Articolo metodologico

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/52428

⸱

16 febbraio 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo descrive un saggio basato sulla crescita del lievito per la determinazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Dimostra anche un metodo per l'estrazione rapida delle proteine del lievito, adatto al western blotting per confermare biochimicamente i requisiti di degradazione. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regolamentato degradazione delle proteine ​​è fondamentale per praticamente ogni funzione cellulare. Inizialmente Molto di ciò che è noto circa i meccanismi molecolari e requisiti genetici per eucariotica degradazione delle proteine ​​è stato fondato nel Saccharomyces cerevisiae. Analisi classici di degradazione delle proteine ​​hanno fatto affidamento su metodologie pulse-chase e cicloeximide-chase biochimici. Mentre queste tecniche prevedono mezzi sensibili per osservare la degradazione delle proteine, sono complessi, in termini di tempo, e bassa produttività. Questi approcci non sono suscettibili di screening rapido o su larga scala per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per l'identificazione facile dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​è descritto. In questo saggio, un enzima giornalista necessari per la crescita in condizioni selettive specifiche è fuso ad una proteina instabile. Le cellule privi del giornalista enzima endogeno, ma che esprimono la proteina di fusione può crescere sotto selecondizioni ctive solo quando la proteina di fusione è stabilizzato (cioè quando la degradazione delle proteine ​​è compromessa). Nel saggio di crescita qui descritto, diluizioni seriali di wild-type e le cellule di lievito mutanti che ospitano un plasmide codificante una proteina di fusione sono macchiati su terreno selettivo e non selettivo. Crescita in condizioni selettive è coerente con la degradazione compromissione da una determinata mutazione. Una maggiore abbondanza di proteine ​​deve essere confermata biochimicamente. Un metodo per la rapida estrazione di proteine ​​di lievito in una forma adatta per elettroforesi e western blotting è anche dimostrato. Una lettura di crescita a base per la stabilità proteica, combinato con un semplice protocollo per l'estrazione di proteine ​​per l'analisi biochimica, facilita la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine ​​di breve durata. Nell'esempio presentato, l'enzima HIS3, che è richiesto per la biosintesi istidina, è stata fusaa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 è mirato per la degradazione dopo si innesta aberrante reticolo endoplasmatico translocon. Le cellule che ospitano Deg1 -Sec62-HIS3 sono stati in grado di crescere in condizioni selettive quando la proteina è stato stabilizzato.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degradazione delle proteine ​​selettiva è essenziale per la vita eucariotica, e alterata degradazione delle proteine ​​contribuisce ad una serie di condizioni mediche, tra cui diversi tipi di cancro, malattie neurodegenerative, le malattie cardiovascolari, e la fibrosi cistica 1-5. Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), che catalizza la degradazione delle proteine ​​selettivo, è un obiettivo terapeutico emergente per queste condizioni 6-10. Ubiquitina ligases covalente attribuiscono polimeri dell'acido ubiquitina 76-amino alle proteine ​​11. Le proteine ​​che sono stati marcati con catene polyubiquitin sono riconosciuti e proteolyzed dai ~ 2,5 megadalton proteasoma 26S 12. Gli studi avviati nel organismo modello eucarioti Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono fondamentale nella spiegazione dei meccanismi di degradazione delle proteine ​​nelle cellule eucariotiche. Il primo substrato fisiologico dimostrato dell'UPS era il lievito repressore trascrizionale MATα2 13, 14, e molti componenti altamente conservati dell'UPS stati identificate o caratterizzate dal lievito (es 15-26). Scoperte fatte in questo versatile e geneticamente trattabili organismo modello è probabile che continueranno a fornire importanti informazioni sui meccanismi conservati di degradazione ubiquitina-mediata.

Il riconoscimento e la degradazione della maggior parte dei substrati UPS richiedono l'azione concertata di diverse proteine. Pertanto, un obiettivo importante nel caratterizzare il degrado regolamentato di una data proteina instabile è quello di determinare i requisiti genetici per proteolisi. Approcci classici (ad esempio impulso-chase e esperimenti cicloeximide-chase 27) per il monitoraggio degradazione delle proteine ​​in cellule di mammifero o di lievito sono laborioso e richiede molto tempo. Mentre questi tipi di metodi forniscono mezzi altamente sensibili per la rilevazione degradazione delle proteine, non sono adatti per l'analisi rapida di degradazione delle proteine ​​o screeni larga scalang per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​instabili è presentato.

Nel metodo basato su crescita del lievito per analizzare degradazione delle proteine, una proteina instabile di interesse (o segnale di degradazione) è fusa, in cornice, per una proteina che è necessario per la crescita del lievito in circostanze specifiche. Il risultato è un substrato artificiale che può servire come un potente strumento per determinare i requisiti genetici di proteine ​​degradazione della proteina instabile di interesse. Convenientemente, ceppi di lievito laboratorio più comunemente utilizzati ospitano un pannello di mutazioni nei geni che codificano enzimi metabolici coinvolti nella biosintesi di particolari amminoacidi o basi azotate (ad es 20,28-30). Questi enzimi sono essenziali per la proliferazione cellulare in assenza di metaboliti esogenamente fornite in cui sintesi enzimi partecipano. Taleenzimi metabolici possono quindi funzionare come reporter di crescita a base per la degradazione delle proteine ​​instabili a cui sono fusi. I requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​possono essere facilmente chiarita, in quanto le mutazioni che impediscono proteolisi permetteranno cellule che ospitano il giornalista degrado di crescere in condizioni selettive.

Un vantaggio di crescita è un'indicazione indiretta che una particolare mutazione aumenta l'abbondanza della proteina di interesse. Tuttavia, l'analisi biochimica diretta è necessario per confermare che una mutazione permette di crescita attraverso l'aumento dei livelli di proteine, piuttosto che tramite cause indirette o artefatti. L'effetto di una mutazione della proteina abbondanza può essere confermata da analisi Western Blot dei livelli di proteine ​​steady-state in cellule che fanno e non ospitano la particolare mutazione. Un metodo per l'estrazione rapida ed efficace delle proteine ​​di lievito (incubazione sequenziale di cellule di lievito con idrossido di sodio e tampone) in una forma adattaper l'analisi mediante western blotting è presentato anche il 31. Insieme, questi esperimenti facilitare la rapida identificazione dei regolatori candidati di degradazione delle proteine.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lievito crescita Assay identificare Mutanti candidati difettosi in Protein Degradation

  1. Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante una proteina fusa instabili, in cornice, per un enzima giornalista metabolica.
  2. Seminare trasformanti in 5 ml di sintetico definito (SD) terreno minimo che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante.
  3. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 600) di ciascuna coltura durante la notte.
    NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule in coltura può essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un diametro minimo di 600 di 0,2. Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente.
  4. Preparare sei diluizioni seriali di cellule di lievito trasformate in una piastra a 96 pozzetti sterili, a cominciare con le cellule diluite in unn OD 600 di 0,2. Posizionare ogni trasformante lievito per essere analizzati in una riga differente nella piastra a 96 pozzetti.
    1. Per ciascun trasformante, calcolare il volume di coltura overnight necessaria per diluire le cellule ad una OD 600 di 0,2 in un volume finale di 200 microlitri. Aggiungere questo volume di coltura durante la notte per pozzetto corrispondente nella colonna 1. Aggiungere la quantità appropriata di acqua sterile per portare il volume a 200 ml.
    2. Per ciascuna fila di lievito, aggiungere 125 ml di acqua sterile ai pozzetti nelle colonne 2, 3, e 4.
      NOTA: piastre a 96 pozzetti sterili confezionati singolarmente possono essere forniti con coperchi sterili. I coperchi possono essere utilizzati come serbatoi per l'acqua sterile che viene distribuito in questa fase. Questo consente il trasferimento simultaneo di acqua sterile a tutti i pozzetti in una data colonna con una pipetta multicanale.
    3. Mescolare il contenuto della prima colonna (lievito diluito ad una OD 600 di 0,2) pipettando su e giù con una pipetta multicanale.
    4. Trasfer 25 ml di lievito dalla colonna 1 alla colonna 2, utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù. Trasferire 25 ml da Colonna 2 a colonna 3, e 25 ml di Colonna 3 Colonna 4 (mescolando bene ad ogni passo).
  5. Mescolare ogni campione con una pipetta multicanale. Procedendo da più diluito per almeno diluire colonne di lievito, pipetta 4 microlitri di ciascun campione su due piastre contenenti il ​​terreno selettivo appropriato. Utilizzare una piastra con mezzo che mantiene selezione plasmide (questo piatto serve come un avvistamento lievito e controllo della crescita). Utilizzare una seconda piastra con mezzo che seleziona per plasmide manutenzione e l'espressione della proteina fusa instabile all'enzima giornalista. Perché lievito risolvere rapidamente, mescolare le cellule pipettando su e giù a intervalli regolari.
    NOTA: Drier piatti saranno più facilmente assorbire il liquido di piatti preparati al momento e quindi sono consigliati per questi esperimenti. Piatti umidi possono essere essiccati per incubazione a temperatura ambiente in loumidità w per 1 - 2 giorni o incubazione più brevi in ​​una cappa a flusso laminare. Le piastre possono asciugare in modo non uniforme se il flusso d'aria laminare è parallelo al banco. L'uso di un modello rende più facile individuare cellule di lievito a distanze regolari. Due modelli di esempio sono forniti in Figura 1. Questi possono essere stampati, tagliati, e incollate all'interno di un coperchio piatto Petri.
  6. Lasciare le piastre ad asciugare sul banco.
  7. Incubare le piastre a 30 ° C per 2 - 6 giorni.
  8. Fotografa ogni piatto dopo l'incubazione.

figure-protocol-1
Figura 1. Modelli per individuare le cellule di lievito su 100 mm piastre di agar. Questi modelli possono essere utilizzati per facilitare individuare lievito a distanze regolari con una pipetta multicanale. I modelli possono essere stampati, tagliati, e incollate all'interno di un coperchio piatto Petri. Posizionare piastra Petri con la crescitaCoperchio all'interno media con template apposto. I modelli sono contrassegnati da una tacca per monitorare l'orientamento. Si raccomanda che le piastre utilizzate in saggi di crescita sono parimenti segnalate con una tacca per monitorare l'orientamento. Modelli per individuare quattro (A) o cinque (B) sono previsti diluizioni seriali di cellule di lievito. Cliccate qui per vedere una versione stampabile di questa figura con i modelli da 100 mm.

2. Conferma biochimica di Assay Crescita Lievito

  1. La crescita di cellule di lievito e di post-alcalino di estrazione di proteine ​​(modificato da 31)
    1. Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante la proteina instabile.
    2. Seminare trasformanti in 5 ml di terreno SD che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante.
    3. Misurare la OD 600 di ogni cu nottelture.
      NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule possono essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un OD 600 che permetterà di diluizione per una OD 600 di 0,2 in 10 ml di terreno selettivo fresco (punto 2.1.4). Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente.
    4. Diluire le cellule di lievito ad una OD 600 di 0,2 in 10 ml di mezzo fresco selettiva.
    5. Continuare a incubare cellule a 30 ° C, la rotazione o agitazione, fino a quando le culture raggiungere un diametro esterno di 600 tra 0,8 e 1,2 (cioè sono in crescita mid-logaritmica).
      NOTA: Se la proteina instabile di interesse sotto il controllo di un promotore regulatable, tempi ottimali per l'induzione dell'espressione della proteina e la raccolta delle cellule può variare secondo studi precedenti o osservazioni empiriche.
    6. Raccogliere 2,5 OD 600 unità di cultura in 15 ml conicaal tubo mediante centrifugazione a 5000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
      NOTA: Un OD 600 unità è definita come la quantità di lievito presente in 1 ml di coltura a OD 600 di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere 2,5 OD 600 unità (V) può essere calcolata utilizzando la seguente equazione: V = 2,5 OD 600 unità / OD 600 misurato
    7. Risospendere le cellule in 1 ml di acqua distillata. Trasferire le cellule in sospensione in una provetta.
    8. Agglomerare cellule per centrifugazione a 6.500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
    9. Risospendere le cellule in 100 ml di acqua distillata pipettando su e giù o vortex, e aggiungere 100 ml 0.2 M NaOH. Mescolare pipettando su e giù. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente.
    10. Cellule pellet (la maggior parte dei quali non hanno ancora rilasciato proteine ​​e sono ancora vitali) per centrifugazione a 18.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
    11. Risospendere pellet in 50 - 100 microlitri tampone 1x Laemmli, che la lisi delle cellule, pipettando su e giù o vortex.
      NOTA: La rimozione del surnatante dopo la centrifugazione alcalina e successiva risospensione delle cellule in tampone campione Laemmli estrae proteine ​​a pH compatibile con sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone Tris-glicina esecuzione e western blotting.
    12. Per denaturare completamente proteine, lisati incubare a 95 ° C per 5 min.
      NOTA: proteine ​​di aggregazione-inclini (ad esempio proteine ​​con diversi segmenti transmembrana) possono diventare insolubili quando incubato a 95 ° C. Pertanto, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 min, come determinato empiricamente, per l'analisi di tali proteine.
    13. Lisati fresco mettendo in ghiaccio per 5 min.
    14. Lisati centrifugare a 18.000 g per 1 minuto a temperatura ambiente a pellet materiale insolubile. Separare il surnatante (proteina estratta solubilizzato) per SDS-PAGE prima successiva analisi Western Blot (punto 2.2). In alternativa, negozio lisati a -20 ° C.
  2. Rappresentante Protocollo Blotting occidentale
    1. Caricare empiricamente determinato volume di lisati in un gel SDS-PAGE.
    2. Eseguire gel a 200 V fino colorante anteriore ha raggiunto il fondo del gel.
    3. Trasferire proteine ​​dai gel di fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C.
    4. Block membrana incubando nel latte scremato 5% in Tris-Buffered Saline (TBS), dondolo, per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
    5. Decantare soluzione bloccante.
    6. Incubare membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse (o epitopo della stessa) in 1% di latte scremato in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) per 1 ora a camera temperature, dondolo.
    7. Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
    8. Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
      NOTA: Perché fluorofori sono sensibili alla luce, diluizioni di anticorpi fluoroforo coniugati devono essere preparati al buio. Inoltre, l'incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati fluoroforo deve avvenire in contenitori lightproof. Questo può essere realizzato avvolgendo vassoi di incubazione in un foglio di alluminio.
    9. Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
    10. Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore.
    11. Dopo l'imaging membrana, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per un caricoing proteina di controllo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
    12. Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
    13. Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
    14. Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
    15. Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per illustrare questa metodologia, l'enzima HIS3 è stato fuso al carbossi-terminale del modello reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD) substrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) per creare Deg1 -Sec62-HIS3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 rappresenta uno dei membri fondatori di una nuova classe di substrati ERAD che sono indirizzate a seguito persistente, associazione aberranti con il translocon, il canale principale responsabile per lo spostamento di p...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metodologia qui presentata consente la rapida determinazione e la conferma biochimica dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule di lievito. Questi esperimenti sottolineano l'utilità e la potenza di lievito come organismo modello eucariote (diverse ottime recensioni di lievito biologia e compilazioni di protocolli per la gestione, la conservazione e la manipolazione cellule di lievito (ad esempio 41-44) sono disponibili per gli investigatori nuovi per l'organ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i membri attuali e precedenti del laboratorio Rubenstein per fornire un ambiente di ricerca e entusiasta. Ringraziamo Ryan T. Gibson per l'assistenza nella ottimizzazione dei protocolli. Ringraziamo Mark Hochstrasser (Yale University) e Dieter Wolf (Universität Stuttgart) per i ceppi di lievito e plasmidi. Ringraziamo i nostri revisori anonimi per il loro aiuto nel migliorare la chiarezza e l'utilità di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di ricerca del capitolo Ball State University di Sigma Xi a SGW, un National Institutes of Health sovvenzione (R15 GM111713) per EMR, un premio di ricerca Ball State University aspirano ad EMR, e fondi dalla Ball State University Ufficio di Provost e Dipartimento di Biologia.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ceppi di lievito desiderati, plasmidi, terreno standard e componentiI ceppi di lievito con mutazioni desiderate possono essere generati nel laboratorio dello sperimentatore. Sono disponibili in commercio anche lieviti wild-type e una varietà di mutanti (ad es da GE Healthcare). I plasmidi che codificano per le proteine di fusione possono essere generati nel laboratorio dello sperimentatore.
3-ammino-1H-1,2,4-triazoloFisher ScientificAC264571000Inibitore competitivo dell'enzima His3. Può essere incluso nel terreno per aumentare il rigore del saggio di crescita utilizzando i costrutti reporter His3.
Endoglicosidasi H (forma ricombinante da Streptomyces plicatus)Roche11088726001Può essere utilizzato per valutare la N-glicosilazione delle proteine; compatibile con le concentrazioni di SDS e beta-mercaptoetanolo trovate in 1x tampone campione Laemmli.
Provette monouso in vetro borosilicatoFisher Scientific14-961-32Disponibile da una varietà di produttori
Incubatore a temperatura regolata (ad es. Incubatore Heratherm Modello IMH180)Dot Scientific51028068Disponibile da una varietà di produttori
Tamburo intercambiabile New Brunswick per tubi da 18 mm (rullo per tubi)New BrunswickM1053-0450Il rullo tubolare è consigliato per mantenere in sospensione le colture starter di lievito durante la notte. Un agitatore a piattaforma o un rullo tubolare possono essere utilizzati per mantenere colture più grandi in sospensione.
New Brunswick TC-7 Tamburo a rulli 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Per l'uso con il rullo tubolare
Spettrofotometro SmartSpec PlusBio-Rad170-2525Disponibile da una varietà di produttori
Piastre sterili per microtest a fondo piatto a 96 pozzetti con coperchio confezionate singolarmenteSarstedt82.1581.001Disponibile da una varietà di produttori
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 e Mu; lGilsonF14401Disponibile da una varietà di produttori
 
 
 

 
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μ lGilsonF14403I pipettatori monocanale e multicanale vengono utilizzati in varie fasi del protocollo. Mentre i pipettatori multicanale riducono il carico di pipettaggio in diverse fasi, i pipettatori a canale singolo possono essere utilizzati in tutto il protocollo. Disponibile da una varietà di produttori.
Centrifuga 5430Eppendorf5427 000.216Rotore venduto con l'unità contiene provette per microcentrifuga da 1,5 e 2,0 ml. Il rotore può essere sostituito con uno che contiene provette coniche da 15 ml e 50 ml.
Sistema di imaging per lastre (ad es. Sistema Gel Doc XR+)Bio-Rad170-8195È possibile utilizzare una varietà di sistemi per l'imaging delle lastre, tra cui sofisticati sistemi di imaging, scanner per computer e telefoni con fotocamera.
Rotore ad angolo fisso F-35-6-30 con coperchio e adattatori per centrifuga modello 5430/R, provette coniche da 15/50 ml, 6 postiEppendorfF-35-6-30
15 ml serigrafato tubo con tappo a vite 17 x 20 mm conico, polipropileneSarstedt62.554.205Disponibile da una varietà di produttori
provetta flessibile da 1,5 ml, PCR clean, provette per microcentrifuga naturaleEppendorf22364120Disponibile da una varietà di produttori
Riscaldatore analogico per Dri-Bath FisherScientific1172011AQIl bagno d'acqua bollente con piastra riscaldante può essere utilizzato anche per denaturare le proteine
SDS-PAGE in esecuzione e trasferire apparati, alimentatori e apparecchiature di imaging o camere oscure per SDS-PAGE e trasferimento a membranaVaria in base al laboratorio e all'applicazione
Sistema di imaging Western blot (ad es. scanner Li-Cor Odyssey CLx e software Image Studio)Li-Cor9140-01Varia in base al laboratorio e all'applicazione
EMD Membrane di trasferimento in PVDF Millipore ImmobilonScientificIPFL00010Varia in base al laboratorio e all'applicazione
Anticorpi primari (ad es Anticorpo monoclonale fosfoglicerato chinasi (Pgk1), (clone 22C5D8))Life Technologies459250Varia in base al laboratorio e all'applicazione
Anticorpi secondari (ad es Alexa-Fluor 680 Coniglio Anti-Topo IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Varia in base al laboratorio e all'applicazione
tampone Fisher

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11(2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093(2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791(2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Saggio di crescita del lievitoProteina di fusioneTerreno selettivoEstrazione proteicaAnalisi Western BlotDiluizione serialeUbiquitina ligasiProteina instabile

Articoli correlati