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Articolo metodologico

Sintesi di indoxyl-glicosidi per il rilevamento di glicosidasi Attività

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DOI:

10.3791/52442

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27 maggio 2015

 , 
1Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Hamburg

In questo articolo

Sommario

I glicosidi indossilici sono strumenti ben consolidati e ampiamente utilizzati per lo screening enzimatico e il monitoraggio dell'attività enzimatica. Soprattutto per le strutture di tipo glucosio, le sintesi precedenti si sono rivelate impegnative e a bassa resa. Il nostro nuovo approccio impiega gli esteri dell'acido indossilico come preziosi intermedi per produrre un numero considerevole di glicosidi indossilici in buone rese.

Abstract

I glicosidi indossilici si sono dimostrati strumenti preziosi e versatili per monitorare le attività della glicosidasi. Gli indossili vengono rilasciati per idrolisi enzimatica e vengono rapidamente ossidati, ad esempio dall'ossigeno atmosferico, in coloranti di tipo indaco. Questa reazione consente uno screening rapido e semplice in vivo senza isolamento o purificazione di enzimi, nonché test rapidi su piastre di agar o in soluzione (ad esempio, screening blu-bianco, micropozzetti) ed è utilizzata in biochimica, istochimica, batteriologia e biologia molecolare. Purtroppo la sintesi di tali substrati si è rivelata difficile, a causa di varie reazioni collaterali e della bassa reattività della funzione indossil-ossidrilica. Soprattutto per le strutture di tipo glucosio sono state osservate basse rese. Il nostro nuovo approccio impiega l'estere dell'acido indossilico come intermedi chiave. Gli esteri dell'acido indossilico con vari modelli di sostituzione sono stati preparati su percorsi scalabili. Le glicosilazioni a trasferimento di fase con tali accettori e alogenuri glicosilici peracetilati possono essere eseguite in condizioni comuni ad alte rese. La scissione dell'estere e la successiva glicosilazione mediata dall'argento lieve producono i glicosidi indossilici peracetilati ad alte rese. Infine, la deprotezione viene eseguita secondo Zemplén.

Introduzione

Per lungo tempo, la produzione di indaco è stata un processo economicamente molto importante. Prima che sintesi chimiche su larga scala rendessero disponibile a basso costo l'indaco, i precursori venivano ottenuti da fonti naturali fin dall'epoca pre-cristiana. La coltivazione in Europa di piante produttrici di indaco (indaco naturale) divenne poco redditizia a partire dal XVII secolo.th secolo, poiché la quantità di precursori dell'indigo presenti nella pianta indiana dell'indigo (0,2-0,8%) è circa 30 volte superiore. Alla fine del XIX secolo, la sintesi chimica dell'indigo ha soppiantato la coltivazione tradizionale1,2.

I precursori dell'indaco presenti naturalmente nelle piante includono l'Indacano (1), l'Insatano A (2) e l'Isatano B (3) (Figura 1). Tutti contengono un gruppo indossile legato a un residuo glicosidico. La scissione del legame glicosidico, ad esempio mediante idrolisi enzimatica, porta al rilascio dell'indossile (4). L'indossile stesso è quasi incolore, ma può essere rapidamente ossidato per formare un colorante indaco (5). Questa reazione sensibile è stata adattata in biochimica, istochimica, batteriologia e biologia molecolare per il monitoraggio dell'attività enzimatica. È possibile effettuare screening dell'attività in vivo senza isolamento o purificazione degli enzimi, così come test rapidi su piastre di agar o in soluzione (ad es. screening bianco-blu, micropiastre). A seconda del residuo (ad es. esteri, glicosidi, solfati) legato alla porzione indossile, sono stati sviluppati substrati adatti per diverse classi enzimatiche (ad es. esterasi, glicosidasi, solfatasii)3. Nel seguito si concentrerà sulla formazione e sull'applicazione dei glicosidi dell'indossile.

Diagramma del processo di idrolisi dell'indicano che mostra la formazione di derivati dell'indolo e dell'indaco.
Figura 1: Precursori naturali dell'indaco e formazione del colorante indaco mediante idrolisi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il pattern di sostituzione del residuo indossile determina il colore e le proprietà fisiche del colorante indaco risultante. I pattern di sostituzione più comuni sono 5-bromo-4-cloro (abbreviato con X; blu-verdastro), 5-bromo (blu) e 5-bromo-6-cloro (magenta), poiché formano le particelle di colorante più piccole, non formano granuli e presentano la minore diffusione dai siti di idrolisi. Quest'ultima proprietà è particolarmente importante per esperimenti in vivo3.

La prima descrizione di un metodo indigeno per la rilevazione dell'attività esterasica risale al 1951, quando Barrnett e Seligman utilizzarono acetato e butirrato di indossile4Circa un decennio dopo, il principio indigogenico fu adattato per la localizzazione della glucosidasi nei mammiferi.5Finora sono stati sviluppati diversi glicosidi di indossile, anche se la loro sintesi si è rivelata difficile. La maggior parte delle sintesi si basa sull'impiego di un N-indossil acetilato come accettore e l'alogenuro glicosidico corrispondente come donatore6-14. La glicosilazione viene eseguita in acetone con idrossido di sodio. In queste condizioni, si verificano numerose reazioni secondarie, che riducono notevolmente il rendimento. Per strutture di tipo glucosio sono stati riportati rendimenti di glicosilazione particolarmente bassi (ad esempio, 15% per (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-glucopiranoside6 e 26% per (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetil-β-ᴅ-xilobioside14 in un esempio più recente). Mediante un approccio innovativo, che impiega esteri dell'acido indossilico, è stato possibile preparare un numero considerevole di glicosidi di indossile con rese elevate (ad esempio, (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-glucopiranosio resa del 57%.

Il seguente protocollo descrive la sintesi diretta dell'estere allilico dell'acido indossilico (5-bromo-4-cloro) e, sulla base di questa, la sintesi di un glicoside dell'indossile (X-Gal). Un semplice esperimento modello mostra la reattività enzimatica della β-galattosidasi impiegando X-Gal.

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Protocollo

Osservazioni generali:

Tutte le reazioni sono state effettuate utilizzando una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale adeguati. Tutti i reagenti e solventi (p.a.; contenuto d'acqua per solventi secchi: MeCN <50 ppm; et2o <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) sono stati acquistati da fonti commerciali e utilizzati come ricevuti. La TLC è stata eseguita su piastre Merck gel di silice 60 F254. I composti sono stati rilevati mediante UV e/o trattamento con EtOH/H2SO4 (9:1) e successivo riscaldamento. La cromatografia su colonna è stata eseguita con gel di silice Merck/Fluka 60 (230-400 mesh). Le filtrazioni sono state eseguite utilizzando l'imbuto Büchner e la pompa aspirante. I solventi sono stati rimossi utilizzando un evaporatore rotante (40 °C, ~200 rmp). I prodotti sono stati essiccati in alto vuoto (pompa rotativa a palette). Le reazioni che richiedevano solventi secchi venivano effettuate in atmosfera di argon.

Di seguito viene descritta la sintesi di X-Gal (16) che impiega l'estere allilico dell'acido 5-bromo-4-cloro-indossilico (12). Per ulteriori composti con vari modelli di sostituzione e esteri metilici preparati secondo questa sequenza sintetica vedi rif.17-19.

1. Accettore: Sintesi dell'estere allilico18 dell'acido 5-bromo-4-cloro-indossilico (12)

  1. N-acetilazione: sintesi di N-(4-bromo-3-cloro-2-metilfenil)-acetammide (6)
    1. Sciogliere 10,0 g (45,7 mmol) di 4-bromo-3-cloro-2-metilanilina in 30 ml di diclorometano.
      Cautela! Il diclorometano è dannoso e raffredda la soluzione in un bagno di ghiaccio.
    2. Aggiungere 6,50 ml (68,7 mmol) di anidride acetica goccia a goccia e lasciare che la miscela si riscaldi a temperatura ambiente. La miscela può essere mescolata per 8 ore o durante la notte. Cautela! L'anidride acetica è corrosiva e infiammabile.
    3. Rimuovere il solvente e ricristallizzare da acetato di etile/metanolo 9:1 (resa: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), solido incolore).
      Cautela! L'acetato di etile è irritante e infiammabile. Cautela! Il metanolo è tossico e infiammabile.
  2. Ossidazione: Sintesi dell'acido N-acetil-5-bromo-6-cloro-antranilico (7)
    1. Riflusso: una miscela di 2,30 g (8,76 mmol) di 6 (prodotto ottenuto dalla fase 1.1) e 2,10 g (8,52 mmol) di MgSO4•7H2O in 40 ml di acqua in un pallone a fondo tondo a 3 colli dotato di raffreddatore e imbuto di goccia.
    2. Aggiungere goccia a goccia 50 ml di soluzione satura di KMnO4 in acqua alla miscela di reazione per un periodo di 3 ore. Riscaldare quindi per altre 2 ore in condizioni di riflusso, a circa 135 °C in bagno d'olio. Cautela! Il permanganato di potassio è dannoso e ossidante.
    3. Raffreddare a temperatura ambiente e filtrare la pirolusite (MnO2), che si forma durante la reazione.
      Cautela! La pirolusite è dannosa.
    4. Aggiungere acido cloridrico (37%) al filtrato fino a pH 1, quindi filtrare il prodotto ed essiccare sotto vuoto, (resa: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), solido incolore).
      Cautela! L'acido cloridrico è corrosivo.
  3. Deacetilazione: Sintesi dell'acido 5-bromo-6-cloro-antranilico (8)
    1. Sciogliere 3,90 g (13,3 mmol) di 7 (prodotto ottenuto dalla fase 1.2) in 70 ml di soluzione acquosa di idrossido di sodio 1 N e scaldare a circa 100 °C (bagno d'olio) per 5 ore
      Cautela! L'idrossido di sodio è corrosivo.
    2. Raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere acido cloridrico (37%) fino a pH 1, quindi filtrare il prodotto con un imbuto Büchner e asciugare sottovuoto, (resa: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), solido incolore).
  4. Formazione di anidridi: Sintesi dell'anidride 5-bromo-6-cloro-isatoica (9)
    1. Sospendere 8,17 g (32,6 mmol) di 8 (prodotto ottenuto dalla fase 1.3) in 33 ml di acetonitrile secco.
      Cautela! L'acetonitrile è dannoso e infiammabile.
    2. Mescolare a temperatura ambiente e aggiungere 5,3 ml e una soluzione di 3,22 g (10,8 mmol) di trifosgene in 18,5 ml di diclorometano secco goccia a goccia contemporaneamente per un periodo di 30 minuti. Quindi riscaldato per 3 ore a 50 °C (bagno d'olio). Cautela! La piridina è dannosa e infiammabile.
      Cautela! Il trifosgene è tossico e può rilasciare fosgene.
    3. Rimuovere circa il 75% del solvente e spegnere la reazione aggiungendo 100 ml di acqua distillata e filtrare il prodotto. Lavare con una piccola quantità di diclorometano freddo.
    4. Essiccare il prodotto sottovuoto, (resa: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), solido incolore).
  5. N-alchilazione: Sintesi dell'anidride 5-bromo-6-cloro-N-[(metossicarbonil)allil]-isatoica (10)
    1. Sciogliere 25 g (90 mmol) di 9 (prodotto ottenuto dalla fase 1.4) in 250 ml di dimetilformammide anidra e raffreddare con un bagno di ghiaccio.
      Cautela! La dimetilformammide è dannosa e infiammabile
    2. Aggiungere 1,15 equivalenti di idruro di sodio (60% in paraffina) per porzione.
      Cautela! L'idruro di sodio è corrosivo e infiammabile; Reazione pesante con acqua/ghiaccio.
    3. Dopo 30 minuti di agitazione a 0 °C, lasciare riscaldare a temperatura ambiente e aggiungere 1,2 equivalenti di bromoacetato di allile goccia a goccia.
    4. Dopo aver agitato per 5 ore, spegnere la reazione aggiungendo 500 ml di acqua distillata e filtrare il prodotto.
    5. Lavare con acqua (3 volte, 100 ml) e asciugare il prodotto sottovuoto, (resa: 93% (31,5 g, 84,1 mmol), solido incolore).
  6. Apertura dell'anidride: Sintesi dell'estere allilico dell'acido 5-bromo-6-cloro-N-(metossicarbonilallilico) (11)
    1. Sciogliere 10 g (27 mmol) di 10 (prodotto ottenuto dallo step 1.5) in 100 ml di alcool allilico.
      Cautela! L'alcol allilico è dannoso e pericoloso per l'ambiente.
    2. Aggiungere 350 mg (8,70 mmol) di idruro di sodio (60% in paraffina) per porzione.
    3. Dopo aver mescolato per 6,5 ore o per una notte, rimuovere il solvente.
    4. Sottoporre il prodotto grezzo a cromatografia su colonna (colonna 30 x 6 cm; 240 g di silice) etere di petrolio/acetato di etile 2:1; RF = 0,66), (resa: 80% (8,30 g, 21,3 mmol), olio giallo).
      Cautela! L'etere di petrolio è infiammabile, irritante e pericoloso per l'ambiente.
  7. Condensazione Di Dieckmann: Sintesi dell'estere allilico dell'acido 5-bromo-4-cloro-indossilico (12)
    1. Miscelare 3,0 g (7,7 mmol) di 11 (prodotto ottenuto dalla fase 1.6) e 1,75 g (15,6 mmol) di terz-butossido di potassio in 100 ml di etere etilico secco.
      Cautela! Il terz-butossido di potassio è corrosivo e infiammabile.
      Cautela! L'etere etilico è dannoso ed estremamente infiammabile.
    2. Scaldare la miscela a riflusso (raffreddatore) per 2 ore a 40-45 °C.
    3. Rimuovere circa il 75% del solvente e aggiungere acido cloridrico diluito (100 ml, 1 M).
      Cautela! Non asciugare completamente, può verificarsi decomposizione.
    4. Filtrare il prodotto ed essiccare sottovuoto, (resa: 84% (5,14 g, 15,5 mmol), solido da incolore a leggermente verde).

2. Indoxil-glicoside: sintesi di X-Gal17

  1. Glicosilazione A Trasferimento Di Fase: Sintesi di (5-bromo-4-cloro-indox-3-ylic acid allylic ester) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-galattopiranoside (14)
    1. Miscelare 400 mg (1,21 mmol) di acido indossilico allilester 12 (prodotto ottenuto dalla fase 1.7), 410 mg (1,21 mmol) di tetrabutilammonio idrogenosolfato e 500 mg (1,21 mmol) del donatore 2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-ᴅ-galattopiranosil bromuro (α-acetobromogalattosio) in 10 ml di diclorometano. Cautela! L'idrogenosolfato di tetrabutilammonio è dannoso.
    2. Aggiungere 10 ml di una soluzione acquosa di carbonato di potassio (1 M).
      Cautela! Il carbonato di potassio è corrosivo.
    3. Mescolare a temperatura ambiente fino al completo consumo del donatore (TLC: etere di petrolio/acetato di etile).
    4. Separare la fase organica (imbuto separatore), asciugare su Na2SO4 e rimuovere il solvente.
    5. Sottoporre il prodotto grezzo a cromatografia su colonna (etere di petrolio/acetato di etile 1:1; RF = 0,33). (resa: 86% (690 mg, 1,04 mmol), solido incolore).
  2. Scissione e decarbossilazione dell'estere: sintesi di (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-galattopiranoside (15)
    1. Sciogliere 600 mg (0,908 mmol) di 14 (prodotto ottenuto dalla fase 2.1) in 15 ml di tetraidrofurano secco.
      Cautela! Il tetraidrofurano è dannoso e infiammabile.
    2. Aggiungere 800 μl di morfolina e 105 mg (9,09 μmol) di tetrakis(trifenilfosfina)palladio(0) e mescolare per una notte a temperatura ambiente.
      Attenzione! La morfolina è infiammabile e corrosiva.
    3. Rimuovere il solvente.
    4. Aggiungere 400 mg (2,40 mmol) di acetato d'argento, 800 mg (5,79 mmol) di carbonato di potassio e 10 ml di anidride acetica.
      Cautela! L'acetato d'argento è irritante e pericoloso per l'ambiente.
    5. Riscaldare a 90-100 °C per 20 min.
    6. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, diluire con diclorometano.
    7. Lavare la miscela due volte con acqua e una volta con una soluzione diluita di NaHCO3 (10%).
      Cautela! Il bicarbonato di sodio è corrosivo.
    8. Asciugare la fase organica su Na2SO4 (filtro) e rimuovere il solvente.
    9. Sottoporre il prodotto grezzo a cromatografia su colonna (PE/EA 1:1; RF = 0,24), (resa: 88% (495 mg, 8,00 mmol), solido incolore).
  3. Deacetilazione di Zemplén: sintesi di (5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-β-ᴅ-galattopiranoside (16)
    1. Sciogliere 396 mg (0,436 mmol) 15 (prodotto ottenuto dal passaggio 2.2) in 10 ml di metanolo.
    2. Aggiungere una quantità catalitica di metanolato di sodio e mescolare per una notte a temperatura ambiente.
      Cautela! Il metanolato di sodio è infiammabile e corrosivo.
    3. Neutralizzare con Amberlite IR-120 H+ (filtro) e concentrato.
      Cautela! Amberlite IR-120 H+ è irritante.
    4. Essiccare il prodotto sottovuoto, (resa: 87% (170 mg, 0,416 mmol), solido incolore).

3. Esperimento del modello illustrativo: prova dell'attività della β-galattosidasi che impiega X-Gal

  1. Preparare una soluzione 0,5 mM di X-Gal in 500 μl di tampone (Tris-HCl 20 mM; pH 7,4; 50 mM di NaCl, 0,1 mM di acido etilendiamminotetraacetico; o qualsiasi altro tampone adatto per l'enzima) in una provetta da microcentrifuga (X-Gal può essere sciolto in pochi μl di dimetilsolfossido).
  2. Aggiungere 1 μl di β,1-3-galattosidasi (EC 3.2.1.23 10.000 U/ml; o qualsiasi altra β-galattosidasi idonea) e agitare (600 rps) a 37 °C.
  3. Segui la reazione. Il colorante di tipo indaco si forma dopo un breve periodo di tempo.

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Risultati

Le prime sintesi dell'indicano e del 5-bromo-indicano furono pubblicate da Robertson già nel 1927 e nel 192915,16. Utilizzando l'estere metilico dell'acido indoilico come accettore, la posizione reattiva in posizione 2 veniva bloccata e, di conseguenza, le reazioni secondarie erano parzialmente soppresse. La glicosilazione in acetone/idrossido di sodio, seguita da deprotezione e decarbossilazione (160 °C, anidride acetica, 1 ora) e infine da deacetilazione, permise di ottenere indicano e 5-bromo-indicano. Sull...

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Discussione

A causa delle scarse rese e delle limitazioni, in particolare per le strutture di tipo glucosio e i saccaridi più complessi, è stato sviluppato un nuovo approccio sintetico verso i glicosidi indossilici. Gli esteri dell'acido indossilico si sono dimostrati preziosi intermedi chiave e sono stati ottenuti in un percorso modulare e scalabile. Tutti i passaggi sono ad alto rendimento e, grazie ai materiali di partenza economici e alla facilità di elaborazione, sono possibili sintesi di più grammi. Il vantaggio dell'approccio...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Il supporto a questo lavoro da parte di Glycom A/S, Copenhagen, Danimarca, è ringraziato.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anidride aceticaGrü ssing10298Corrosivo, infiammabile
AcetonitrileSigma-Aldrich608-001-00-3Nocivo, infiammabile
Alcool allilicoAldrich453021Nocivo, pericoloso per l'ambiente
Amberlite IR-120 H+Fluka06428
Acido bromoaceticoMerck802260Corrosivo, tossico, pericoloso per l'ambiente
4-Bromo-3-cloro-2-metilanilinaABCRAB 171687Irritante
DiclorometanoACROS326850010
Dannoso Etere dietilicoGrü ssing10274nocivo, estremamente infiammabile
348430010nocivo e infiammabile
Sigma-Aldrich41648
Acetato di etileSigma-Aldrich607-022-00-5Irritante, infiammabile
Acido etilendiamminotetraaceticoAppliChemA1103.0500Irritante
β 1,3-galattosidasi, ricombinante, E. coliCalbiochem345795
Acido cloridricoVWR20252.290Corrosivo
Solfato di magnesio idratoMerck105885
MetanoloACROS326950010Tossico, infiammabile
MorfolinaJanssen Chimica15.868.57Corrosivo, infiammabile
Etere di peroleoAzelis111053Infiammabile, irritante, pericoloso per l'ambiente
Carbonato di potassioGrü ssing12005
Permanganato di potassioGrü ssing12056Nocivo, ossidante
Terz-butossido di potassioMerck804918Corrosivo, infiammabile
PiridinaSigma-Aldrich613-002-00-7Nocivo, infiammabile
Acetato d'argentoFluka85140Irritante, pericoloso per l'ambiente
Bicarbonato di sodioGrü ssing12144Idruro di sodio corrosivo
Merck814552corrosivo, infiammabile
Riedel-de Hä itS181200Metanolato di sodio corrosivo
Merck806538Solfato di sodio corrosivo e infiammabile
Grü ssing12175
Tetrabutilammonio idrogenosolfatoLancaster5438
TetraidrofuranoSigma-Aldrich87371
Tetrakis (trifenilfosfina)Sigma-Aldrich216666
TrifosgeneFluka15217Tris tossico
(idrossimetil)amminometano cloridratoSigmaT-3253irritante
irritante Dimetilformammide ACROS Dimetilsolfossido corrosivo Idrossido di sodio dannoso nocivo e infiammabile palladio (0)

Riferimenti

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