Questo articolo descrive un metodo per creare una lesione meccanica del vaso negli embrioni di zebrafish. Questo modello di lesione fornisce una piattaforma per lo studio dell'emostasi, dell'infiammazione correlata alla lesione e della guarigione delle ferite in un organismo ideale per la microscopia in tempo reale.
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Articolo metodologico
Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli embrioni di pesce zebra (Danio rerio) hanno dimostrato di essere un modello potente per lo studio di una varietà di processi di sviluppo e malattia. Lo sviluppo esterno e la trasparenza ottica rendono questi embrioni particolarmente suscettibili alla microscopia e sono disponibili numerose linee transgeniche che marcano specifici tipi di cellule con proteine fluorescenti, rendendo l'embrione di zebrafish un sistema ideale per visualizzare l'interazione di cellule vascolari, ematopoietiche e di altro tipo durante la lesione e la riparazione in vivo. La genetica diretta e inversa nel pesce zebra è ben sviluppata ed è possibile la manipolazione farmacologica. Descriviamo un modello di lesione vascolare meccanica utilizzando tecniche di micromanipolazione che sfrutta molte di queste caratteristiche per studiare le risposte alla lesione vascolare, tra cui l'emostasi e la riparazione dei vasi sanguigni. Utilizzando una combinazione di microscopia video e timelapse, dimostriamo che questo metodo di lesione vascolare si traduce in risposte misurabili e riproducibili durante l'emostasi e la riparazione delle ferite. Questo metodo fornisce un sistema per studiare in dettaglio le lesioni vascolari e la riparazione in un modello animale intero.
Introduzione
I pesci zebra sono stati ampiamente utilizzati per studiare una varietà di argomenti in biologia vascolare, tra cui lo sviluppo vascolare, l'angiogenesi e lo sviluppo ematopoietico e la patologia1-3. Gli embrioni sviluppano una circolazione funzionale, così come i leucociti e altri componenti del sistema immunitario innato entro 1 giorno dopo la fecondazione (dpf) 1,4,5. La conservazione della risposta infiammatoria e leucocitaria alle lesioni ha reso l'embrione di zebrafish un modello informativo per diversi processi infiammatori come l'infezione tubercolare, l'enterocolite e la rigenerazione dei tessuti6-9. Gli embrioni di zebrafish sono stati utilizzati per studiare l'infiammazione correlata a lesioni, in particolare nel contesto della ferita epiteliale e della risposta dei neutrofili10,11. La lesione all'embrione provoca una risposta cellulare altamente conservata da parte delle cellule nel sito della lesione e delle cellule immunitarie innate reclutate per rispondere alla lesione e regolarne la risoluzione11,12. Altri modelli di lesione hanno utilizzato impulsi laser focalizzati per localizzare spazialmente la lesione a specifici tipi di cellule, tra cui neuroni, cellule muscolari e cardiomiociti13-15.
Gli embrioni di pesce zebra sono stati utilizzati come modello per studiare l'emostasi e la trombosi in condizioni di manipolazione farmacologica e genetica, utilizzando sia la formazione di trombi meccanica che quella indotta dal laser16-19. I componenti della cascata della coagulazione sembrano essere ben conservati e i transgenici hanno permesso studi dettagliati sulla deposizione di trombociti e fibrine nel sito di coagulazione17,20,21. La procedura presentata in questo articolo integra questi metodi fornendo un sistema per lo studio delle lesioni meccaniche dei vasi con conseguente rottura dei vasi, formazione e risoluzione di trombi e riparazione dei vasi.
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Protocollo
NOTA: Le procedure utilizzando zebrafish sono stati approvati dalla Institutional Animal Care del UCSF and Use Committee.
1. Preparazione di strumenti
- Inserire pin minuzia in un supporto del perno e bloccare il perno.
- Utilizzando pinze punta fine, piegare attentamente la punta del perno di creare un leggero uncino.
- Per la manipolazione e la stabilizzazione dell'embrione durante lesioni, piegate la fine di un 28 calibro ½ pollice ago montato su una siringa da insulina con pinze ad ago.
2. Preparazione di embrioni di zebrafish per Injury
- Impostare zebrafish coppie nidificanti e raccogliere le uova in acqua uovo (60ug / ml sali acquario), come indicato in precedenza 22.
- Aggiungere 0,003% N-feniltiourea (PTU) all'acqua uovo quando gli embrioni sono circa 8 ore dopo la fecondazione (HPF) per impedire melanizzazione.
- Dechorionate due giorni dopo la fecondazione (dpf) embrioni prima dell'esperimento con una pinza a punta fine.
Nota: Gli embrioni possono essere feriti in qualsiasi momento dopo l'inizio circolazione. I dati qui presentati sono per 2 dpf embrioni, ma la tecnica è stata applicata con successo in embrioni fino a 5 dpf. - Anestetizzare gli embrioni con il 0,02% tamponato acido 3-aminobenzoico (Tricaine) circa 10 minuti prima di manipolazioni.
3. Vessel meccanica Injury di embrioni
- Trasferimento embrioni anestetizzati a una diapositiva depressione su uno stereomicroscopio dissezione utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Usando il lato corto piatto dell'ago della siringa per manipolare l'embrione con la mano dominante, posizionare l'embrione su un lato con la superficie ventrale rivolto verso l'ago.
- Posizionare il perno minuzia con la punta puntato direttamente contro la superficie ventrale del posteriore pesce all'apertura urogenitale. Posizionare il perno minuzia con una leggera angolazione tale che l'estremità ricurva è in grado di penetrare attraverso la periderm direttamente nella vena caudale (Figura 1 </ Strong>).
- Utilizzando l'ago della siringa per manipolare l'embrione, perforare la vena caudale con il perno minutia toccando l'embrione nel perno di agganciare leggermente il perno nella vena.
- Utilizzando l'ago della siringa, estrarre l'embrione dal perno minuzia per creare un piccolo strappo nel recipiente.
NOTA: Una lesione di successo si tradurrà in sanguinamento immediato dalla vena.
4. Analisi di Emostasi
- Scegliere solo embrioni con visibilmente circolanti globuli per questa procedura.
- Preparare per iniziare il temporizzatore non appena il perno minutia è tirato dal recipiente.
- Avviare il temporizzatore non appena la perdita di sangue può essere visualizzata dalla ferita. Quando la perdita di sangue dalla ferita cessa, fermare il timer e registrare il tempo totale come tempo di sanguinamento. Se la coagulazione è inibita, registrare il tempo quando non ci sono più visibilmente circolanti globuli.
5. Analisi di guarigione delle ferite
- Trasferimento posanimali t-lesioni su piatti di imaging con fondo di vetro per la microscopia.
- Rimuovere la maggior parte dell'acqua uovo.
- Coprire gli embrioni a 0,3-1,2% basso punto di fusione agarosio disciolti in acqua uovo, riscaldata a tra 42 e 45 ° C e integrati con il 0,02% Tricaine.
- Posizione embrioni sui loro lati con pinze.
- Dopo l'agarosio si raffredda, riempire il piatto con il 0,02% Tricaine in acqua uovo.
- Acquisire le immagini utilizzando chiaro, epifluorescenza, o microscopia confocale.
- Rimuovere embrione dal agarosio con pinze e trasferire di nuovo in acqua uovo.
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Risultati
Lesioni vaso meccanica è stata eseguita su 2 dpf embrioni (Figura 2A - C). Risultati lesioni in una rapida ed affidabile risposta coagulazione misurata come tempo per la cessazione di sanguinamento (Figura 2D). Per determinare se le differenze nella risposta della coagulazione possono essere misurati, l'irudina anticoagulante è stato somministrato alle embrioni per iniezione nel condotto di Cuvier immediatamente prima ferendo (5-10 nl di 1 unità per ml irudina disci...
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Discussione
Zebrafish sono stati utilizzati con successo come modello per i diversi tipi di ferite comprese lesioni laser 13-15, indotta da laser trombosi 16, e ferendo 10 epiteliale. Descriviamo un metodo di ferimento meccanica che è semplice da eseguire e produce una lesione controllata in un modello in vivo che è altamente suscettibile di microscopia in tempo reale. Risultati lesioni in una risposta rapida emostatico e misurabile e un programma di riparazione ferita riproducibile che può...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i dottori Stephen Wilson e Lisa Wilsbacher per le utili discussioni. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da NIH HL054737.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Diametro della punta 0,0125 mm, diametro dell'asta 0,1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Ropeps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preriscaldato a 42 º C |
| N-Feniltiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Acido 3-amminobenzoico (Tricaina) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Piastre di imaging con fondo in vetro | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Microscopio da dissezione | Olympus | SZH10 | |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium sali Instant | Ocean | ||
| Siringa da insulina con ago da 28,5 G | Becton Dickinson |
Riferimenti
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