Articolo metodologico

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/52445

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22 febbraio 2015

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1Institute for Society and Genetics, University of California, Los Angeles, 2Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 3California Nanosystems Institute, Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo le fasi dettagliate di un test chimico ad alto rendimento nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzato per valutare la tossicità germinale. In questo test, l'interruzione della funzione germinale a seguito di esposizione chimica viene monitorata utilizzando un reporter fluorescente specifico per embrioni aneuploidi.

Abstract

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Identificare la tossicità riproduttiva delle migliaia di sostanze chimiche presenti nel nostro ambiente è stata una delle sfide più allettanti nel campo della salute ambientale. Ciò è dovuto in parte alla scarsità di sistemi modello che può (1) ricapitolare accuratamente chiavi caratteristiche dei processi riproduttivi e (2) lo fanno in un medio di moda high-throughput, senza la necessità di un elevato numero di animali vertebrati.

Descriviamo qui un test nel nematode C. elegans che permette la rapida identificazione delle sostanze tossiche linea germinale monitorando l'induzione di embrioni aneuploidi. Facendo uso di una linea di GFP giornalista, errori nella segregazione dei cromosomi derivanti da interruzioni germinale sono facilmente visualizzati e quantificati al microscopio a fluorescenza automatizzata. Così la proiezione di un particolare insieme di composti per la sua tossicità può essere eseguita in un formato di piastra da 96 a 384 pozzetti in pochi giorni. Analisi secondaria di h positivola sua può essere eseguita per stabilire se le anomalie cromosomiche originati da interruzioni meiotic o dai primi errori segregazione dei cromosomi embrionali. Complessivamente, questo test rappresenta una veloce strategia di primo passaggio per la rapida valutazione della disfunzione linea germinale dopo l'esposizione chimica.

Introduzione

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Ci sono circa 87.000 sostanze chimiche registrate per il commercio negli Stati Uniti, ma solo un piccolo numero di questi sono stati testati per i potenziali effetti sulla salute 1. Di quelli che sono stati testati, solo una parte è stata esaminata per effetti sulla salute riproduttiva dovuti in parte alla difficoltà di determinare alterazioni degli eventi riproduttivi primi nei mammiferi, in particolare durante lo sviluppo delle cellule germinali femminile e differenziazione. In effetti, i primi eventi meiotici hanno luogo durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei mammiferi di sesso femminile e sono quindi di difficile accesso e raccogliere in n....

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Protocollo

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1. Preparazione di batteri alimentazione

NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di batteri alimentazione (ceppo di E. coli OP50).

  1. Isolare una singola colonia di E. coli ceppo OP50 da un brodo lisogenia (LB) piastra di agar e asetticamente inoculare in 300 ml di brodo LB autoclavato.
  2. Lasciare la coltura inoculata a crescere durante la notte in un agitatore a 200 rpm e 37 ° C, fino a saturazione.
  3. Trasferire il OP50 in 6 50 ml provette coniche sterili, pre-pesati. Pellet i batteri per centrifugazione per 5 min a 6.000 giri (5.000 xg).
  4. Eliminare il surnatante e lavare i batteri....

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Risultati

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L'esposizione della Pxol-1 :: GFP giornalista ceppo ad agenti chimici quali microtubulo veleno nocodazole (Figura 1) porta alla induzione di una elevata percentuale di embrioni-GFP esprimere nell'utero di ermafroditi adulti esposti rispetto al controllo DMSO. Gli embrioni GFP-positive sono significativamente più luminoso sfondo debole fluorescenza osservato in altri embrioni nonché l'auto-fluorescenza osservato nell'intestino degli animali. Vermi sono direttamente esposte ripreso su piastre 384.......

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Discussione

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Il metodo qui descritto costituisce la prima strategia larga scala per l'identificazione di sostanze tossiche germinali. Si richiede l'uso di un transgenico GFP Pxol-1 :: GFP contenente ceppo che riporta fedelmente l'induzione di aneuploidie in embrioni precoci che viene utilizzato come proxy per la disfunzione linea germinale. Il metodo prevede l'accurata sincronizzazione di un C. popolazione verme elegans e l'esposizione a sostanze chimiche worm 'in formato a 96 pozze.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: NIH ES020353 e il premio Colgate-Palmolive Alternative Research Grant per aver reso possibile questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre Petri ventilate da 60 mmTritechT3315
AgarApex20-274
Axygen 96 pozzetti trasparenti fondo rotondo 2 ml di piastra profonda in polipropileneCorningP-DW-20-C-S
BactopeptoneApex20-261
Bacto-triptoneFisher ScientificBP1421-2
CandegginaClorox
Cloruro di calcio (CaCl2)VWRAA12316-A1
ColesteroloFisher ScientificICN10138225
DMSOVWRIC19018680
E. coli (OP50)Caenorhabditis Genetics Centerhttp://www.cbs.umn.edu/cgc
Etanolo 200 proofVWREM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 piastre pozzettiSigma-AldrichM1937-32EA
ImageXpress Micro XLS SystemMolecular Devices
Levamisolo cloridratoFluka31742
Solfato di magnesio anidro (MgSO4)VWR97061-438
MetaXpress Acquisizione di immagini ad alto contenuto e Fosfato
potassio monobasico (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
Pellicole di rayon per colture biologicheVWR60941-086
Cloruro di sodio (NaCl)
ScientificS318
Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)VWRBDH0316
StereomicroscopioNikonSMZ 745Questo microscopio ha un ingrandimento totale da 3,35X a 300X. Qualsiasi microscopio con caratteristiche simili funzionerà.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP ceppo reporterCaenorhabditis Genetics Centerhttp://www.cbs.umn.edu/cgc
Estratto di lievitoBecton Dickinson212750
di Sidrossido di sodio (NaOH)Fisher

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
  2. Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), ....

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Tossicit della linea germinaleC elegansembrioni aneuploidireporter GFPmicroscopia a fluorescenzascreening chimicosegregazione cromosomicasincronizzazione dei vermihigh throughputimaging automatizzato

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