Descriviamo l'implementazione della strategia REPLACE per indirizzare le interazioni proteina-proteina. REPLACE è una strategia iterativa che coinvolge approcci sintetici e computazionali per la conversione di inibitori peptidici ottimizzati in molecole simili a farmaci.
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Articolo metodologico
Sviluppo di inibitori di interazioni proteina-proteina attraverso REPLACE: Applicazione alla progettazione e allo sviluppo non ATP inibitori CDK competitivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
REPLACE è una strategia unica sviluppata per indirizzare più efficacemente le interazioni proteina-proteina (PPI). Ha lo scopo di ampliare lo spazio disponibile altro obiettivo fornendo una migliore metodologia per l'identificazione di inibitori di tali siti di legame e che rappresentano la maggior parte dei potenziali bersagli farmacologici. L'obiettivo principale di questo lavoro è quello di fornire una visione metodologica di utilizzo e applicazione della strategia REPLACE che prevede approcci di chimica computazionale e sintetiche. Replace è esemplificata attraverso la sua applicazione allo sviluppo di non-ATP chinasi ciclina dipendenti competitivo (CDK) inibitori come terapie antitumorali. CDK sono spesso deregolamentati nel cancro e, quindi, sono considerati come obiettivi importanti per lo sviluppo di farmaci. Inibizione di CDK2 / ciclina A in fase S è stato segnalato a promuovere l'apoptosi selettiva delle cellule tumorali in modo indipendente p53 attraverso la via E2F1. Targeting l'interazione proteina-proteina in bindin ciclinag scanalatura (CBG) è un approccio che permetterà l'inibizione specifica del ciclo cellulare nel corso CDK trascrizionali. La CBG è riconosciuto da una sequenza consenso derivato da substrati CDK e proteine oncosoppressori definito il legame motivo (CBM) ciclina. Il CBM è stato precedentemente ottimizzato per un octapeptide da p21Waf (HAKRRIF) e poi ulteriormente troncato ad un pentapeptide ritegno sufficiente attività (RRLIF). Peptidi, in generale, non sono delle cellule permeabili, sono metabolicamente instabile e quindi il REPLACE (sostituzione con Parziale Ligand Alternative attraverso computazionale arricchimento) strategia è stata applicata al fine di generare inibitori più farmaco-simili. La strategia inizia con la progettazione di Frammento legatura peptidi inibitori (flip), che inibiscono selettivamente ciclo cellulare complessi CDK / ciclina. Capovolge sono stati generati da iterativamente sostituendo residui di HAKRRLIF / RRLIF con frammento come piccole molecole (gruppi capping), a partire dalla N-terminale (Ncaps), seguita da sostituzione inil C-terminale. Questi composti sono punti di partenza per la generazione di non-ATP inibitori CDK competitivi come terapie anti-tumorali.
Introduzione
In questo articolo, un caso di studio di applicare il REPLACE (sostituzione con alternative ligando parziali utilizzando computazionale arricchimento) strategia per convertire inibitori peptidici di interazioni proteina-proteina in più molecole farmacologicamente rilevanti è descritta 1-3. Mentre PPI rappresentano una ricca ma poco sfruttato fonte di potenziali bersagli farmacologici, metodologie esistenti sono largamente insufficienti a rendere questi ampiamente accessibile. Le attuali strategie, tra cui frammento basato design a 4, high-throughput di screening 5 e peptidi pinzati 6 sono previsti anticipi, ma questi sono i....
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Protocollo
1. computazionale identificazione di potenziali piccola molecola Tappatrici gruppi
Nota: In linea di principio, una varietà di attracco o farmacofori metodi di ricerca può essere utilizzato per prevedere i potenziali gruppi di tappatura. Lo scopo principale di studi computazionali in REPLACE è quello di identificare piccole molecole che mantengono le caratteristiche e le interazioni degli aminoacidi che vengono sostituiti.
- Validazione del protocollo LigandFit attracco 14
Nota: In studi precedenti, il metodo di aggancio (LigandFit 15, un modulo della suite programma di mod....
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Risultati
Le interazioni di HAKRRLIF con scanalatura ciclina sono mostrati in Figura 2. I residui peptidici che rappresentano le principali determinanti di legame includono Ala2, Arg4, Leu6 e Phe8 con altri residui fornendo contributi piccole 12,13,18. In questo caso di studio la strategia REPLACE è stato utilizzato al fine di trovare alternative frammento di residui nel tetrapeptide N-terminale HAKRRLIF, imitando soprattutto le interazioni di Ala2 e Arg4. Una libreria di potenziali fr.......
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Discussione
Individuare le interazioni proteina-proteina (PPI) nella scoperta di farmaci è molto impegnativo in quanto queste coinvolgono tipicamente un'interfaccia di contatto ampia e superficiale composta da numerosi contatti diffusi19. Inoltre, i composti peptidici che inibiscono i PPI che sono suscettibili di scoperta di farmaci sono problematici a causa della loro maggiore massa molecolare, instabilità metabolica e scarsa biodisponibilità20. Le attuali strategie che sono state applicate per lo sviluppo di .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo i dottori Douglas Pittman e Michael Wyatt per la loro assistenza con la coltura cellulare e il dottor Wyatt e la signora Erin Anderson per l'aiuto nello sviluppo dei saggi leganti. Ringraziamo Mike Walla e Bill Cotham del Dipartimento di Chimica e Biochimica dell'Università della Carolina del Sud per l'assistenza con la spettrometria di massa, Helga Cohen e il Dr. Perry Pellechia per la spettrometria NMR. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health attraverso la sovvenzione del progetto di ricerca, 5R01CA131368.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Chimica computazionale | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Chimica organica sintetica | |||
| Gel di silice (piastre GF-254) per TLC, Biotage (Uppsala, Svezia) per cromatografia flash, HPLC Waters Alliance 2695 con un 2996 rivelatore a diodi e dotato di un C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 μ m (Phenomenox Luna) per la determinazione della purezza, gli spettri NMR 1H e 13C NMR sono stati registrati rispettivamente con uno spettrometro Varian Mercury 300 e 400. Gli spettri di massa sono stati misurati con un Micromass QTOF (spettrometro di massa a tempo di volo tandem quadruple-1), ionizzazione elettrospray (ESI) e VG 70S (spettrometro di massa a settore magnetico a doppia focalizzazione, EI). | |||
| Saggio di polarizzazione della fluorescenza | |||
| 384 piastre per micropozzetti, Micro pipette | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 e CDK2CA (complesso chinasico umano ricombinante ben purificato) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Ciclina D), 41101(CDK2/Ciclina A) | |
| tampone di analisi (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM ditiotretiolo (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | ||
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich-70 | ||
| ° C congelatore | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 rivelatore multimodale dotato di 485 nm/535 nm e uno specchio dicroico adatto per la fluoresceina | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 pozzetti | Fisher | ||
| Frozen stock di linee cellulari U2OS (osteosarcoma) e DU145 (cancro alla prostata) | ATCC | ||
| NU, terreni DMEM, tripsina, PEN/STRIP, reagente | MTTFisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Emocitometro | VWR-70 | ||
| ° C congelatore | Revco (Ultima II) | ||
| Incubatore | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuga | Eppendorf | 5804 R | |
| Frigorifero 4-8 ° C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 dotato di 595 filtro nm | Beckman Coulter, Brea, CA |
Riferimenti
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors....
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Ristampe e permessi
