Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

Sommario

Dimostreremo come preparare fette di retina dall'occhio del topo e registrare le risposte alla luce nei neuroni retinici. L'intera procedura viene eseguita in condizioni adattate al buio.

Abstract

La retina è la porta verso il sistema visivo. Per comprendere i meccanismi di elaborazione dei segnali visivi, indaghiamo funzioni di rete neurale della retina. I neuroni della retina nella rete comprendono numerosi sottotipi. Più di 10 sottotipi di cellule bipolari, cellule gangliari, e le cellule amacrine sono stati identificati da studi morfologici. Più sottotipi di neuroni della retina sono pensati per codificare le caratteristiche distinte di segnalazione visiva, come il movimento e il colore, e la forma più percorsi neurali. Tuttavia, i ruoli funzionali di ciascun neurone nel trattamento del segnale visivo non sono pienamente compresi. Il metodo di patch clamp è utile per affrontare questa questione fondamentale. Qui, un protocollo per registrare risposte sinaptiche luce evocati nel topo neuroni della retina con delle patch clamp registrazioni in condizioni di oscurità adattato è fornito. Gli occhi del mouse sono dark-adattato O / N e preparazioni fetta della retina vengono sezionati in una stanza buia con illuminazione ad infrarossi e gli spettatori. Luce infrarossa non lo faattivare fotorecettori mouse e conserva quindi la loro capacità di risposta luce. Patch clamp viene utilizzato per registrare le risposte luce evocata nei neuroni della retina. Un colorante fluorescente viene iniettato durante le registrazioni per caratterizzare sottotipi morfologiche neuronali. Questa procedura permette di determinare le funzioni fisiologiche di ogni neurone nella retina mouse.

Introduzione

La retina è una delle parti uniche del sistema nervoso. Essendo una parte accessibile del cervello, la sua architettura sinaptica è stata ben caratterizzata. Inoltre, le funzioni di questa rete neurale possono essere esaminate con uno stimolo fisiologico: la luce. Se il tessuto retinico viene isolato in una camera buia con procedure appropriate, i neuroni nel tessuto risponderanno alla luce. Questa preparazione è stata utilizzata per studiare l'elaborazione del segnale visivo e chiarire vari meccanismi sinaptici e funzioni della rete neurale, nonché i meccanismi della malattia.

Le risposte alla luce nei neuroni retinici sono state registrate per decenni. I primi studi hanno utilizzato elettrodi affilati per effettuare registrazioni intracellulari dai neuroni retinici del cucciolo di fango¹. Negli anni '80, la tecnica del patch clamp è stata inventata² e presto è diventata un metodo popolare tra i ricercatori della vista^3,4. Le registrazioni di singole cellule da vertebrati inferiori, inclusi i neuroni retinici di fango e pesce, sono stati metodi popolari che hanno contribuito a chiarire i meccanismi di elaborazione del segnale visivo^5,6.

Dopo che sono state sviluppate tecniche di mutazione genetica, la retina del topo è diventata un modello più popolare per i ricercatori della visione^7-9. La retina dei mammiferi è più attraente di quella dei vertebrati inferiori perché è evolutivamente più vicina alla retina umana e c'è l'opportunità di utilizzare modelli di malattia. Tuttavia, le cellule retiniche di topo sono piccole e fragili¹⁰ e fare preparazioni retiniche e condurre registrazioni con patch clamp in una stanza buia è impegnativo. Con il miglioramento della tecnologia, sono diventati disponibili diversi approcci per studiare i meccanismi di segnalazione visiva, come gli studi di imaging¹¹ e l'elettroretinogramma (ERG)¹². Tuttavia, la registrazione di singole cellule con il metodo patch clamp è ancora importante perché è altamente sensibile dal punto di vista temporale e spaziale rispetto ad altri metodi. Pertanto, abbiamo condotto continuamente registrazioni di patch clamp e migliorato i nostri metodi per studiare l'elaborazione del segnale visivo nelle preparazioni di fette di retina di topo^13-15.

In questo video tutorial, i protocolli vengono presentati con suggerimenti importanti. Una buona registrazione può essere ottenuta solo con una buona preparazione. Esercitarsi nella dissezione animale e costruire un robusto patch clamp rig consentirà alla maggior parte dei ricercatori di ottenere registrazioni di successo.

Protocollo

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso la Wayne State University.

1. Preparazione della soluzione sperimentale

1. Preparare la soluzione di dissezione 1 giorno a 1 settimana prima l'esperimento vero e proprio. Utilizzare una soluzione tampone HEPES per la dissezione della retina a causa della sua forte capacità di buffering a temperature inferiori ^{a 16.} Mescolare tutti i prodotti chimici, come segue (in mm): 115 NaCl, KCl 2.5, 2.5 CaCl _2, 1.0 MgCl _2, 10 HEPES, 28 glucosio. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Conservare la soluzione in frigorifero fino a 1 settimana.
2. La soluzione di registrazione è medio Ames ', che è un fluido spinale cerebrale artificiale (aCSF) progettato per preparazioni retina ^17. Il giorno dell'esperimento, pesare polvere Ames '(4,4 g per 500 ml di soluzione) in un tubo. Inoltre, pesare NaHCO ₃ (0,95 g per 500 ml di soluzione) e mescolare con la Apolvere mes.
3. Preparare la soluzione pipetta intracellulare per le registrazioni di patch clamp dal giorno dell'esperimento. Mescolare tutti i prodotti chimici, come segue (in mm): 111 K-gluconato, 1.0 CaCl _2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl _2, 5 ATP-Mg, e 1,0 GTP-Na. Aggiustare il pH a 7,2 con KOH. Filtrare la soluzione pipetta con un filtro a siringa convenzionale. Fai ~ 500 microlitri aliquote e memorizzarli in un congelatore o un congelatore.

2. Preparazione per la Giornata di Experiment

1. La notte prima dell'esperimento, posizionare un topo in una gabbia (C57BL / 6J o background simile, 4 - 8 settimane di vita, di sesso maschile), in uno spazio buio per O / N adattamento al buio.
2. Preparazione per la dissezione:
   1. Riempire dissezione soluzione (100-200 ml) in un bicchiere di vetro, posizionarlo sul ghiaccio, e la bolla con l'ossigeno per almeno 10 min.
   2. Avviare ossigenazione della scatola buia per la conservazione di preparazione della retina.
   3. Preparare vetrini in plastica con guide di grasso per il riutilizzopreparazioni fetta fonodale e mettono ciascuno di essi in un piatto di plastica da 35 mm.
   4. Collegare un nuovo lama di rasoio per un chopper (affettatrice tessuto).
   5. Tagliare una membrana filtrante in due metà. Questo è per affettare retinica.
   6. Allineare gli strumenti di dissezione e di trasferimento pipette vicino al microscopio da dissezione. L'area di lavoro deve essere ben organizzato in modo che ogni strumento può essere facilmente accessibile al buio.
3. Preparazione per le registrazioni di patch clamp:
   1. Sciogliere la polvere Ames 'e NaHCO ₃ in acqua distillata (Ames 4,4 g e NaHCO ₃ 0.95g / 500 ml DDH ₂ O). Medio Bubble Ames 'ossigeno misto (95% O ₂ e 5% CO ₂₎ per almeno 30 minuti, mentre il riscaldamento a una temperatura di registrazione (~ 35 ° C). Regolare il pH a 7,4 con NaHCO ₃ mentre ancora ribolle.
   2. Scongelare la soluzione pipetta interno durante la dissezione. Dopo lo scongelamento, aggiungere 0,01% solforodamina B per la colorazione intracellulare.

3. retina Dissection

1. In una stanza buia, eutanasia il mouse utilizzando anidride carbonica e pneumotorace bilaterale. Dopo 2 - 3 min usando l'anidride carbonica, il mouse perderà coscienza.
2. Quando il mouse non risponde ad una presa di coda, enucleare rapidamente gli occhi e metterli in una soluzione di dissezione a freddo in un piatto di plastica. Eseguire il pneumotorace bilaterale per assicurare la morte dell'animale. Memorizzare rapidamente l'occhio nel piatto nella scatola buia. Utilizzare un visualizzatore a infrarossi per condurre la procedura nel buio.
   NOTA: In alternativa, isoflurano, decapitazione, o dislocazione cervicale può essere utilizzato per l'eutanasia. Il metodo di eutanasia dovrebbe seguire le linee guida del National Institute of Health (NIH) e / o la cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale.
3. In una stanza buia, regolare il microscopio da dissezione e illuminazione ad infrarossi. Al microscopio, trasferire un occhio dal suo piatto in un piatto di plastica 10 centimetri won la soluzione dissezione raffreddato. Continuously bolla ossigeno attraverso il tubo posto sul fondo del piatto di plastica. Regolare il volume del flusso in modo che non sia troppo basso, ma assicurarsi che non è sufficiente a disturbare la dissezione.
4. Cornea e obiettivo la rimozione:
   1. Fare un'incisione sulla parte superiore della cornea con un coltello micro-chirurgica. Tenendo il nervo ottico all'altra estremità del bulbo oculare impedisce l'occhio da movimento. Estendere il taglio utilizzando un paio di forbici chirurgiche. Tagliare la cornea con un po 'sclera intorno ad esso.
   2. Afferra l'obiettivo con una pinza sottile e tirare lentamente la lente fuori. Se il vitreo è troppo appiccicoso per rimuovere la lente, tagliare il vitreo con un paio di forbici.
   3. Una volta che l'occhio-tazza è fatta, versare lentamente il freddo, la soluzione dissezione ossigenata in oculare con una piccola pipetta di trasferimento.
      NOTA: Il bulbo oculare si sgonfia rapidamente dopo un incisione nella cornea. È importante mantenere la forma dell'occhio come deformare l'occhio durante questo proprocedura danneggia la retina e provocare il distacco di retina.
5. Identificare i lati dorsale e ventrale della retina:
   NOTA: A causa della distribuzione non uniforme del verde e la luce ultravioletta (UV) Coni ^18, che identifica una specifica area della retina è importante per le registrazioni di risposta di luce.
   1. Identificare la linea che attraversa l'oculare retinica passando vicino alla testa del nervo ottico. Questa linea passa per lo più attraverso il lato ventrale del nervo ottico; lato compreso il nervo ottico è il lato dorsale, mentre l'altro è ventrale ^19. Vedere questo punto di riferimento chiaramente sotto spettatori infrarossi.
   2. A seconda dello scopo dell'esperimento, fare un taglio sul lato inutili. Questo sarà utile dopo aver isolato la retina dalla oculare.
6. Rimozione del vitreo:
   1. Facoltativamente, incubare l'occhio-tazza con ialuronidasi (0,5 mg / ml) per 15 min.
   2. Rimuovere il vitreo con una pinza extra-fini. Il vitreo è principalmenteattaccato al fondo e il bordo esterno dell'occhio tazza. Rimuovere delicatamente senza toccare o frugando la retina. Come il vitreo potrebbe essere strettamente collegato al oculare, rimuovere delicatamente per evitare il distacco della retina dall'occhio-coppa. Continuare a tirare fino a quando non la tensione si fa sentire.
      NOTA: Questo passaggio è particolarmente importante per sezionare la retina del mouse; Tuttavia, non è un problema per le retine di altre specie come il ratto o salamander.
7. Isolare la retina dall'occhio-coppa. Afferra la sclera e staccare delicatamente la retina con la parte posteriore del forcipe.
   NOTA: Whole-mount preparati retina può essere fatto dalla retina isolata. Fare tre o quattro tagli ai bordi e appiattire la retina, o tagliare la retina in diversi pezzi.
8. Tagliare la retina e scartare il superfluo metà della retina (punto 3.5). Nello stesso piatto di plastica, tagliare la retina rimanente in due pezzi. Per ogni pezzo della retina, tagliare i bordi per effettuare unalastra della retina, e tagliare i bordi di piegatura.
9. Trasferire una lastra retinica su una lastra di vetro usando un grande pipetta di trasferimento (~ 2 ml). Aspirare la soluzione in eccesso con una piccola pipetta, utilizzare un pezzo di carta da filtro per appiattire la lastra, e quindi inserire rapidamente un pezzo della membrana filtrante sulla parte superiore del tessuto.
   1. Usando una piccola pipetta di trasferimento, una goccia di soluzione di dissezione sulla membrana del filtro. Attendere ~ 15 sec finché la soluzione estende su membrana. Durante questo tempo, il tessuto retinico si attacchi alla membrana filtrante.
   2. Versare soluzione dissezione più freddo sotto e intorno al filtro. Il tessuto retinico con la membrana del filtro galleggerà. Afferra la membrana filtro con una pinza e posizionarlo nella camera di taglio. Versare dissezione soluzione sopra il tessuto, e memorizzare la preparazione in scatola buia.
      NOTA: La procedura descritta è critica. È importante eseguire questi passaggi rapidamente per garantire che i bastoni tessuto retinico ai mem filtribrane e non si secca.
10. Utilizzando un chopper, tagliare il tessuto retinico a fette. Circa 200 micron di spessore è fattibile per gli studi di patch clamp.
11. Posizionare un coprioggetto di plastica con guide di grasso nella camera di taglio. Trasferire una fetta retina sopra le rotaie grasso su un vetrino coprioggetto di plastica. Ruotare la fetta 90 ° in modo che la sezione trasversale è visibile. Premere la membrana del filtro verso il basso sul vetrino, quindi, coprire i lati della carta da filtro con grasso.
    1. Dopo la fetta è immobilizzato su un coprioggetto di plastica, afferrare il coprioggetto e trasferirlo in un piatto di plastica da 35 mm. Versare soluzione dissezione a freddo sulla preparazione della retina e immergere la preparazione. Conservare ogni piatto nella scatola scura, che dovrebbe essere ossigenato continuamente.
       NOTA: L'intera procedura deve essere fatto con cura in modo che la membrana filtro non è deformata. Altrimenti, la fetta retina separa facilmente dalla membrana del filtro.

4. Bloccare Registrazioni patch da Retinal Slice Preparazione

1. Preparazione di registrazione:
   1. Prime i tubi di perfusione con media Ames '. Lasciare tutte le bolle di passare attraverso quando si riempie il tubo.
   2. Fai pipette di registrazione patch clamp con un estrattore. Per riempire una pipetta con la soluzione di pipetta, tuffo nella parte posteriore di una pipetta per 1 minuto fino a quando la punta della pipetta è riempita. Successivamente, riempire ~ 1/3 della pipetta utilizzando un filler micro-pipetta. Conservare ogni pipetta in una scatola pipetta umido.
   3. Accendere l'apparecchio per le registrazioni di patch clamp; incluso il computer, amplificatore, telecamera CCD, e microscopio.
2. Spegnere la luce della stanza. Mettere una preparazione fetta della retina sulla camera palco microscopio con un visualizzatore a infrarossi. Dopo che è immobilizzato, iniziare perfusione continua. Impostare la temperatura perfusione a 33 a 37 ° C.
3. Visualizza la superficie fetta con la fotocamera CCD. Focus sul luogo di destinazione in cui il ce bersagliotipi ll risiedono. Selezionare una cellula sana, cercando di patch clamp registrazione (ad esempio, dovrebbe avere superficie liscia di aspetto e la forma delle cellule buona).
4. Inserire una pipetta di registrazione in un supporto pipetta. Avanzare la pipetta alla preparazione fetta. Quando è vicino alla preparazione fetta (~ 2 mm sopra), trovare la punta della pipetta con il microscopio. Una volta che il puntale è visibile al microscopio, spostare la punta verso la cella di destinazione.
5. Impostare l'amplificatore. Regolare la pipetta a 0 mV / 0 pA (azzeramento) e avviare un impulso elettrico continua di ~ 5 mV a ~ 10 Hz. Controllare la resistenza pipetta; resistenza ideale è compresa tra 5 e 10 MW per la maggior parte dei neuroni della retina.
6. Inizia soffia fuori dalla punta. Utilizzare un boccaglio, o utilizzare una siringa, per applicare pressione positiva quando la pipetta immerge nella soluzione del bagno. Continuo soffiare la soluzione interna finché la punta è sulla superficie della cellula bersaglio.
   1. Quando la pressione positiva fa una piccola fossetta thsuperficie cellulare e, avanzare la punta leggermente e smettere di soffiare fuori. Verificare la resistenza pipetta, che dovrebbe aumentare. Se è in continuo aumento, lasciarlo e monitorare la resistenza fino a raggiungere> 1 GΩ (gigaseal). Se la resistenza non aumenta spontaneamente, applicare delicatamente pressione negativa fino a diventare un gigaseal.
7. Dopo il gigaseal è raggiunto, modificare il potenziale tenendo a -70 mV. Quindi, applicare ad intermittenza pressione negativa alla rottura della membrana all'interno della punta della pipetta. Quando viene effettuata la configurazione whole-cell, la resistenza pipetta può essere compreso tra 500 MW e 1 GΩ, e la corrente capacitiva è visto. A volte correnti postsinaptiche spontanee possono essere osservati.
8. Registrare il rapporto IV da -80 a +40 mV. Diversi tipi di canali voltaggio-dipendenti vengono attivati ​​a seconda del tipo di cellula.
9. Record luce evocata correnti sinaptiche o tensioni.

Risultati

Una preparazione fetta rappresentativo è mostrato in Figura 1. La preparazione fetta è in posizione diritta, mostrando fotorecettori alle cellule gangliari in una superficie piana, e nessun distacco dalla carta da filtro. Se la porzione è inclinato, solo una parte della preparazione è a fuoco, il che rende difficile identificare una cella appropriata di patch serraggio. Per le registrazioni, è importante scegliere un buon soma, che di solito ha una superficie lucida, una forma rotonda ancora, e non visi...

Discussione

Una buona registrazione può essere ottenuta solo con una buona preparazione della retina e configurazioni di patch clamp ben progettate. Sebbene tutti i passaggi sopra descritti siano importanti, la discussione evidenzia alcuni passaggi critici sia per la dissezione che per le registrazioni.

Per la dissezione, due cose sono particolarmente importanti: il raffreddamento e l'ossigenazione. Dopo aver enucleato l'occhio, rimuovere rapidamente la parte anteriore dell'occhio in una camera di dissez...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi (28-60 giorni, maschio)	Jackson laboratory	C57BL/6J ceppo
Ames' polvere media	Sigma	A1420	eccellente
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ745	eccellente
Strumento di dissezione: pinze	Dumont	#4, #5, #55	eccellente
Strumento di dissezione: forbici	Roboz	RS-5605	eccellente
Strumento di dissezione: coltello chirurgico	Surgistar	7514	eccellente
lama di rasoio (per elicottero)	EMS	71970	eccellente
Chopper	fatto a mano
Visualizzatore a infrarossi	Night Owl Optics	NOBG1	Mostra una visione luminosa. La messa a fuoco di piccoli oggetti è un problema.
Estrattore	Sutter	P-1000	eccellente; produce pipette di dimensioni costanti.
Dark box	Pelican	dark box	eccellente
sistema di bloccaggio patch	Scientifica	slice scope 2000	Ottima configurazione. La maggior parte dei componenti chiave sono inclusi in un unico pacchetto. I micromanipolatori sono eccellenti.
Amplificatore	Molecular Devices	multiclamp 700B	Controllo eccellente e facile.
Software di acquisizione	Software Molecular Devices	pClamp	Controllo eccellente e semplice.
Sorgente luminosa (LED)	Cool LED	pE-2 Sistema a 4 canali	Eccellente
telecamera CCD	Q-imaging	Retiga 2000	Eccellente
gabbia di Faraday	fatta a mano