È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

I benefici multiforme Protein Co-espressione in

11K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/52431

⸱

5 febbraio 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

In questo articolo

Sommario

La co-espressione proteica è una potente alternativa alla ricostituzione in vitro di complessi proteici ed è di aiuto nell'esecuzione di test biochimici e genetici in vivo. Qui riportiamo l'uso della co-espressione proteica in Escherichia coli per ottenere complessi proteici e per regolare la frequenza di mutazione delle cellule.

Abstract

Riportiamo qui che l'espressione di complessi proteici in vivo in Escherichia coli può essere più conveniente rispetto ai tradizionali esperimenti di ricostituzione in vitro. In particolare, mostriamo che la scarsa solubilità della subunità ε della DNA polimerasi III di Escherichia coli (con attività esonucleasica 3'-5') è altamente migliorata quando la stessa proteina è co-espressa con le subunità α e θ (con attività della DNA polimerasi e stabilizzazione ε, rispettivamente). Dimostriamo anche che la co-espressione proteica in E. coli può essere utilizzata per testare in modo efficiente la competenza di subunità di diverse specie batteriche ad associarsi in un complesso proteico funzionale. Mostriamo infatti che la subunità α della DNA polimerasi III di Deinococcus radiodurans può essere co-espressa in vivo con la subunità ε di E. coli. Inoltre, riportiamo l'uso della co-espressione proteica per modulare la frequenza delle mutazioni in E. coli. Esprimendo la subunità ε wild-type sotto il controllo del promotore araBAD (arabinosio-inducibile), e co-esprimendo la variante mutagena D12A della stessa proteina, sotto il controllo del promotore lac (inducibile da isopropil-tio-β-D-galattopiranoside, IPTG), siamo stati in grado di alterare la frequenza di mutazione di E. coli utilizzando concentrazioni appropriate degli induttori arabinosio e IPTG. Infine, discutiamo i recenti progressi e le sfide future della co-espressione proteica in E. coli.

Introduzione

L'introduzione di tecnologie iperespressione impulso sia gli studi biochimici di basso numero di copie enzimi e la produzione industriale di proteine ​​farmacologicamente attive (ad esempio, insulina). Con l'avvento di queste tecnologie, progressi significativi sono stati raggiunti per aumentare la resa e la qualità delle proteine ​​ricombinanti. Inoltre, procariote ed eucariote 1,2 3 sistemi iperespressione sono stati sviluppati nel corso degli anni, offrendo alternative utili al "cavallo di lavoro" di proteine ​​biotecnologie, cioè, Escherichia coli. In particolare, la disponibilità di piattaforme alternative a E. coli ha portato alla produzione di peptidi o proteine ​​ricombinanti recanti modificazioni post-traduzionali. Tuttavia, va detto che E. coli rappresenta ancora l'organismo di riferimento per la produzione di proteine ​​ricombinanti. Ciò è dovuto a diversi fattori, tra cui la più rilevante può essereconsiderato: i) la disponibilità di un certo numero di sistemi iperespressione (vettori di espressione e ceppi) per E. coli 1,2; ii) i tempi breve generazione, e alti rendimenti biomassa, di E. coli in una varietà di media ricchi e sintetici; iii) la manipolazione facile né al biochimico e a livello genetico di questo microrganismo; iv) l'isolamento di ceppi capaci di produzione di proteine ​​tossiche 4; v) la costruzione di ceppi caratterizzati induzione omogenea a livello di popolazione 5,6. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che i sistemi di espressione adatti per la produzione in E. coli di proteine ​​post- traslazione modificati può essere concepita e costruita 2.

Allo stato attuale, la proteina sovraespressione è principalmente utilizzato per ottenere proteine ​​monomeriche o omo-oligomeri, le cui hypersynthesis può essere eseguita con un singolo gene clonato in un plasmide appropriata. Tuttavia, l'attenzione è stata recentementeversato alla costruzione di E. sistemi di proteine ​​co-espressione coli, sfidando la produzione, in vivo, di complessi etero-oligomerica 2. È interessante notare che i primi esperimenti di proteine ​​co-espressione di fronte all'Assemblea inter-specie di grandi e piccole subunità di carbossilasi cianobatteri ribulosio-1,5-bisfosfato / ossigenasi 7,8, e l'associazione di forme troncate e lungometraggi di HIV-1 trascrittasi inversa 9. Questi studi pionieristici hanno dimostrato che la proteina co-espressione rappresenta una potente alternativa al tradizionale ricostituzione vitro. Inoltre, la proteina co-espressione in E. coli è stato usato per produrre diverse proteine ​​recanti modificazioni post-traduzionali 2, per ottenere proteine ​​contenenti amminoacidi innaturali 2, e per aumentare la resa di proteine ​​di membrana sovraespresso 2. Inoltre, il potenziale della proteina co-espressione come uno strumento per conferire a E. coli competerence della secrezione di proteine ​​è sotto inchiesta attiva 2.

Due strategie principali di proteine ​​co-espressione in E. coli può essere perseguito: i) l'uso di un singolo plasmide per ospitare diversi geni da sovraespresso; ii) l'uso di più plasmidi in singole cellule co-esprimono proteine ​​bersaglio. Nel primo caso, i criteri per la scelta del plasmide non differiscono da quelle dei tradizionali esperimenti singole proteine ​​iperespressione, anche se particolari plasmidi contenenti tandem elementi promotore / operatore stati costruiti per co-espressione 10. Questo primo approccio è quindi molto semplice. Tuttavia, va detto che l'uso di un singolo plasmide co-esprimere proteine ​​diverse facce due grandi difficoltà: i) la massa molecolare del vettore aumenta con il numero di geni ospitati, limitando il numero di proteine ​​co-espresse; ii) quando più geni clonati sono sotto il controllo di un unico promotore, polarità può decreasall'e l'espressione dei geni distali dal promotore. L'uso di plasmidi doppi o multipli in un'unica E. coli deve compiere la compatibilità dei vettori di scelta, quindi imporre vincoli alle combinazioni ammissibili di plasmidi. Tuttavia, questa seconda strategia co-espressione presenta il vantaggio di contenere la massa molecolare di vettori, e limita la polarità. Recentemente abbiamo costruito un sistema di co-espressione della proteina progettato per facilitare la spola di geni tra plasmidi co-espressione 11. In particolare, abbiamo costruito la serie vettori PGOOD, le caratteristiche rilevanti dei quali sono: i) origine p15A di replica, per garantire la compatibilità dei plasmidi PGOOD con i vettori commerciali che contiene l'origine ColE1 (ad esempio, la serie pBAD 12); ii) una cassetta tetraciclina resistenza; iii) la presenza di lac -derived elementi regolatori, cioè, il promotore-operatore (O 1) Coppia e Laci gene q. Utilizzando un adeguato paio pBAD-PGOOD, siamo stati in grado di iperespressione nucleo catalitico di E. DNA polimerasi coli III, composto da tre differenti subunità, cioè, α (il 'polimerasi, ε (3'-5 5'-3)' exonuclease) e θ (stabilizzazione ε) 13. In particolare, abbiamo dimostrato che la co-espressione del complesso αεθ era strettamente dipendente dalla aggiunta alla E. coli terreno di coltura sia di IPTG e arabinosio, innescando sovraespressione da PGOOD e pBAD rispettivamente (Figura 1A).

Nella presente relazione, illustriamo come proteine ​​co-espressione può efficacemente risolvere le difficoltà legate alla scarsa solubilità di un complesso proteico subunità. Inoltre, si mostra come nei test di complementazione proteica vivo possono essere eseguiti, e abbiamo finalmente riportiamo l'uso di proteine ​​co-espressione di frequenza sintonizzare mutazione in E. coli. A questo scopo, abbiamo utilizzato le coppie PGOOD-PBAD idonei per illustrare esempi rilevanti di ciascun caso di studio.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Isolamento di E. coli Co-trasformanti

  1. Preparare le cellule elettro-competente della appropriata E. coli da trasformare. Trasferimento a 1 ml di terreno LB (Triptone, estratto di lievito, NaCl a 10, 5, e 10 g / L, rispettivamente) una singola colonia del ceppo di scelta, e incubare a 37 ° C in stringono condizioni di 180 giri al minuto. Diluire la precoltura 1: 500 in 25 ml di mezzo fresco LB ed incubare la coltura a 37 ° C.
  2. A log-fase (0,6 OD) centrifugare la sospensione cellule a 5.000 xg per 20 minuti), e risospendere il pellet in 10%, v / v sterile glicerolo-acqua ghiacciata nella metà del volume cultura originaria. Ripetere questa operazione 4 volte, dimezzando ogni volta il volume risospensione. Infine, risospendere il pellet in glicerolo / acqua e dividere la sospensione cellule in 50 microlitri aliquote. Conservare le aliquote a -80 ° C fino a 6 mesi.
  3. Sciogliere il plasmide desiderato in acqua sterile integrato con EDTA 0,5 mm. Thaw su ice un'aliquota di cellule elettro-competente e mescolare con una quantità appropriata (2,5-5 ng) di vettore. Versare il composto in una vaschetta 0,1 centimetri adatto per elettroporazione, e applicare 1,8 kV.
  4. Immediatamente trasferire le cellule elettroporate in 1 ml di terreno SOC (terreno LB integrato con 0,2% w / v di glucosio, 10 mM MgCl 2, 2.5 mM KCl), incubare per 1 ora sotto agitazione, e infine trasferire aliquote di 100 microlitri di piastre di Petri contenenti LB agar con l'antibiotico appropriato. Incubare O / N a 37 ° C.
  5. Purificare trasformanti strisciando singole colonie su piastre di Petri.
  6. Preparare le cellule elettro-competente dei trasformanti primari e ripetere i passaggi da 1.1 a 1.5 per trasformare con ulteriori plasmidi.
  7. Preparare glicerolo scorte di co-trasformanti. Trasferimento di una singola colonia in LB addizionato con antibiotici appropriati, incubare a 37 ° C sotto agitazione, e al log-fase (0,6 OD) centrifugare la sospensione cellule a 5.000 xg per 20 min. Resuspend il pellet in LB-antibiotici mezzo contenente 15% v / v glicerolo. Distribuire in aliquote e conservare a - 80 ° C.

2. Co-espressione di α e ε subunità E. coli DNA polimerasi III

  1. Trasferire con un'ansa sterile una piccola quantità di glicerolo magazzino ceppo appropriata (ad esempio, TOP10 / PGOOD-ε243 e TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, vedi Figura 1) in una capsula di Petri contenente terreno LB e antibiotici. Lasciate che le cellule di sospensione secca sulla piastra di Petri, e strisciare le cellule gocciolina. Incubare a 37 ° CO / N.
  2. Trasferimento, utilizzando uno stuzzicadenti sterili, una singola colonia di 1 ml di LB-antibiotici medie. Incubare 8 ore a 37 ° C. Diluire la precoltura 1: 500 in mezzo fresco e incubare a 30 ° C per 15 h.
  3. Aggiungi IPTG, arabinosio, o arabinosio e IPTG, 1 mm ciascuna. Incubare a 30 ° C per 2,5 ore. Raccogliere le cellule, e memorizzare i pellet a -20 ° C.
  4. Pellets Scongelare su ghiaccio e risospendere in tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, ditiotreitolo 2,5 mm, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), pH 8). Omogeneizzare delicatamente la sospensione cellule con un vasaio vetro freddo.
  5. Sonicare a 15 W per 15 secondi, seguito da 15 intervallo di raffreddamento sec (4 cicli).
  6. Centrifugare gli estratti proteici totali a 10.000 xg per 20 minuti, a 4 ° C per recuperare la frazione solubile.
  7. Analizzare mediante SDS-PAGE (12,5% acrilammide) aliquote di ogni estratto proteina solubile. A tale scopo, trasferire 20 microlitri di ogni estratto proteina solubile in provette Eppendorf contenenti 60 ml di H 2 O e 20 microlitri di tampone di caricamento (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) di glicerolo, 0,25% (w / v) di blu di bromofenolo) e bollire per 5 min. Carico 18 microlitri di ciascun campione ed eseguire l'elettroforesi a 140 V per circa 1,5 ore.

3. Co-espressione di α subunità di Deinococradiodurans CUS DNA polimerasi III e ε subunità di E. coli DNA polimerasi III

  1. Preparare una precoltura della E. coli ceppo TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 in 1 ml di terreno LB-ampicillina-tetraciclina e incubare 8 ore a 37 ° C. Diluire 1: 1.000 in terreno fresco e incubare O / N a 37 ° C.
  2. Diluire 1: 100 in 200 ml di mezzo fresco, incubare a 37 ° C per 3 ore, poi indurre per 3 ore con arabinosio e IPTG, 1 mM ciascuno. Raccogliere le cellule, e conservare il pellet a -20 ° C.
  3. Risospendere il pellet in 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Mescolare e distruggere le cellule, come descritto in 2.4 e 2.5.
  4. Centrifugare immediatamente le cellule lisato a 10.000 xg per 20 min. Eliminare il pellet. Filtrare il surnatante con un imbuto Buchner dotato di 3 strati di carta da filtro. Applicare dolce di vuoto. Per evitare eccessiva formazione di schiuma, mantenere la beuta vuoto su ghiaccio durante la filtrazione.
  5. Determinare la concentrazione di proteine ​​secondo Bradford 14.

4. Gel Filtration Chromatography

  1. Equilibrare un 16X70-rivestito di acqua (200) colonna di gel filtrazione con 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. carico sulla colonna dell'estratto proteina solubile. Per una risoluzione ottimale, utilizzare un ciclo campione di 1 ml. Eseguire la cromatografia a 0.6 ml / min. Mantenere la temperatura della colonna a 4 ° C in tutto.
  2. Raccogliere 0,9 ml frazioni e analizzare con SDS-PAGE. Trasferire 20 ml di ogni frazione rilevante per provette Eppendorf contenenti 60 ml di H 2 O e 20 microlitri di tampone di caricamento (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% (w / v) di SDS, 50% ( v / v) di glicerolo, 0,25% (w / v) di blu di bromofenolo) e far bollire per 5 min. Carico 18 microlitri di ciascun campione ed eseguire l'elettroforesi a 140 V per circa 1,5 ore.
  3. Determinare il 3'-5 'esonucleasi e l'attività della DNA polimerasi di ciascuna frazione in 96-cill micropiastre. Analizzare l'attività di esonucleasi 5'-utilizzando timidina monofosfato estere p-nitrofenil (p NP-TMP) come substrato 15. Stima polimerasi DNA usando l'PPX (pirofosfatasi, Purine nucleoside fosforilasi, xantina ossidasi) enzima accoppiato dosaggio 16 e 2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrofenil) -5-cloro fenil-2H-tetrazolio (INT) come accettore di elettroni 16.

5. Mutazione Analisi delle popolazioni Co-esprimono la wild-type ε subunità di E. coli DNA polimerasi III e mutageni εD12A Variant

  1. Trasferire una singola colonia di E. coli TOP10 contenente il pBAD-ε e le pGOOD1-εD12A 11 vettori a 1 ml di LB-antibiotici media. Incubare O / N a 37 ° C.
  2. Diluire la precoltura 1: 250 in 3 fiasche contenenti mezzo fresco (10 ml), aggiungere le appropriate induttori (arabinosio, IPTG o arabinosio e IPTG, 1 mM ciascuno) e incubare a 37 ° Cper 8 ore. Preparare in culture non-indotta paralleli.
  3. Raccogliere aliquote di 1 ml, poi diluito 1: 500 in nuove fiasche contenenti mezzo fresco (10 ml) integrato o meno con gli induttori appropriati. Incubare O / N a 37 ° C.
  4. Ripetere i punti 5.2 e 5.3 e raccogliere aliquote di 1 ml.
  5. Determinare il numero di generazioni è verificato in ciascuna cultura. Trasferimento su piastre LB, 100 ml di appropriate diluizioni seriali di inoculo e cultura. Incubare O / N a 37 ° C. Contare le colonie su piastre LB, e calcolare il logaritmo del numero di cellule presenti nel inoculo (log I) e nella coltura alla fine della crescita (log C). Per determinare il numero di generazioni, utilizzare la formula: (log C - log I) /0.301.
  6. Centrifugare a 5.000 xg per 20 min e risospendere le cellule in 1 ml di 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Per permeabilize le celle, aggiungere 2-3 gocce di cloroformio e vortex per 20 sec.
  7. Determinare il β-Attività glucosidasi di ciascuna aliquota in una micropiastra a 96 pozzetti, utilizzando p -nitrophenyl-β-D-glucopiranoside (PNPGluc) come substrato. Aggiungere a ciascun pozzetto 100 l di cellule permeabilizzate e 100 ml di substrato (16 mg / ml soluzione madre in H 2 O). Fare attenzione ad evitare bolle d'aria nei pozzetti. Leggere l'assorbanza a 420 nm, utilizzando un lettore di micropiastre e il filtro appropriato.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La subunità ε di E. coli DNA polimerasi III è composto da 243 aminoacidi e dispone di scarsa solubilità 17,18, a meno che i residui 187-243 vengono cancellati 17. Tuttavia, abbiamo già dimostrato 11 che il co-espressione di α full-length, ε, e subunità θ produce solubile DNA polimerasi III nucleo catalitico (Figura 1). In particolare, utilizzando il sistema pBAD-PGOOD co-espressione, abbiamo dimostrato che: i) la sovraespressione di α e subunità ε può essere con...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Le proteine ​​possono essere intrinsecamente disordinato, con le regioni la cui struttura terziaria non è limitata a un numero limitato di conformazioni 25. Queste proteine ​​sono disordinati solito incline all'aggregazione 25, e l'isolamento e la caratterizzazione potrebbero rappresentare un compito difficile. La subunità ε di E. DNA polimerasi coli III dispone di due domini distinti 26,27, vale a dire: i) il dominio N-ter, recante la 'attività esonucleasic...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Il permesso di Springer e Elsevier ristampare dati è fortemente riconosciuta.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarSigma-AldrichA1296
AmpicillinaSigma-AldrichA9518
CloroformioSigma-Aldrich288306
EDTASigma-AldrichEDS
GliceroloSigma-AldrichG5516
INTSigma-AldrichI8377
IPTGSigma-AldrichI5502
KClSigma-AldrichP9541
L-ArabinosioSigma-AldrichA3256
MgCl2Sigma-AldrichM2670
NaClSigma-Aldrich31434
PMSFSigma-AldrichP7626
PNP-glucSigma-AldrichN7006
pNP-TMPSigma-AldrichT0251
TetraciclinaSigma-Aldrich87128
Trizma base Sigma-AldrichT1503
TriptoneSigma-Aldrich95039
Estratto di lievitoFluka70161
Soluzione di acrilammide 30%BioRad161-0158Per elettroforesi su gel
Persolfato di ammonioBioRad161-0700Per elettroforesi su gel
GlicinaBioRad161-0718Per gel per elettroforesi
SDSBioRad161-0302Per elettroforesi su gel
TEMEDBioRad161-0800Per elettroforesi su gel
TrisBioRad161-0719Per elettroforesi su gel
Cuvette 0,1 cmBioRad1652089Per elettroporazione
Centrifuga 5415REppendorf
Centrifuga Allegra 21RBeckman
Apparecchio cromatografico GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II elettroporazioneBioRad
Lettore di micropiastre 550Biorad
MiniProtean 3 celleBioRad
AlimentatoreBioRad
Sonicatore 3000Misonix

Riferimenti

  1. Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
  2. Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
  3. Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
  4. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  5. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
  6. Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
  7. Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
  8. Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
  9. Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
  10. Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43(2007).
  11. Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
  12. Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  13. McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
  16. Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
  17. DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
  18. Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
  19. Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
  20. Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
  21. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  22. Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
  23. Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
  24. Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
  25. Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
  26. Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
  27. Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
  28. Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
  29. Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
  30. Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
  31. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  32. Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Assemblaggio di complessi proteicifiltrazione su gelSDS-PAGEsaggi enzimaticitrasformazione plasmidicaconcentrazione dell'induttoreanalisi della frequenza di mutazionetest di compatibilità delle subunità
I benefici multiforme Protein Co-espressione in
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.