Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

Sommario

Abbiamo sviluppato un nuovo modello di ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Si basa su microstrutture tessuti isolati da campioni di tessuto del seno chirurgici che conservano l'architettura del tessuto, le interazioni intercellulari, e segnalazione paracrina.

Abstract

Lo studio di azione dell'ormone nel seno umano è stata ostacolata dalla mancanza di adeguati sistemi modello. Alla cultura in vitro, cellule epiteliali mammarie primarie tendono a perdere l'espressione del recettore dell'ormone. Ampiamente recettore ormone linee di cellule di cancro al seno positivo utilizzati sono di scarsa rilevanza per la situazione in vivo. Qui, descriviamo un modello ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Campioni di tessuto mammario umano fresco da materiale di scarto chirurgico quali mammoplastiche riduzione o mammectomies sono meccanicamente ed enzimaticamente digerite per ottenere frammenti di tessuto contenenti dotti e lobuli e molteplici tipi di cellule stromali. Queste microstrutture tessuti conservati in terreno di base senza fattori di crescita mantenere i contatti intercellulari, l'architettura dei tessuti, e rimangono ormone reattivo per diversi giorni. Essi sono facilmente elaborati per l'RNA e l'estrazione di proteine, l'analisi istologica o memorizzati in congelamento medio. Fluorescenzaattivato ordinamento delle cellule (FACS) può essere utilizzato per arricchire per specifiche popolazioni cellulari. Questo protocollo offre un approccio standard semplice per gli studi traslazionali con altamente complessi, variegati campioni umani.

Introduzione

Informazioni sul paesaggio mutazionale di cancro al seno sta aumentando a ritmi sostenuti. Meno attenzione è stata rivolta a fattori sistemici che influenzano lo sviluppo del cancro al seno. L'esposizione agli ormoni riproduttivi ha un impatto importante sulla progressione della malattia ^1-3. Tuttavia, i meccanismi con cui gli ormoni riproduttivi incidono sul seno umano sono poco conosciuti. Lavora con modelli di topo geneticamente ha rivelato che coinvolgono cellule segnalazione intrinseca e paracrine attraverso diversi effettori a valle ^4.

La conoscenza limitata su azione ormonale nel seno umano è in gran parte attribuibile alla mancanza di modelli adeguati. Maggior parte dei lavori sui meccanismi di recettore per gli estrogeni (ER) e del recettore del progesterone (PR) segnalazione è stata eseguita con linee di cellule del recettore dell'ormone positivi cancro al seno, come MCF-7 e T47D. Questi sono stati ottenuti da versamento pleurico di pazienti con carcinoma mammario avanzato che aveva already ricevuto trattamenti multipli ^5. La rilevanza biologica dei risultati di tali modelli semplici in vitro del seno umano è geni discutibili e bersaglio identificati in questi modelli in vitro sono differiscono da geni bersaglio che sono identificati in modelli animali ^6. Quando le cellule epiteliali mammarie umane primaria sono coltivati ​​in vitro tendono a perdere l'espressione del recettore ormonale e, quindi, la risposta ormonale ^7,8. Questo problema può essere circumventd da approcci 3D sofisticati con matrigel. In questo modo, C. Clarke e colleghi sono riusciti a stabilire cellule epiteliali mammarie che hanno mantenuto l'espressione del recettore ormonale e hanno mostrato una risposta proliferativa di progesterone stimolazione ^9. Tuttavia, due importanti in vivo dei recettori del progesterone geni bersaglio, Wnt-4 e RANKL, non sono state indotte dopo stimolazione progesterone in questo sistema ^9. Questo approccio è stato recentemente approvato ulteriormente con in vitro ormone pretrattamento e induzione RANKL è stato raggiunto ^10. Un avvertimento resta che matrigel ha attività che dipendono in batch, è costoso, e richiede un disegno sperimentale che è adatto solo per il numero di cellule piccole.

Sulla base della constatazione che in ER vivo e segnalazione PR sono in gran parte mediata da interazioni paracrine ^11, abbiamo sostenuto che le interazioni intercellulari devono essere mantenuti. Un altro fattore importante che si perde come tessuti sono correlate alle cellule singole per la cultura in vitro sono le interazioni delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare; ma questi sono cruciali per la differenziazione epiteliale e la loro distruzione è importante nella tumorigenesi ^12. Con questo in mente, abbiamo stabilito un metodo per isolare microstrutture del tessuto mammario da fresco materiale chirurgico scarto ^13. Il parenchima mammario, costituito da un epitelio doppio strato con luminale interna ed esterna myoepithelicellule al, viene sezionato dal tessuto adiposo e sottoposti alla dissociazione enzimatica e meccanica. Dopo il lavaggio e centrifugazione, frammenti di condotti del latte si ottengono che mantengono una stretta interazione con molte cellule stromali. Queste microstrutture del tessuto rimangono ormone reattivo. Il modello è stato validato in campioni clinici ^13. Come tale, il presente procedimento può aiutare a studiare l'azione ormonale nel seno in un contesto biologicamente e clinicamente rilevante.

Protocollo

Considerazioni generali: prima del tempo, istituire un protocollo etico, preparano questionari per i pazienti, e vedere per la formazione del personale clinico. Prima di usare il materiale dalla chirurgia mastoplastica riduttiva, procurarsi le autorizzazioni, e garantire il consenso del paziente. Tissue può essere contagioso e deve essere gestito di conseguenza. Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico di ISREC - Istituto svizzero di ricerca sperimentale sul cancro.

1. Tissue Recupero, lavorazione e Bio-banking

Per garantire la qualità del campione ottimale per la bio-banking, una serie di misure vengono effettuate in ospedale prima del trasporto al laboratorio.

All'ospedale:

1. Ottenere tessuti mammari umani in condizioni sterili da campioni di chirurgia mastoplastica riduttiva e sangue, se necessario. Tissue ha bisogno di essere esaminato da patologo che campione per escludere la presenza di lesioni maligne.
2. Posizionare la t senorilasciare sotto il cofano su una tavola sterili e preparare forbici, bisturi chirurgici e pinze che sono già sterilizzati con sterilizzatore a vapore. Fai taglio profondo in diversi siti del tessuto mammario con un bisturi per aprirlo. Nel tessuto mammario umano cercare filamenti bianchi, comprensivi di condotti e lobuli, che sono incorporati nel tessuto adiposo giallo.
   NOTA: Il rapporto tra il parenchimale bianco al tessuto adiposo giallo differisce tra le donne; in genere le donne più giovani hanno più tessuto epiteliale.
3. Scegli pezzi di materiale bianco e tenerli con una pinza, poi separarli delicatamente dal tessuto adiposo con le forbici. Evitare di prendere i vasi sanguigni.
4. Sciacquare pezzi di tessuto in PBS (PBS) pH 7,2 per rimuovere il sangue. Trasferire il tessuto di bottiglie di plastica da 250 ml contenenti mezzo F12 (Medium F12 Modified Eagle di Dulbecco) senza rosso con 2% di penicillina / streptomicina fenolo (comprese 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 g / ml di streptomicina) e l'1% di unantibiotica / amfotericina B (comprese le 10.000 unità / ml di penicillina, 10.000 mg / ml di streptomicina, e 25 mg / ml di amfotericina B). Negozio tessuti nel mezzo per il trasporto al laboratorio.
5. Preparare pezzi di 3 - 5 mm di diametro per l'estrazione di RNA e proteine ​​e flash congelarli in cryovials con il freddo (ghiaccio secco) isopentano. Trasferirli contenitore di ghiaccio secco per il trasporto al laboratorio.
6. Mettete i pezzi di 3-5 mm nel stampo e coprire con uno strato di Optimal taglio temperatura (OCT) e quindi inserire la muffa sul fondo piatto della scatola piena di isopentano freddo. Dopo aver completato il trasferimento di congelamento dello stampo alla casella ghiaccio secco.
7. Fissare 5 pezzi di 3 - 5 mm di diametro in paraformaldeide (PFA) 4% e altri 5 pezzi in formaldeide (FA) 4% in PBS a RT analisi istologica seguito. Due diversi fissativi sono raccomandati in alcuni anticorpi funzionano meglio con uno o l'altro dei due.

In laboratorio:

8. Farecumento tutte le informazioni sulla mastoplastica riduttiva, data di chirurgia e se i campioni sono derivati ​​da sinistra contro mammella destra.
9. Posizionare i campioni congelati a -80 ° C e trasferire i tessuti fissi in cassette istologici dopo 2 ore di fissazione. Poi metterli sia in PBS o etanolo al 70%, per O / storage N a 4 ° C. Il giorno successivo, il trasferimento le cassette istologici alle strutture istologici per paraffina.

2. Tissue Digestione e stimolazione ormonale

1. Trasferire le bottiglie contenenti i campioni di tessuto a un armadio flusso laminare in una camera di coltura cellulare P2. Mettere i pezzi di tessuto sul tagliere sterile (29 x 19 cm). Tenere il materiale con una pinza e raschiare il grasso e vasi rimanendo lontano dal parenchima mammario (parte bianca) con il bisturi. Posizionare il materiale bianco in PBS in un piatto di cultura 10 cm.
2. Dopo aver rimosso il materiale grasso da tutti i pezzi e disporli secondo la regola di sicurezzas del laboratorio, posizionare le parti bianche contenenti i tessuti epiteliali di nuovo sul tagliere. Utilizzando bisturi opposte tagliare il tessuto e tagliarla a pezzi di diametro fino a 2 mm.
3. Il materiale macinato in provette di dimensioni adeguate: fino a 1, 2,5 e 10 ml in un 5, 15 o 50 ml tubi, rispettivamente. Tipicamente a 5 ml rendimenti tubo di materiale sufficiente per paraffina embedment e ormonali stimoli, e 15 ml produce tubo di materiale sufficiente per fluorescenza cellulare Attivato (FACS). Tubi più grandi sono utilizzati per il congelamento aliquote.
4. Preparare master mix digestione composto di media (DMEM / F12 senza rosso fenolo) con 1% di penicillina / streptomicina / amfotericina B e collagenasi A (Clostridiopeptidase A da Clostridium histolyticum). Dose collagenasi secondo i tempi di digestione.
   1. Per 12, 24, e 36 h di incubazione, utilizzare concentrazione finale di collagenasi di 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml e 0,5 mg / ml. Aggiungere mix digestione padrone fino a 4 volte ilvolume del materiale digerito per garantire un'adeguata agitazione e aerazione.
      NOTA: A seconda del disegno sperimentale e la durata della stimolazione ormonale, aggiungere ormoni durante o dopo la digestione enzimatica fase e microstruttura recupero.
5. Aggiungere ormone (s) alla concentrazione desiderata per testare campioni ed il veicolo al controllo. Per la stimolazione con 17-β-estradiolo, e promegestone (R5020) utilizzare una concentrazione finale di 20 nM.
   NOTA: R5020 è un agonista del recettore del progesterone sintetica, che è più stabile del progesterone naturale in mezzo.
   1. Porre le provette del mixer rullo interno un incubatore a 37 ° C e 40 rpm O / N. Prima di mettere i campioni del mixer, li risospendere molto bene per garantire che tutto il materiale distribuisce lungo le provette.
6. Come digestione richiede almeno 12 ore (O / N), per tempi di stimolazione ormonale inferiori a 12 ore, aggiungere gli ormoni dopo il recupero delle microstrutture (decoda sotto il punto 3). Aggiungere gli ormoni, come si sospendere nuovamente le microstrutture e posizionare la sospensione su piastre di fissaggio ultra-basse. Microstrutture tessuti possono essere conservati su piastre di fissaggio ultra-bassi per un massimo di 7 giorni in mezzo di crescita-libera-factor di conservazione di circa il 70% della redditività.
7. Per RNA e l'analisi delle proteine, raccogliere microstrutture tessuti per centrifugazione a 400 xg per 5 minuti e flash freeze in provette.

3. Recupero di microstrutture del tessuto

1. Centrifugare il tubo (s) a 400 xg per 5 min. Aspirare il grasso dalla parte superiore della provetta e trasferire il supernatante del surnatante acquoso rimanente, che si arricchisce in fibroblasti, in un provetta da centrifuga e centrifugare a 1250 xg per 5 min.
   NOTA: le microstrutture del tessuto del seno sono molto appiccicoso, per tutte le fasi successive risospendere il pellet agitando delicatamente il tubo. Pipettaggio non è raccomandato a causa del rischio di perdere materiale.
2. Risospendere il pellet arricchiti in microstrutture ed in fibroblasti derivati ​​da surnatante acquoso in PBS, 2% Fetal Calf Serum (FCS). Successivamente girare entrambi i tubi a 1.250 xg per 5 minuti e poi scarta il surnatante.
3. Risospendere il pellet in 3 - 5 ml rosso tampone di lisi del sangue cellulare e trasferirli a pulire i tubi. Li Incubare per 5 minuti a RT.
4. Aggiungere 2x volume di PBS, 2% FCS e centrifugare a 1250 xg per 5 min. Lavare il pellet con PBS, 2% FCS e centrifugare a 1250 xg per 5 min. Ripetere questa operazione due volte.

4. I campioni di Citometria a Flusso

1. Aggiungere 1 - 2 ml di tripsina 0,25% al ​​pellet e mescolare pipettando su e giù delicatamente per 2 minuti con una Pipetman 1.000 microlitri a dissociarsi cellule.
2. Inibire l'attività tripsina aggiungendo 9 ml PBS, 2% FCS. Centrifugare a 450 xg per 5 min e risospendere il pellet in 10 ml di PBS, 2% FCS.
3. Trasferire la sospensione cellulare su un filtro cella 40 micron posto su top di un tubo da centrifuga da 50 ml per preparare singole cellule. Se pochi microlitri di sospensione cellulare rimangono sulla sommità del filtro, aiutare passano attraverso il filtro da essi aspirando dall'altro lato del filtro con una pipetta e aggiungere alle microstrutture filtrati.
4. Cellule immunitarie separati, fibroblasti e cellule endoteliali di microstrutture con un cocktail di anti-CD45, anti-FAP e anti-CD31 anticorpi e poi ordinare con FACS, sulla base di pan-epiteliale EpCAM marcatore CD10 e di separare le cellule luminali e basali, rispettivamente ¹⁰ .

5. I campioni di Istologia

1. Dopo aver lavato il materiale meccanicamente enzimaticamente digerito come sopra descritto, fissare pellets da 1,5 ml materiale iniziale in 1 ml di 4% PFA in PBS a temperatura ambiente per 30 min.
2. Centrifugare a 1.250 xg per 5 minuti e lavare con 1-2 ml di PBS due volte.
3. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min. Durante questo tempo, preparare 1% polivalente agarosio in Tris-acetato-EDTA (TAE) tampone e riscaldare la soluzione nel forno a microonde fino a quando la soluzione viene a ebollizione.
   1. Rimuovere la soluzione dal forno a microonde e agitare il matraccio delicatamente per miscelare la soluzione e risospendere le particelle rimanenti agarosio. Soluzione di agarosio Raffreddare a 50 ° C e versare 1 ml in uno stampo di base di paraffina dimensionato 31 × 23 × 13,5 millimetri.
4. Eliminare il supernatante e posizionare i pellet sopra dello strato solidificato (1 - 3 mm) di agarosio utilizzando una spatola con un'estremità piatta. Tutti Coprire con un ulteriore strato di agarosio (40 ° C).
5. Dopo le solidifica agarosio, di solito entro 5 minuti, mettere i blocchi agarosio nelle cassette per istologia paraffina incastro. Insieme con i campioni di agarosio posto un ufficio carta bianca nella cassetta con tutte le informazioni sul numero mastoplastica riduttiva, condizione sperimentale, e la data scritta in lettere minuscole a matita; questa scrittura resiste tutte le fasi di trattamento successive.
6. Mettere le cassette inPBS O / N, o in 70% di etanolo per immagazzinaggio durante il fine settimana, a 4 ° C. Non abbiamo notato alcuna differenza tra le due soluzioni di memorizzazione. Poi il trasferimento cassette istologici alle strutture istologici per paraffina.

6. microstrutture congelamento (Future) la coltura

1. Risospendere microstrutture del tessuto a congelamento mezzo costituito da FCS con il 10% dimetilsolfossido (DMSO) e congelare 1 ml aliquote in cryovials. Il numero di cryovials ottenuti dipende dalla quantità di materiale primario ottenuto da mastoplastica riduttiva.
2. Bloccare le cryovials contenenti microstrutture tessuto utilizzando un tasso freezer controllata con il seguente programma: 5 min dimora a 4 ° C, diminuendo la temperatura a -7 ° C con velocità di 6 ° C / min, diminuendo la temperatura a -12 ° C con velocità di 6 ° C / min, 10 min dimora, diminuendo la temperatura a -40 ° C con velocità di 6 ° C / min, diminuzione della temperatura a -80 ° C convelocità di 6 ° C / min. Poi trasferire i cryovials a -80 ° C freezer.
3. Il giorno dopo, trasferire i cryovials da -80 ° C a serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo.

Risultati

Per studiare il ruolo di estrogeni e progesterone e per capire meglio le loro funzioni molecolari nel seno umano, raccogliamo campioni freschi umani del tessuto del seno da pazienti sottoposti mammoplastiche riduzione (Figura 1) dopo aver ottenuto il loro consenso informato. Abbiamo anche ottenere medica e riproduttiva storia del paziente, così come un campione di sangue per determinare i livelli sierici di progesterone al momento dell'intervento. Tissue da mammoplastiche riduzione freschi è meccani...

Discussione

La cultura ex vivo qui descritto fornisce microstrutture del tessuto del seno contenenti dotti e lobuli intatte, insieme ad altri tipi di cellule che normalmente si trovano in seno femminile umano. Nella lavorazione del tessuto mammario umano normalmente ottenuti da mammoplastiche riduzione, rimozione del tessuto adiposo, la digestione enzimatica e meccanica della matrice stromale, e lisi dei globuli rossi arricchisce per frammenti condotto latte e unità lobulare duttali terminali. Digestione enzimatica Gentle ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Centrifuga per microlitri	Heraeus Biofuge Fresco	75005521
Centrifuga 5810R	Eppendorf	5810 000.327
Cryobox	Nalgene	5100-0001
Congelatore a velocità controllata EF600 Grant	Asymptote	Incubatore CO<
	Hera Cell Heraeus	51022391
Roller Mixer SRT9D	Sturt	SRT9D
Cassette istologiche	Medizintechnik	81-0021-00
Cell Strainer	Falcon	352340
Strile Surgical Blade	Aesculap	BB536
Bisturi	Aesculap	BB084R
Pinze	Aesculap	BD047R
Forbici	Aesculap	BC374R
Stampo a base di paraffina	SAKURA	4166
Temperatura di taglio ottimale (OCT) Cryomatrix	Thermoscientific	6769006
Penicillina/Streptomicina	Tecnologie di vita	15070-063
Antibiotico/antimicotico	Tecnologie di vita	15240-062
DMEM F/12	Tecnologie di vita	11039-021	Preriscaldamento (37 ° C)
Collagenasi	Roche	11 088 793 001	Preriscaldamento (37 ° C)
Siero fetale bovino	Life Technologies	10270	Può essere sostituito con
tampone per lisi ematica di cellule di	Sigma	R7757
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma	D2650
Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400-054
Agarosio	Invitrogen	16500-500
Formaldeide	Sigma	F1635
Paraformaldeide	Roth	335
Isopentano	Sigma	M32631
Etanolo	Merck	1009831000
Fiale criogeniche (5,0 ml)	VWR, International	479-0820
Piatto di coltura a bassissimo attacco	Corning, NY 14831	3471

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