA di interesse, nel nostro caso precedentemente riportato nello sviluppo delle cellule staminali. L'espressione del pathway concentrata miRNA è stata profilata in 3D e 2D hNSCs differenziati rispetto a hNSCs indifferenziati. I più significativamente down-regolato miRNA sono stati selezionati e analizzati per valutare i loro presunti mRNA bersaglio con l'intento di determinare la loro funzionalità e interpretazione biologica mediante algoritmi disponibili online (DIANA Lab, PicTar, e TargetScans).

Un singolo miRNA può riconoscere centinaia di obiettivi e per questo motivo abbiamo convalidato interazioni miRNA con 3 'UTR mRNAsthat possono essere candidati idonei in unregolazione xonal. NR4A3, un obiettivo della HSA-miR-7, e miR-17 famiglie, è un membro della famiglia dei recettori nucleari NR4A che, a seconda del loro livello di espressione, sono coinvolti nella differenziazione, sopravvivenza, apoptosi e la regolamentazione del assone ippocampale guida ^26. Analogamente SOX5, un obiettivo di HSA-miR-96, è segnalato per controllare la progressione del ciclo cellulare in progenitori neurali ²⁷ lunghezza assone ^28, migrazione, differenziazione post-migratori, e proiezioni di neuroni ^29. Sia SOX5 e NR4A3 sono stati identificati come bersaglio mRNA diretta di HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17, rispettivamente, dal doppio saggi luciferasi giornalista. Doppia luciferasi (lucciola e Renilla) si basa su due differenti geni reporter nella stessa plasmid e offre un sistema perfezionato che consente di normalizzazione per effetti causati dalla trasfezione subottimale e effetti citotossici rispetto ad un unico sistema plasmide luciferasi. Come parte del nostro sviluppo test abbiamo anche ottimizzato il nostro trasfezione conditions per ottenere un'elevata efficienza.

Il protocolsdescribed qui può essere sfruttata per ottimizzare ulteriormente e caratterizzare la differenziazione in vitro hNSC che possono beimplemented protocolli intransplantation per gli studi pre-clinici e future applicazioni cliniche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM: F12	Invitrogen	21331-020	Per la preparazione media RMM
Soluzione di albumina umana	Baxter assistenza sanitaria limitata	1501052	Per il terreno RMM utilizzato a una concentrazione finale di  0,03%
Transferrina, Sigma		T8158	umano Per il terreno RMM utilizzato a una concentrazione finale di  5 µ g/ml
Putrescina DiHCl	Sigma	P5780	Per mezzo RMM utilizzato a una concentrazione finale di  16,2 µ g/ml
di insulina, ricombinante umano	Sigma	I9278	Per mezzo RMM utilizzato a una concentrazione finale di  5 µ g/ml
di progesterone	Sigma	P6149	Per mezzo RMM utilizzato a una concentrazione finale di   60 ng/ml
di L-Glutammina	Invitrogen	25030-24	Per terreno RMM utilizzato a una concentrazione finale di  2 mM
di selenito di sodio	Sigma	S9133	Per mezzo RMM utilizzato ad una concentrazione finale di 40 ng/ml
bFGF	Peprotech	AF-100-15	Da aggiungere al terreno RMM, utilizzato ad una concentrazione finale di 10 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-188	Da aggiungere al terreno RMM, utilizzato a una concentrazione finale di 20 ng/ml
4-OHT	Sigma	H7904	Da aggiungere al terreno RMM, utilizzato a una concentrazione finale di 100 nM
Laminin	AMS Biotech	3400-010-10
TrypZean/EDTA	Lonza	BE02-034E
Acqua per l'irrigazione	Baxter Healthcare	UKF7114
Inibitore definito della tripsina (DTI) (conservare -20° C)	Piastra Invitrogen	R007-100
Alvetex a 12 pozzetti	Reinnervate Ltd	AVP002
Etanolo	Merck	1.00986.1000
β III anticorpo della tubulina	Sigma	T8660
Hoechst	Sigma	B2261
miRNeasy mini kit	Qiagen
DNasi senza RNasi	Qiagen	79254
Cloroformio	Sigma	C7559-5VL
miScript II RT Kit	Qiagen	218160
Kit PCR verde SYBR	Qiagen
Sviluppo cellulare & Differenziazione miScript miRNA PCR Array	Qiagen/ SABiosciences	MIHS-103Z
Lightcycler 480 bianco 96 piastra	Roche
Lightcycler 480  pellicola sigillante	Roche
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR cloni bersaglio	GeneCopeia	HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR cloni bersaglio	GeneCopeia	HmiT017632-MT01
Allstars controllo negativo siRNA AF 488 (Qiagen).	Qiagen	1027284	Controllo della trasfezione di MiRNA
Luc-Pair miR Saggio della luciferasi	GeneCopeia	LPFR-M010
Lightcycler 480	Luminometro per micropiastre Roche
GloMax 96	Promega