Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

Summary

Descriviamo un protocollo per monitorare la mobilità radiale delle cellule immunitarie non aderenti in vitro utilizzando un collettore/apparato di vetrini per sedimentazione cellulare. La migrazione cellulare viene tracciata su monostrati di cellule tumorali o su proteine della matrice extracellulare. L'esame al microscopio ottico e a fluorescenza consente di osservare la mobilità cellulare e la funzionalità citotossica.

Abstract

Riportiamo un romanzo adattamento del dosaggio migrazione cellulare Monolayer radiale, prima riferito a misurare la migrazione radiale delle cellule tumorali aderenti su proteine ​​della matrice extracellulare, per misurare la motilità, umane non aderente o effettrici murine cellule immunitarie fluorescenza marcata. Questa tecnica utilizza un collettore in acciaio inox e 10 ben scorrevole in Teflon per depositare focally cellule T non aderenti nei pozzetti preparati sia con monostrati confluenti di cellule tumorali o proteine ​​della matrice extracellulare. Luce e / o multicanale microscopia a fluorescenza viene utilizzato per monitorare il movimento e il comportamento delle cellule effettrici nel tempo. Coloranti fluorescenti e / o vettori virali che codificano per transgeni fluorescenti sono usati per etichettare in modo differenziato i tipi di cellule per l'imaging. Questo metodo è distinto da simile tipo in vitro che traccia orizzontale o verticale migrazione / invasione utilizzando camere di diapositive, agar o transwell piatti. Il test permette di dati dettagliati di imaging a Be raccolti con differenti tipi cellulari caratterizzati da marcatori fluorescenti specifici; anche sottopopolazioni di cellule specifiche (ad esempio, trasdotte / nontransduced) possono essere monitorati. Superficie trame fluorescenza intensità vengono generati utilizzando i canali di fluorescenza specifici corrispondenti al tipo di cellula migrazione. Questo permette una migliore visualizzazione della mobilità non aderenti delle cellule immunitarie in momenti specifici. È possibile raccogliere prove di altre funzioni delle cellule effettrici, quali citotossicità o il trasferimento di vettori virali da effettore alle cellule bersaglio, pure. Così, il metodo permette ai ricercatori di documentare microscopicamente cellula-cellula interazioni di differenzialmente-marcato, non aderente con cellule aderenti di vario tipo. Tali informazioni possono essere particolarmente rilevanti nella valutazione di tipi di cellule immunitarie biologicamente manipolati o attivati, in cui la prova visiva della funzionalità si desideri con cellule bersaglio tumorale prima di utilizzarli per la terapia del cancro.

Introduction

Il test di migrazione cellulare monostrato Radial è stato originariamente sviluppato per misurare le proprietà infiltrative delle cellule tumorali aderenti ^1-4 su vetrini rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine ^​​5-7 o con i componenti ECM individuali, come la fibronectina o laminina ^1,2. La tecnica coinvolto seminare una sospensione di cellule singole cellule tumorali nel centro di pozzetti usando un collettore sedimentazione cellulare acciaio inossidabile (CSM). Dopo sedimentazione, le cellule tumorali sarebbero aderire al fondo del pozzo e la variazione del diametro della popolazione cellulare iniziale nel tempo usato per stabilire un tasso di motilità orizzontale. Il test di migrazione cellulare monostrato Radial ha fornito un vantaggio visivo rispetto ad altri metodi esistenti che impiegavano transwell piastre per saggio le capacità migratorie in vitro di cellule; questi test non sono favorevoli alla formazione immagine ^8. Come pure, ha fornito anche una grande quantità di libertà nella scelta del timepoints in sede di valutazione della migrazione, senza alcun limite al numero di timepoints un ricercatore potrebbe scegliere di immagine dopo la sedimentazione.

Poiché la capacità di migrare è una funzionalità importante per le cellule non aderenti, soprattutto nella zona di immunoterapia o dove possono essere utilizzate come veicoli di consegna per vettori virali, abbiamo adattato l'uso del CSM per valutare la migrazione di cellule non aderenti tipi su monostrati di cellule tumorali, in aggiunta alle proteine ​​ECM. Il vantaggio di microscopicamente visualizzare la migrazione delle cellule non aderenti su monostrati di cellule tumorali vitali, il ECM complesso isolato dal tumore, o sui componenti ECM singoli rende questo test versatile. Saggi che utilizzano pozzi rivestiti con una singola proteina extracellulare non riflettono accuratamente il substrato tessuti ECM o tumore delle cellule sarebbero migrare attraverso in vivo.

Qui, abbiamo usato alloreattivi linfociti T citotossici (alloCTL), sensibilizzati ai principali histocompcomplesso atibilità (MHC) proteine ​​utilizzando reazioni a senso unico di cellule tumorali linfocitaria mista (MLTR) o reazioni linfociti misti (MLR) ^9, come il nostro tipo di cella non aderente rappresentante. Abbiamo testato le celle sia di origine umana e murina. Quando la migrazione è stata misurata su monostrati tumorali, le cellule tumorali sono state impiegate obiettivi parzialmente rilevanti, mostrando alcune delle stesse proteine ​​MHC presenti nella popolazione cellulare utilizzato per sensibilizzare gli effettori, o obiettivi pienamente rilevanti, con una serie completa di molecole MHC che la effettori erano stati sensibilizzati verso. In alcuni esperimenti, abbiamo usato CellTracker fluorescente Red CMPTX o proliferazione cellulare dye eFluor 670 di distinguere tra cellule effettrici e di destinazione. Abbiamo anche utilizzato la trasduzione con codifica vettori virali per proteine ​​fluorescenti come un ulteriore modo per visualizzare le cellule. Per alcuni test, abbiamo transdotte la alloCTL con vettori retrovirali replicanti (RRV) che codificano per Emerald Green (EMD) proteina fluorescente ^10,11; per OTHERS, le cellule tumorali sono state trasdotte con vettori lentivirali codificanti per mStrawberry.

Il alloCTL sono stati seminati attraverso un canale del collettore al centro di entrambi i monostrati di cellule tumorali o ECM raccolti da monostrati cellulari tumorali. Interazioni delle cellule aderenti e non aderenti sono state visualizzate mediante luce e / o mediante microscopia a fluorescenza nel tempo. Turbativa in monostrato cellula tumorale a bassa potenza, o tumore cellule con nuclei frammentati ad alta potenza sono indicatori di danno cellulare da lisi e apoptosi, rispettivamente. Abbiamo creato digitalmente mappe fluorescenti di intensità superficie che mostrano la migrazione di cellule fluorescenti T non aderenti sulle colture monostrato. Abbiamo notato anche la citotossicità generato per l'aderente monostrato cellulare glioma dopo la formazione di cluster del sovrapposto alloCTL non aderente. Come pure, è stato osservato trasduzione orizzontale RRV-EMD dalla alloCTL al monostrato glioma.

Protocol

1. Far scorrere Preparazione

1. Inserire sedimentazione cellulare slide collettore in sacchetti di sterilizzazione e sigillare con nastro autoclave. Affrontare il lato rivestito di teflon della slitta della carta lato del sacchetto per evitare depositi di plastica sui pozzetti.
2. Sacchetti autoclave per 15 min a 121 ° C.
3. Rimuovere il vetrino dalla busta di sterilizzazione in un armadio biosicurezza e posto in un 150 x 15 mm piastra di Petri sterile sterile. Fino a quattro diapositive può andare bene per ogni piatto. Inserire un piatto 35 x 10 mm Petri accanto alle diapositive. Aggiungere 2-3 ml di H ₂ O sterile per fornire umidificazione.
4. Vetrini pre-cappotto con poli-D-lisina a 100 mcg / ml usando un volume sufficiente per coprire bene l'intero. Dopo un ora a RT, aspirare la soluzione e risciacquare la superficie del pozzetto due volte pipettando 1x PBS sulla superficie dei pozzetti.
5. Facoltativamente, aggiungere fibronectina o altri componenti ECM per garantire maggiore aderenza del tumore delle cellule. Aggiungi fibronectina a 5 mg / ml in un volume sufficiente that pozzetti non sarà asciutto entro un breve periodo di tempo a temperatura ambiente.
   1. Dopo 1 ora, aspirare la soluzione rimanente e lavare due volte pipettando su e giù con 1x PBS.
6. Mantenere PBS sui pozzetti fino tumore è pronta per la placcatura. Utilizzare scorre lo stesso giorno.
7. Raccolto un pallone confluente del aderenti tipo cellula tumorale desiderato. Contare cellule vitali utilizzando Trypan Blue dye esclusione di microscopia ottica e risospendere a 5 x 10 ⁶ cellule / ml in crescita esempio medio per adeguatamente-buffered, mezzo essenziale minimo di Dulbecco (DMEM) con siero fetale bovino 10% (FBS), L- glutamina e piruvato di sodio.
8. Se si desidera l'imaging fluorescente della popolazione di cellule aderenti, etichettare la popolazione di cellule aderenti con un colorante fluorescente vitale o un colorante proliferazione cellulare seguendo i protocolli forniti dal produttore.
9. Uniformemente pipetta 10 ml di terreno completo in ogni pozzetto della cura slitta prendere per evitare di creare bolle in wells, in quanto questi può prevenire uniforme adesione delle cellule tumorali.
10. Aggiungere 2,5-5,0 x 10 ⁴ cellule (5-10 microlitri di sospensione cellulare) al mezzo in ogni pozzetto (Figura 1A). Regolare il numero ottimale a seconda del tipo di cellule tumorali e il numero di giorni di crescita desiderati. Cellule tumorali più grandi o cellule in rapida crescita potrebbero richiedere un minor numero di cellule inizialmente. Portare il volume ben fino a 40 microlitri aggiungendo medio e pipetta su e giù per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule.
11. Dopo tutti i pozzetti sono teste di serie, permette alle cellule tumorali di aderire a RT, quindi posizionare il coperchio sulla piastra di Petri di 150 x 15 mm e con attenzione spostare il piatto per un 37 ° C / 5% di CO ₂ incubatore umidificato per almeno 24 ore.
12. Cambiare il terreno di coltura quotidiano. Pipettare attentamente una porzione del mezzo esaurito dal monostrato e sostituirlo con terreno fresco completa.
    NOTA: A causa di evaporazione, più volume dovrà essere aggiunto che è stato tolto. Wells sarà pronto per il dosaggio quando ancora, conflconfluente strato di cellule è presente. Questo è in genere 1-3 giorni dopo la semina iniziale.
13. Lavare monostrato delicatamente una volta con PBS come descritto al punto 1.4 e sia passare al punto 2, se si desiderano monostrati, o al punto 1.13 sotto per estrarre proteine ​​ECM dal monostrato.
14. Fare un (v / v) 0,5% Triton-X in mezzo completo e aggiungere 30 microlitri di ogni bene. Lasciate monostrato digerire in cappuccio per 2 minuti, poi lavare due volte con terreno completo pipettando come descritto sopra.
    NOTA: Lo strato ECM può essere visibile al microscopio ottico (Figura 2). Utilizzare vetrini subito, o di tenere in terreno completo in umidificata CO ₂ incubatore per 1-2 giorni. Evitare che i pozzetti si asciughino.

2. La sedimentazione di cellule T non aderenti su diapositive

1. Se si desidera l'imaging a fluorescenza della popolazione di cellule non-aderenti, etichettare le popolazioni di cellule non-aderenti con un colorante fluorescente vitale, come CFSE, Tracker Red Cell CMPTX, o eFluor670 seguendo i protocolli forniti dal produttore di almeno 1 ora prima del test. In alternativa, manipolare le cellule di esprimere proteine ​​fluorescenti codificate dai vettori virali.
2. Autoclavare collettore sedimentazione delle cellule in un sacchetto autoclave descritta sopra 1.2.
3. Rimuovere la camera umidificata contenente vetrini rivestiti in teflon dal termostato e posto in cella di sicurezza biologica.
4. Lavare i pozzetti con PBS 1x pipettando su e giù, poi aggiungere 45 ml di terreno completo contenente% di siero di almeno 10.
5. Rimuovere il collettore dalla busta di sterilizzazione e far scorrere con attenzione in oltre pozzetti fino al 'gancio' alla fine del collettore tocca la parte inferiore della slitta (Figura 1B).
6. Assicurarsi che il terreno di coltura è visibile in ciascuno dei canali. Se non si vede, togliere il collettore e aggiungere più medio corrispondente bene, quindi sostituire e controllare di nuovo.
7. Ripetere il passaggio 2.5 per ogni chanNel del collettore, o a molti pozzi lo desideri.
8. Contare le cellule non aderenti e risospendere a non meno di 1,0-2,0 x 10 ⁵ / ml. Redigere 1 ml di cellule e lentamente li pipetta nel canale (Figura 1C). Fate questo per ogni bene desiderato.
9. Lasciare l'intera cella apparecchiatura caricata, cioè, collettore e scorrevole, all'interno della bio-cappuccio per 20-30 minuti per consentire alle cellule nel canale di stabilirsi.
10. Rimuovere il collettore toccando entrambe le estremità e delicatamente sollevandolo verso l'alto dalla slitta in modo da non disturbare le cellule focally seminate nel centro dei pozzi (Figura 1D).
11. Controllare ciascun pozzetto per assicurare che le cellule non aderenti sono state seminate con successo al centro del pozzo rimanere all'interno della circonferenza del canale collettore. Le cellule non aderenti saranno idealmente leggermente aderire al monostrato o ECM e tra loro, quindi spostando delicatamente il vetrino attorno non causerà la pelle cellulet per disperdere. Non jostle la diapositiva.

3. microscopia a fluorescenza

1. Con adeguate attrezzature sperimentali, eseguire imaging dopo sedimentazione è confermato. Idealmente, utilizzare un microscopio che è dotato di una camera di CO ₂ e umidità. Immagine a bassa potenza, cioè, 4X o 10X, per consentire più immagini da prendere di un'area più grande in modo che la totalità del pozzo può essere visto.
2. Acquisire le immagini digitali utilizzando il software di acquisizione delle immagini. Eseguire campo chiaro e / o multi-canale di imaging di fluorescenza.
3. Se lo si desidera, impostare un time-lapse di registrare immagini in canali diversi su una determinata zona, o mantenere la diapositiva umidificata e in un / 5% di CO ₂ incubatore 37 ° C e manualmente togliere all'immagine nei momenti desiderati (Figura 1E e F, consigliato per i punti di tempo più lungo).

4. Analisi e display

1. Utilizzando immagini software di editing, fondere luce e flimmagini fluorescenti in un livello in modo più tipi di cellule e marcatori possono essere visti nella stessa immagine. Trascinare i file di immagine per ogni singolo colore nel programma e, quando richiesto, selezionare l'opzione 'Aggiungi Layer' per creare un file immagine con più livelli.
   1. A maggiore ingrandimento, prendere, allineare e cucire insieme le immagini di tutto il bene digitale. Allineate file cercando in regioni conservate tra due immagini e sovrapponendo un'immagine sopra l'altra fino viene generato un quadro completo.
2. Aggiungere bar micron alle immagini durante l'acquisizione utilizzando il software di cattura per determinare la distanza singole celle sono migrati.
3. Per determinare la migrazione delle cellule in vari momenti, fare mappe fluorescenza intensità superficie con software di immagini, cioè, ImageJ, per quantificare l'aggregazione delle cellule T fluorescente o diffusi nel corso del tempo.
   1. Per generare grafici di superficie, prendere un'immagine stratificata generato nella fase 4.1 e sotto la finestra Livelli,deselezionare tutti i livelli tranne quelle corrispondenti al canale desiderato. Per esempio, se un grafico della superficie si desidera visualizzare espressione EMD, solo gli strati "verdi" corrispondenti al filtro utilizzato per questo marcatore dovrebbero essere visibili.
   2. Appiattire l'immagine e salvarla in un formato di file riconosciuti (ad esempio, .png) e caricare l'immagine nel programma. Per generare la trama della superficie, modificare il tipo di immagine a 8-bit, modificare la luminosità / contrasto come necessario per ridurre il fondo, e selezionare l'opzione 'Analizza / Surface Plot'. Le immagini in figura 5 sono stati generati controllando il 'Ombra', 'Draw Axis', 'un poligono Per Line', e caselle di controllo 'liscio'.
   3. In alternativa, prendere misurazioni utilizzando il raggio o il diametro dal deposito cellulare focale al tempo zero e confrontarle con le cellule al punto più esterno in tempi diversi. Il diametro del Teflon pozzi è del 6,0 mm.

Results

Vettori virali codificanti per proteine ​​fluorescenti possono essere utilizzati in aggiunta o al posto di, colorante fluorescente. Trasduzione virale deve essere eseguita prima del dosaggio motilità. Entrambi i tipi di cellule aderenti e non aderenti possono essere differenzialmente etichettati. Il protocollo per la trasduzione dipenderà dal tipo di vettore impiegato. Qui, trasdotte il alloCTL nelle figure 3, 5 e 6 con RRV-EMD almeno due giorni di anticipo del test utilizzando il proto...

Discussion

Le cellule tumorali in una sospensione di cellule singole sono stati pipettati nei pozzetti di una slitta Teflon mascherato. Le cellule potevano aderire e poi formate monostrati in un umidificata al 5% di CO _2, 37 ° C incubatore (Figura 1A). Monostrati affermati o proteine ​​ECM derivati ​​dal monostrato potrebbero essere raccolti per questi test (Figura 1B). T effettrici linfociti marcati con coloranti fluorescenti vitali o trasdotte con vettori codificanti per EMD sono stat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vetrini per microscopio mascherati in teflon Metodi	scientifici creativi	CSM002
Collettore di sedimentazione cellulare	Metodi scientifici creativi	CSM001
Piastra di Petri, 150 mm	Corning	430597
Piastra di Petri, 35 mm	Corning	430588
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Mediatech	21-040
20 μ l Pipetman	Gilson	F123600
200 μ l Pipetman	Gilson	F123601
200 μ l puntali per pipette	VWR	89003-060
Acqua distillata e deionizzata (sterile)	Mediatech	25-055
Tripsina	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Rosso CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (opzionale)	Gibco	12604
Terreni di coltura cellulare tumorale (es. DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V terreni senza siero	Invitrogen	12055-083
Siero fetale bovino	Omega Scientific	FB-02
Microscopio
SPOT	Strumenti
Poli-D-lisina	Millipore	A-003-E
Fibronectina	BD	354008
31/2 x 51/4 Buste per autoclave	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Proliferazione cellulare eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH