Viene presentato un protocollo per accoppiare covalentemente una grande varietà di singole molecole su una punta AFM. Vengono fornite procedure ed esempi per determinare la forza di adesione e l'energia libera di queste molecole su supporti solidi e bio-interfacce.
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Articolo metodologico
Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Spettroscopia a forza atomica è uno strumento ideale per lo studio di molecole a superfici e interfacce. Un protocollo sperimentale per accoppiare una grande varietà di singole molecole covalentemente su una punta AFM è presentato. Allo stesso tempo, la punta AFM viene passivato per evitare interazioni aspecifiche tra la punta e il substrato, che è un prerequisito per studiare singole molecole allegate alla punta AFM. Le analisi per determinare la forza di adesione, la lunghezza di adesione, e l'energia libera di queste molecole su superfici solide e bio-interfacce sono poco presentati e sono forniti riferimenti esterni per ulteriori letture. Molecole esempio sono le polytyrosine poli (aminoacidi), il polimero trapianto PI- g -PS e fosfolipidi PAPA (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina). Queste molecole sono desorbiti da superfici diverse come CH 3 -SAMs, idrogeno terminato diamante e supportati doppi strati lipidici in varie condizioni di solvente. Infine, lavantaggi di forza spettroscopiche esperimenti di singola molecola sono discussi tra cui mezzi per decidere se veramente una singola molecola è stato studiato nell'esperimento.
Introduzione
Negli ultimi 30 anni, microscopia a forza atomica (AFM) è risultato essere una tecnica di imaging prezioso per studiare biologici 1,2 e 3 sintetici materiali e superfici in quanto fornisce una risoluzione spaziale molecolare in tre dimensioni e può essere azionato in vari solventi ambienti. Inoltre, la spettroscopia di forza molecola AFM-single (SMFS) permette di misurare le forze che vanno dal PN μN regime e ha dato una visibilità senza precedenti, ad esempio in proteine pieghevole 4,5, polimero fisica 6-8, e singola interazione molecola-superficie 9 - 12 .La logica studiare singole molecole, piuttosto che un ....
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Protocollo
NOTA: Vedi figura 2 per una panoramica del flusso di processo che comprende la preparazione, i passaggi di acquisizione dati e di analisi dei dati.
1. reagente Setup
NOTA: Tutte le sostanze chimiche devono essere maneggiati con cura, e quindi un camice da laboratorio, devono essere utilizzati guanti e occhiali protettivi. Tutte le operazioni devono essere eseguite in una cappa di laboratorio. In particolare, guanti speciali devono essere indossati in caso di uso di cloroformio.
- Utilizzare prodotti chimici a basso contenuto d'acqua, come il cloroformio secca rapidamente e magazzi....
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Risultati
Nel seguito, i risultati sopra descritti esempio molecole, cioè la polytyrosine polimeri poli (amminoacido), il polimero graft PI- g -PS e PAPA fosfolipide, sono presentati. Primo per ogni esempio, sperimentare dettagli specifici per l'acquisizione dei dati e la preparazione dei dati sono forniti. Poi, vengono visualizzati i risultati esemplari per esperimenti in cui queste molecole sono state desorbita da superfici diverse (CH 3 -SAMs, idrogeno terminato diamanti e doppi strati lipidici). Determ.......
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Discussione
Nel corso degli ultimi decenni, gli esperimenti di singola molecola hanno fornito intuizioni senza precedenti nei meccanismi molecolari e si è rivelato essere un approccio inestimabile nella vita della scienza e non solo. Per ottenere buone statistiche e significative da esperimenti SMF, idealmente una stessa molecola viene utilizzato su tutto il corso dell'esperimento. In contrasto con esperimenti con insiemi di molecole, esperimenti SMFS sono in grado di rilevare eventi rari e stati molecolari nascosti. Un altro v.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il DFG (Hu 997/2-2) per il sostegno finanziario. FS riconosce la Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr è stato supportato dall'Elitenetzwerk Bayern nell'ambito del programma di dottorato Scienza dei materiali delle interfacce complesse. SKi ringrazia l'SFB 863 per il sostegno finanziario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali | |||
| Hellmanex III concentrato liquido alcalino (soluzione detergente) | Hellma | ||
| RCA (acqua ultrapura, perossido di idrogeno (35%), ammoniaca (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Reagente Sigma | ||
| Vectabond / APTES (3-Aminopropil)trietossisilano | Vectorlabs | ||
| Acetone secco (< 50 ppm H< sub>2O) | Cloroformio secco Sigma | ||
| (> 99,9%) | Sigma | ||
| Trietilammina | Sigma | ||
| Acqua ultrapura | Biochrom, Germania | ||
| Tetraborato di sodio (> 99,5%) | Biochrom, Germania | ||
| Acido borico | Biochrom, Germania | ||
| Monofunzionale &alfa;-metossi-ω-NHS PEG, 5 kDa, " metil-PEG-NHS" | Rapp, Germania | ||
| Eterobifunzionale &alfa;,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, " NHS-PEG-NHS" | Rapp, Germania | ||
| Eterobifunzionale &alfa;-maleimidoesanoico- ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS" | Rapp, Germania | ||
| Molecola sonda (polimero, lipidi, ecc.) | |||
| Equipment | |||
| Quantità sufficiente di piatti di cristallizzazione in vetro con beccuccio (10 ml), piastre di Petri in vetro (500 µ l) e coperchi in vetro | VWR International GmbH, Germania | ||
| [header] | |||
| Forno da laboratorio modello UF30 | Memmert, Germania | ||
| Sonicatore a temperatura controllata | VWR International GmbH, Germania | ||
| Sistema al plasma "Femto", 100 W | Diener, Germania | ||
| Una siringa di vetro separata per ogni solvente organico | VWR International GmbH, Germania | ||
| Vortex miscelatore | VWR International GmbH, Germania | ||
| Provette per microcentrifuga (0,5 ml o 1,5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 &; l, 50-200 µ l e 100-1.000 µ l | Eppendorf | ||
| AFM con cella a fluido a temperatura controllata (es. MFP-3D con BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Cantilever in SiN morbido, tipicamente realizzato in nitruro di silicio (SiN) (costante della molla inferiore a 100 pN/nm, ad es. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
Riferimenti
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
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Ristampe e permessi
