Articolo metodologico

Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

DOI:

10.3791/52451

⸱

19 aprile 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, 2INSERM, U968, 3CNRS, UMR_7210

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per studiare la permeabilità della barriera emato-retinica e l'integrità della membrana limitante interna in modelli animali di malattia retinica, abbiamo utilizzato diverse varianti di virus adeno-associati (AAV) come strumenti per marcare i neuroni retinici e la glia. L'espressione genica reporter mediata da virus viene quindi utilizzata come indicatore della permeabilità della barriera retinica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Müller cellule sono le principali cellule gliali della retina. I loro finali piedi formano i limiti della retina alle membrane limitanti esterna ed interna (ILM), e in collegamento con astrociti, periciti e cellule endoteliali stabiliscono la barriera emato-retinica (BRB). BRB limita trasporto di materiale tra il flusso sanguigno e la retina mentre la ILM agisce come una membrana basale che definisce istologicamente il confine tra la retina e la cavità vitreo. Etichettatura cellule Müller è particolarmente rilevante per studiare lo stato fisico delle barriere della retina, in quanto queste cellule sono parte integrante della BRB e ILM. Sia BRB e ILM sono spesso alterati nelle malattie della retina e sono responsabili per i sintomi della malattia.

Esistono diversi metodi ben stabiliti per studiare l'integrità del BRB, quali il test blu Evans o fluorangiografia. Tuttavia questi metodi non forniscono informazioni sul grado di permeabilità BRB to molecole più grandi, in nanometri. Inoltre, essi non forniscono informazioni sullo stato di altri ostacoli retina, come la ILM. Per studiare BRB permeabilità al fianco della retina ILM, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità della BRB di molecole più grandi, pur indicando lo stato dei ILM e della matrice extracellulare proteine ​​in stati di malattia. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. AAV5 ha un tropismo naturale fotorecettori, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo quando l'ILM è intatto (cioè, in wild-type retine). ShH10 ha un forte tropismo verso le cellule gliali e selettivamente etichettare glia Müller sia retine sani e malati. ShH10 fornisce consegna del gene più efficiente in retine dove ILM è compromessa. Questi strumenti virali accoppiato con immunoistochimica e sangue-DNA analisi hanno fatto luce sulla condizione delle barriere retina nella malattia.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Müller cellule sono il principale componente gliale della retina. Morfologicamente, che abbracciano la retina radiale e la loro endfeet, in contatto con il vitreo, affrontano la ILM e componenti segreti di quest'ultima. La ILM è una membrana basale composta da una decina di diverse proteine ​​della matrice extracellulare (laminina, agrin, perlecan, nidogen, collagene e proteoglicani diversi solfato eparina). Durante lo sviluppo, la sua presenza è indispensabile per istogenesi retinica, la navigazione di assoni ottica, e la sopravvivenza delle cellule gangliari 1-3. Tuttavia, ILM è inessenziale in retina adulta e può essere rimosso chirurgicamente in alcune patologie, senza causare danni alla retina 4. Nella terapia genica, questa membrana diventa una barriera fisica per la trasduzione efficiente della retina mediante AAV per iniezione intravitreale 5.

Attraverso l'ampia arborizzazione dei loro processi, le cellule Müller forniscono Suppo nutrizionale e regolamentarert per entrambi i neuroni della retina e cellule vascolari. Cellule Müller sono anche coinvolti nella regolazione dell'omeostasi retinica, nella formazione e mantenimento del BRB 6. Giunzioni strette tra le cellule endoteliali dei capillari della retina, Müller cellule, astrociti e periciti formano la BRB. BRB previene alcuni sostanze di entrare i retina.In molte malattie come la retinopatia diabetica, occlusione venosa retinica e malattie respiratorie, ipossia della retina provoca perdita attraverso la BRB 7-9. Questa rottura è associato ad un aumento della permeabilità vascolare che porta a edema vasogenico, distacco della retina e danni alla retina.

Cellule Müller sono strettamente associati con i vasi sanguigni e la membrana basale, svolgendo un ruolo importante sia l'integrità BRB e ILM. Di conseguenza, l'etichettatura cellule gliali Müller è particolarmente rilevante per lo studio dello stato fisico di queste barriere retiniche.

Classicoalleato, BRB permeabilità viene misurata usando il saggio blu Evans costituito da iniezione sistemica di Evans colorante blu, che lega non covalente all'albumina plasmatica. Questo test misura la perdita di albumina (proteine ​​di dimensioni intermedie, ~ 66 kDa) dai vasi sanguigni nella retina (vedi Protocolli sezione 5) 10. In alternativa, la perdita vascolare può essere visualizzato con la fluorescenza angiografia retinica attestante l'assenza di perdite di fluoresceina (piccola molecola, ~ 359 Da, vedere Protocolli sezione 6) 11. Tuttavia, entrambi i metodi consentono la valutazione della permeabilità BRB di piccole molecole e proteine, ma non forniscono informazioni circa l'integrità ILM.

Quindi, a studiare BRB permeabilità, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità BRB di molecole più grandi (ad esempio, le particelle di AAV, 25 di diametro nm). In effetti, il nostro metodo in grado di rilevare la presenza di AAV transgene nel sangue, il che suggerisce che le particelle ~ 25 nm di diametro farebberoessere in grado di infiltrarsi nel flusso sanguigno. Questo metodo fornisce anche informazioni sulla struttura del ILM e proteine ​​della matrice extracellulare in condizioni patologiche. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. Subretinally iniettato, AAV5 ha un tropismo naturale per fotorecettori della retina e dell'epitelio pigmentato 12, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo in wild-type retine con ILM intatto 5,13. ShH10 è una variante AAV che è stato progettato per indirizzare specificamente cellule gliali oltre neuroni 14,15. ShH10 etichette selettivamente le cellule Müller sia retine sani e malati con maggiore efficienza in retine con barriere compromesse 16. Questi strumenti virali accoppiato con immuhistochemistry e analisi del sangue-DNA forniscono informazioni sullo stato degli ostacoli retiniche e il loro coinvolgimento nella malattia (Figura 1).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati curati e trattati secondo la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research.

1. Produzione di ricombinante AAV (rAAV) per Transient trasfezione di cellule HEK-293 17,18

NOTA: Vedere McClure C, JoVE (2011) 19.

  1. Purificare larga scala Miniprep (almeno 1 mg / ml) dei plasmidi vettore AAV. Utilizzare 3 plasmidi. Il plasmide AAV helper trasportano i geni del capside replica e senza terminale invertita AAV ripete ITR, la cassetta di espressione del transgene trasporta la AAV ITR denominato plasmide di trasferimento, e il plasmide fornendo i geni adenovirus helper E2, E4, e VA geni RNA contemplato come pHELPER.
  2. Trasfezione 293 cellule con questi 3 plasmidi usano polietilenimina (o altro reagente trasfezione). Sopra 80% di efficienza di trasfezione è necessario per una buona vii rendimenti RAL.
  3. Purificare AAV ricombinante da 293 lisati cellulari su una pendenza iodixanolo. 15%, 25%, 40% e 60% iodixanolo viene utilizzato per ottenere il gradiente. Colleziona 40% frazione iodixanolo contenente particelle AAV, concentrare la frazione dopo ultracentrifugazione a 500.000 xg per 1 ora e buffer di scambio contro PBS (tampone fosfato salino) con il 0,001% Pluronic.
  4. Per determinare virale titolo genomico 20, eseguire un DNAse ProteinaseK digest seguito da QPCR. I primer avanti e invertire amplificano la regione 62 bp situata nel AAV2 ITR. Per lo standard plasmide, la sonda è marcato con FAM e ha un buco nero quencher (BHQ).
  5. Eseguire qPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa) in un volume finale di 25 ml con 340 Nm invertire ITR fondo, 100 nM ITR avanti fondo, 100 nM sonda AAV2 ITR, 0.4 dNTPs mm, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq e mascherina 5 microlitri (standard, campione e nessun controllo modello).
  6. Perlo standard, utilizzare il plasmide per la trasfezione in 7 x 10 diluizioni seriali (5 ml ciascuno di 2 x 10 9 2 x 10 3 genomi / ml risultanti in una concentrazione finale 10 ottobre-4 ottobre genomi / ml).
  7. Iniziare il programma da una fase di denaturazione iniziale a 95 ° C per 15 min seguita da 40 cicli di denaturazione a a 95 ° C per 1 min e ricottura / estensione a 60 ° C per 1 min. Conservare a 4 ° C per una conservazione a breve termine oa -20 ° C per lunghi periodi di stoccaggio.

2. iniezione intravitreale di AAV

  1. Anestetizzare topi C57BL6J con ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verifica la perdita del riflesso di raddrizzamento, il ritiro e la coda reflex pinch risposta che indica il corretto anestesia. Dilatare gli alunni per l'applicazione della cornea del neosynephrine 5% e il 0,5% mydriaticum collirio. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  2. Passare un ultrafine 30 G disposable ago attraverso l'equatore e vicino al limbus, in camera vitreale (vedi Chiu K, JoVE (2007) 21). Iniettare 1 ml magazzino contenente da 1 a 4 x 10 11 vp di ShH10-GFP o AAV5-GFP con l'osservazione diretta dell'ago al centro della cavità vitreale (Figura 1). Utilizzare un occhio come controllo per esperimenti ILM. Iniettare entrambi gli occhi per esperimenti BRB. Applicare un trattamento topico antinfiammatoria e antibatterica sugli occhi iniettati.
  3. Dilatare alunni neosynephrine e mydriaticum collirio per l'imaging. Eseguire l'esame del fondo con una fotocamera fundus dell'occhio di seguire GFP (Green Fluorescent Protein) espressione 1 settimana, 2 settimane, 1 mese e 2 mesi dopo l'iniezione intravitreale (Figura 1). Sacrificio topi da CO 2 inalazione 1 a 2 mesi dopo l'iniezione.

3. Immunoistochimica

  1. Per criosezioni retina (Figura 1), sezionare occhi enucleati per rimuovere lens e della cornea, e l'immersione correzione in 4% paraformaldeide per 1 ora.
    1. Cryoprotect gli occhi fissi precedentemente a 10% di saccarosio per 1 ora a temperatura ambiente, 20% di saccarosio per un'altra ora a temperatura ambiente. Cryoprotect in soluzione di saccarosio al 30%, overnight a 4 ° C. Congelare e paraocchi incorporare in embedding resina, come Cryo-matrix. Fare 10 micron criosezioni e montare su vetrini appositamente trattati per sezioni di tessuto congelato e che migliorano l'aderenza del tessuto durante la colorazione.
    2. Permeabilize sezioni con 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 per 5 min. Lavare 2x in PBS e blocco per 1 ora a temperatura ambiente in PBS con 1% BSA, 0,1% Tween 20.
  2. Per flatmounts retina (Figura 1), fissare gli occhi enucleati in 4% paraformaldeide per 15 min per facilitare la dissezione.
    1. In 15-30 min, sezionare gli occhi per rimuovere la cornea e la lente. Separare la retina da dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) e sclera tagliando intorno alla serrata eil nervo ottico. Immergere in 4% paraformaldeide per altri 30 minuti per fissare la retina e la proteina fluorescente in cellule retiniche trasdotte (fissaggio non deve superare 24 ore). Lavare 5 min in PBS sterile, pH 7.4.
    2. Cambiare il PBS al tampone di bloccaggio (PBS con 1% BSA, 2% di capra normale o siero asino, 0,5% Triton X-100), e incubare in tampone di bloccaggio sia per 4 ore a temperatura ambiente oa 4 ° C durante la notte.
  3. Incubare tessuti con anticorpi primari in tampone di bloccaggio sia per 4 ore a temperatura ambiente o in una notte a 4 ° C. Lavare 3x con PBS.
    NOTA: Gli anticorpi utilizzati sono i seguenti: anti-laminina (1 / 1.000) etichettatura della ILM, clone anti-rodopsina 4D2 (1/500) aste di etichettatura, anti-glutammina sintetasi clone GS-6 (1 / 1.500) di etichettatura cellule Müller , PNA Lectin (1/40) coni di etichettatura.
  4. Incubare tessuti con diluizione 1: 500 di anticorpi secondari coniugati fluoro Alexa in tampone di bloccaggio per 1 ora (criosezioni) o 2 ore (flatmounts) presso la sala tempetura e al riparo dalla luce. Lavare 3x con PBS.
  5. Effettuare tagli alleviare alla retina e flatmount è su un vetrino o con il fotoricettore o cellule gangliari della retina (RGC) lato rivolto verso l'alto. Aggiungi mountingmedium acquosa, applicare il coprioggetto e conservare a 4 ° C.
  6. Eseguire microscopia confocale a scansione laser confocale. Acquisire le immagini in sequenza, riga per riga, per ridurre l'eccitazione e crosstalk emissione. Definire passo secondo il teorema del campionamento di Nyquist-Shannon. Utilizzare le impostazioni di esposizione che riducono al minimo i pixel troppo saturi nelle immagini finali. Elaborare immagini a 12 bit con le Figi, progetto Z-sezioni su un unico piano con la massima intensità in funzione Z-progetto ed infine convertire in modalità colore RGB a 8 bit.

4. PCR analisi di campioni di sangue del mouse

  1. Iniettare 100 microlitri magazzino contenente da 1 a 4 x 10 11 particelle di un AAV-GFP nella vena del pene di topi anestetizzati C57BL6J (5% di isofluranoper l'induzione in una camera stretta e 2,5% di isoflurano attraverso un cono naso durante l'intervento chirurgico) utilizzando una siringa da insulina con un ultra-fine ago 6 millimetri. Questo animale servirà come controllo positivo di far circolare le particelle AAV.
  2. Campione di sangue dalla coda di topo prima dell'iniezione e 3 ore, 24 ore, 2 giorni e 3 giorni dopo l'iniezione intravitreale ShH10 o dopo l'iniezione intrapenile (Figura 1). Circa il 10-20 microlitri è raccolto in tubi eparina. Sacrificio topi da CO 2 inalazione dopo il completamento della procedura.
  3. Estratto DNA genomico da campioni di sangue con il kit di estrazione di vostra scelta.
  4. Eseguire PCR amplificazione del DNA genomico. Per questo protocollo utilizzare la seguente coppia di primer: GFP, senso 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', antisenso 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Il seguente programma PCR è stata effettuata: 95 ° C 2 min (1 ciclo); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 cicli); 72 ° C 5 min (1 ciclo);4 ° C in attesa.

5. Opzionale Evans Metodo Blu

NOTA: quantificare permeabilità vascolare misurando fuoriuscita di albumina dai vasi sanguigni nella retina con il metodo blu Evans 10.

  1. Preparare Evans blu colorante per dissoluzione in una soluzione salina normale (6 mg / ml), sonicazione per 5 minuti in un bagno ad ultrasuoni, e filtrazione attraverso un filtro 5 micron.
  2. Anestetizzare topi C57BL6J (isoflurano inalazione, vedere il punto 4.1), controllare la perdita del riflesso di raddrizzamento, il riflesso di ritiro e la risposta coda pizzico indica una corretta anestesia, e iniettare Evans blu (45 mg / kg), attraverso la vena del pene (Figura 1). Verificare che le zampe, il muso e le orecchie di topi diventano chiaramente blu dopo l'iniezione blu Evans, confermando l'assorbimento e la distribuzione del colorante.
  3. Anestetizzare topi C57BL6J 3 ore dopo l'iniezione del colorante con ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verifica la perdita di righting reflex indicando una corretta anestesia. Esempio intracardiaca circa 500 ml di sangue in tubi eparina e nei profumi topi per 2 min attraverso il ventricolo sinistro con un tampone citrato (0,05 M, pH 3,5 e sciogliere 7,8 g di acido citrico e 3,8 g di citrato di sodio in 1 L di acqua distillata) preriscaldata a 37 ° C per evitare vasocostrizione. I topi sono sacrificati tramite perfusione.
  4. Dopo la perfusione, enucleate e con attenzione sezionare entrambi gli occhi sotto un microscopio operatorio per raccogliere le retine (vedi Sezione 3.2). Retine secco in un evaporatore centrifuga durante la notte, pesano, ed estrarre il colorante blu Evans incubando retine con 100 ml di formammide per 18 ore a 65 ° C con agitazione (100 xg). Campioni Centrifuga retina a 30K tubi filtranti omega a 20,798.5 xg per 2 ore a 4 ° C e campioni di sangue centrifugare a 20,798.5 xg per 15 min a 4 ° C.
  5. Usare entrambe surnatanti per misurare l'assorbanza. Determinare l'assorbanza di ciascun campione sottraendo il massimo assorbanza for Evans blu a 620 nm al minimo assorbanza a 740 nm. Calcola Evans concentrazione blu nel plasma e della retina di una curva standard di Evans blu in formammide. Esprimere BRB permeabilità in microlitro di Evans blu per grammo di retina secca per ora (ml di plasma / g retinica peso secco / hr).

6. Facoltativo Fluoresceina angiografia

NOTA: Perdita dai vasi sanguigni della retina nei topi può essere visualizzato mediante iniezione intraperitoneale di fluoresceina sodica.

  1. Anestetizzare topi C57BL6J (isoflurano inalazione, vedere il punto 4.1) e dilatare gli alunni con collirio (neosynephrine e mydriaticum). Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  2. Iniettare intraperitoneale 0,01-0,02 ml 10% fluoresceina sodica in 0,1 ml di soluzione fisiologica sterile per fluorangiografia.
  3. Raccogliere le immagini di entrambi gli occhi dopo l'iniezione utilizzando una telecamera fundus dell'occhio. Sacrificio topi da CO 2 inalazione dopo la proprocedura.
    NOTA: 20 sec sono necessari per i vasi retinici a diventare visibile su angiografia. Le immagini devono essere catturato tra 3-10 min massimo dopo l'iniezione di fluorescina. I punti di fuga (se presenti) sono osservabili dopo 2.5 min. Al più tardi momenti la qualità dell'immagine è perso a causa di fluoresceina sodica diffusione nel vitreo, quindi solo immagini poco ottenuti dopo sono utilizzati per l'analisi.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Probabilmente incrementata trasduzione retinica Müller cellule gliali utilizzando ShH10 se il modello animale mostra perturbazioni nella struttura del ILM (Figura 2A - B). Ad esempio, abbiamo dimostrato che, in assenza di DP71, obiettivi ShH10 particolare, ma in modo più efficiente Müller cellule gliali di iniezione intravitreale, indicando un aumento della permeabilità della ILM in questa linea di topi rispetto ai topi wild-type 16 (Figura 2C - F).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La BRB regola lo scambio di molecole tra sangue e retina. La sua composizione è associata a diverse malattie come la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Abbiamo recentemente dimostrato che in un topo distrofina knock-out, che visualizza permeabile BRB, la retina diventa più permissiva di consegna del gene mediato da vettori virali adeno-associati (AAV). Tuttavia, nonostante BRB particelle permeabilità AAV iniettato intraoculare rimanere confinata al compartimento oculare in questo...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo la piattaforma di imaging dell'Institut de la Vision. Ringraziamo l'Associazione Francese per la Distrofia Muscolare (AFM) per una borsa di dottorato a O.V. e Allergan INC. Questo lavoro svolto nell'ambito del LABEX LIFESENSES [riferimento ANR-10-LABX-65] è stato sostenuto da fondi statali francesi gestiti dall'ANR. Ringraziamo Peggy Barbe e Mélissa Desrosiers per l'assistenza tecnica nella preparazione dell'AAV. Siamo grati a Stéphane Fouquet per l'eccellente assistenza tecnica nella microscopia confocale e per il suo contributo esperto nell'interpretazione dei risultati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
C57BL6J topi ceppoJANVIER LABS topi
Ketamina 500Virbac Franceanestetico
Xilazina Rompun 2%Bayer Healthcareanestetico
Neosynephrine 5% FaureEurophtadilatante
Mydriaticum 0,5%Theadilatante
SterdexNovartisresina per
inclusione di CryomatrixThermo Scientific6769006
Vetrini di adesione Superfrost PlusVetrini10143352Thermo Scientific
anti-lamininaSigmaL9393anticorpo
anti-rodopsina 4D2MilliporeMABN15anticorpo
anti-glutammina sintetasi clone GS-6Anticorpo MilliporeMAB302
Anticorpo anti-gliale, proteina acida fibrillare glialeanticorpo Dako334
PNA, lectinasondaInvitrogenL32459
anticorpi secondari coniugati al fluor, anticorpo Invitrogen
, reagente Fluorsave,terreno di montaggioCalbiochem, 345789
kit QIAmp DNA Micro KitQIAGEN56304
GoTaq DNA polimerasiPromegaM3001
Evans Colorante bluSigmaE2129colorante
5 µ m filtroMillipore
Citrato di sodioSigmaS1804
Acido citricoSigmaC1909-2.5KG
Formamide spettrofotometricaSigma295876-2L
FluoresceinaSigmaF2456colorante
Micron IIIPhoenix Research LabsIl sistema di microscopia basato su una fotocamera a colori a 3 CCD, un frame grabber e un software standard consente ai ricercatori di visualizzare le retine dei topi.
Siringhe da insulinaTerumoSS30M3109
siringa 10 µ l HamiltonDutscher74487Seringue 1701
Ago RN G33, 25 mm, PST 2Fisher Scientific11530332Iniezione intravitreale
UltraMicroPump UMP3World Precision InstrumentsUMP3Iniettore versatile utilizza microsiringhe per erogare volumi di picolitri
UltraMicroPump (UMP3) (uno) con controller SYS-Micro4UMP3-1Controller
Lente d'ingrandimento binoculare SZ76ADVILABADV-76B2Zoom 0,66 x 5 x LED con supporto epi e dia / Dissezione retine
Forbici a molla dritte - 8,5 cmBionic France S.a.r.l15003-08Dissezione retine
forbice Vanna curva15004-08
Pince Dumont 511254-20
Veriti 96-Well Thermal CyclerLife tecnologie4375786Termociclatore
Pulitore ad ultrasuoniForniture da laboratorioG1125P1T
Nanosep 30k tubi omegaVWR
SpeedvacFisher ScientificSC 110 A
SpettrofluorimetroTECANinfinito M1000
antinfiammatoria per , , , , Alexa, , digitale

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
  2. Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
  3. Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
  4. Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
  5. Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
  6. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  7. Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
  8. Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
  9. Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
  10. Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
  11. Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
  12. Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
  13. Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
  14. Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
  15. Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467(2009).
  16. Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
  17. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
  18. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
  19. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348(2011).
  20. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  21. Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313(2007).
  22. Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
  23. Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329(2009).
  24. Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Barriera emato retinicamembrana limitante internacellule di M llerAAV5ShH10iniezione intravitrealemicroscopia confocaleimmunoistochimica

Articoli correlati