Generazione di Murine Cardiac pacemaker aggregati di cellule Sulla base ES-Cell-programmazione in combinazione con MYH6-Promoter-Selection

Sommario

Questo protocollo descrive come produrre funzionale del seno tessuto nodale da cellule murine staminali pluripotenti (PSC). T-box3 (TBX3) sovraespressione più cardiaca miosina pesante catena (MYH6) selezione antibiotica promoter porta a aggregati altamente puri di cellule pacemaker. Questi "indotte-seno-atriale-corpi" ("iSABs") contengono più di 80% di cellule pacemaker, mostrano fortemente aumentato i tassi di battere e sono in grado di camminare miocardio ex vivo.

Abstract

Trattamento della "sindrome del seno malato" si basa su pacemaker artificiali. Questi portano pericoli come guasto della batteria e le infezioni. Inoltre, mancano di ormone reattività e la procedura generale è costosa. "Pacemaker biologico" generati dal PSC possono diventare un'alternativa, ma il contenuto tipico di cellule pacemaker a corpi embrionali (EBS) è estremamente bassa. Il protocollo descritto combina "programmazione in avanti" del PSC murini tramite il nodo del seno induttore TBX3 con la selezione antibiotica a base MYH6-promotore. Questo produce aggregati cardiomiociti coerenti di> 80% cellule pacemaker fisiologicamente funzionali. Questi "indotte-seno-atriale-corpi" ("iSABs") sono spontaneamente contraenti a frequenze ancora non raggiunte (400-500 bpm) corrispondenti alle cellule nodali isolate da cuori di topo e sono in grado di camminare miocardio murine ex vivo. Utilizzando il protocollo descritto seno altamente purosingole cellule nodali possono essere generati, che può essere ad esempio utilizzato per il test della droga in vitro. Inoltre, i iSABs generati in base a questo protocollo può diventare un passo fondamentale verso l'ingegneria dei tessuti del cuore.

Introduzione

Il termine "sindrome del seno malato" riassume molteplici malattie che portano al deterioramento del sistema di pacemaker cardiaco. Si compone di patologico, bradicardia sintomatica sinusale, blocco seno-atriale, arresto sinusale e la sindrome di tachicardia-bradicardia. In tal modo, una "sindrome del nodo del seno" è spesso accompagnata da malattie cardiache generali, come cardiopatia ischemica, cardiomiopatia o miocardite. Attualmente, gli approcci terapeutici sono basati sul impianto di pacemaker elettrici. Tuttavia, questo va insieme a una serie di rischi come infezioni e guasto della batteria. Nel complesso, l'incidenza di complicazioni è ancora molto elevato in pazienti che hanno impiantato un pacemaker. Inoltre, al contrario di pacemaker endogena, questi dispositivi non rispondono alla stimolazione ormonale.

Un futuro alternativa può contare sulla disponibilità di "pacemaker biologico" per la quale PSC potrebbero servirecome fonte cellulare adeguato e che sarebbe anche di grande valore per i test anti-droga in vitro. Eppure, un grave problema sta nella rarissima comparsa di cellule nodali del seno entro corpi embrionali (EBS) - questo genere non supera ~ 0.5% ^1.

In precedenza, è stato dimostrato che "la programmazione in avanti" verso specifici sottotipi cardiomiociti è fattibile tramite la sovraespressione di diversi primi fattori di trascrizione cardiovascolari, come fattore 1 (MesP1) specifici-posteriore-mesoderma e NK2 trascrizione correlati, locus 5 (Nkx2.5) ^{2, 3.} Per dimensioni e la funzione del nodo senoatriale (SAN) normale, la T-box fattore di trascrizione TBX3 è cruciale, che ha dimostrato di avvio del programma di gene pacemaker e controllare differenziazione della SAN ^4. Mentre questo migliorato l'aspetto delle cellule pacemaker funzionali, il contenuto ancora non ha superato il 40% ~ all'interno dell'intera popolazione di cellule cardiomyocytic.

Pertanto, una selezione di antibiotico passo basato ulteriore MYH6-promoter ⁵ è stato introdotto da noi. Questo conduce infine a aggregati cardiomiociti ancora inosservate ("indotte corpi seno-atriale," iSABs ") che presentano altamente aumento delle frequenze battendo (> 400 bpm) in vitro, per la prima volta si avvicinano a quelli di un cuore murino e paragonabile a coltivati ​​in vitro seno cellule nodali isolate da un cuore murino ^6. Sotto l'amministrazione Isoprenalina anche frequenze battendo di 550 bpm vengono raggiunti. In particolare, iSABs consistono in oltre l'80% funzionali cellule nodali come evidente dalla vasta fisiologico analisi ^7. Recentemente, diversi approcci per la generazione di cellule del seno nodali utilizzando riprogrammazione diretta ^19, superficie marcatori ¹⁴ o trattamento farmacologico con piccole molecole ^16,17 sono stati descritti. Tuttavia, nessuno di questi metodi ha portato ad una tale elevata purezza delle cellule pacemaker e battendo frequenze vicine alla murino chearte come osservato in iSABs.

Inoltre, in un ex vivo modello coltivati ​​topo adulto fette ventricolari che hanno perso la loro attività battere spontanea, i iSABs sono in grado di integrare nel tessuto fetta, rimanendo così spontaneamente attivo e robusto stimolazione le fette di cuore a contrazioni ^7. Un protocollo dettagliato per la generazione di questi iSABs è descritto in questo documento.

Protocollo

1. Raccomandazioni Prima di iniziare

1. Non utilizzare PSC contaminati da micoplasma perché non differenziarsi correttamente in cellule del nodo del seno. Test per la contaminazione micoplasma prima di iniziare il protocollo. Fate questo utilizzando un kit PCR per una rapida, rilevamento altamente sensibile di micoplasmi e seguire il protocollo costruttore `.
2. Per ogni piatto Petri (fase 2.3.4), cappotto una 10 cm ² cellule piatto cultura con sterile 7 ml 0,1% di gelatina da acqua fredda pelle di pesce per 1 ora a 37 ° C. Togliere la gelatina e lasciare il piatto asciutto in condizioni sterili in un banco sterile.
3. Prima di avviare il protocollo di differenziazione è necessario un doppio transfettato del mouse stabile ES clone linea cellulare contenente le seguenti caratteristiche: i) costitutiva over-espressione di TBX3 utilizzando un vettore di espressione di mammifero. Ii) La resistenza G418 gene sotto il controllo del promotore ^MYH6-5.
4. Le cellule indifferenziate PSC devono essere co-coltivazioned con cellule feeder irradiate in condizioni standard, come descritto ^1.

2. Differenziazione Procedura

1. Due giorni prima di differenziazione - Togliere PSC da cellule di alimentazione.
   1. Aspirare il mezzo, lavare le cellule con 10 ml di tampone fosfato salino PBS, aggiungere 7 ml di soluzione collagenasi IV e incubare le cellule per 10 min a 37 ° C. Inserire un filtro sterile 40 micron in un tubo da 50 ml.
   2. Risciacquare attentamente le colonie PSC (evitare di rimuovere le cellule feeder) pipettando la soluzione collagenasi su e giù 5 volte.
   3. Trasferire la sospensione cellulare ad un filtro 40 micron, risciacquare il filtro tre volte con 8 ml di PBS. Girare intorno al filtro e metterlo a testa in giù in una capsula di Petri. Rimuovere le colonie di cellule PSC pipettando 10 ml di PBS al fondo del filtro.
   4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare per 5 min a 300 x g.
   5. Rimuovere la PBS, sospendere le cellule in 1 ml Accutase e incubate a 37 ° C per 5 min.
   6. Aggiungere 10 ml di PBS, miscelare la soluzione di cellule pipettando su e giù per 5 volte e centrifugare per 5 min a 300 x g.
   7. Rimuovere la PBS, sospendere le cellule in 10 ml mezzo di coltura e di determinare il numero di cellulare.
   8. Seme 15.000 cellule / cm ² su 75 cm ² beuta filtro e coltivare per 2 giorni a 37 ° C, 5% CO2. Dopo 2 giorni la muffola dovrebbe essere 50-70% confluenti.
2. Giorno 0 - Avvio di Differenziazione
   1. Rimuovere il supporto e lavare le cellule con 10 ml di PBS.
   2. Aspirare il PBS, aggiungere 2 ml Accutase e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. Inserire un filtro sterile 40 micron in un tubo da 50 ml.
   3. Aggiungere 10 ml di PBS, trasferire la sospensione cellulare al filtro 40 micron, risciacquare il filtro mediante aggiunta di 10 ml di PBS e centrifugare il flusso passante per 5 min a 300 x g.
   4. Sospendere le cellule in 10 ml di terreno di differenziamento e determinare il numero di cellule.
   5. Diluire tegli cellula sospensione con terreno di differenziamento ad una concentrazione finale di 20.000 cellule / ml.
   6. Pipettare 20 ml di acqua e 5 ml di soluzione appesi goccia (HD) in una capsula Petri quadratica per evitare l'essiccamento-out del HDs.
      NOTA: Per ogni 24 piastra contenente iSABs così (vedi sezione 2.8.6.4/2.8.7) iniziano con 16 piastre di Petri.
   7. Pipettare fino a 50 ml di sospensione cellulare in un vassoio.
   8. Girare intorno al coperchio della capsula di Petri. Mettere 180 HDs ciascuno contenente 20 ml (400 cellule / HD) sospensione cellulare sul coperchio con una pipetta a 12 canali.
   9. Ruotare delicatamente intorno al coperchio e posizionarlo sulla piastra di Petri.
      NOTA: La velocità di rotazione attorno al coperchio è molto importante. Se il coperchio è girato troppo lento o troppo veloce, la tensione superficiale della sospensione cellulare non è sufficiente a trattenere l'attaccatura cade sul coperchio. Prima di provare a produrre HDs per la prima volta la pratica girando intorno al coperchio con 20 gocce microlitri di media.
   10. Coltivare le cellule per 2 giorni a 37 ° C, 5% CO ₂ per far loro formare EBS.
       NOTA: Posizionare piatto Petri uno riempito con acqua sulla sommità di una pila di 5 piatti Petri. In caso contrario, l'HD nella capsula di Petri superiore si asciugherà.
3. Day 2
   1. Ruotare delicatamente attorno al coperchio del piatto quadratica Petri e trasferire i EBs derivati ​​da due piastre di Petri (360 EBS) in una provetta da 50 ml.
   2. Attendere 10 minuti per consentire la EB si depositano sul fondo della provetta (Non centrifugare EBS).
   3. Aspirare il più media possibile, sospendere le EBs in 10 ml di medio di differenziazione e trasferire la sospensione di una capsula di Petri 10 cm.
4. Giorno cultura 2-6 Suspension
   1. Coltivare EBS in sospensione per 4 giorni a 37 ° C, 5% CO _2, cambiare media dopo 2 giorni.
      NOTA: Anche se la capsula di Petri non è rivestito (al contrario di un piatto di coltura cellulare) EBS spesso attaccare alla superficie. Controllare le capsule di Petri per EBs collegati ogni giorno e, se necessario, scollegare i EBsdalla superficie delicatamente pipettando. Optional: Agitare le piastre di Petri continuamente durante il periodo di coltura in sospensione. Fate attenzione con la velocità dello shaker. EBS non dovrebbero accumularsi nel mezzo, né galleggiare al confine delle piastre di Petri.
5. Giorno 6
   1. Trasferire i EBs da una piastra di Petri di un gelatina rivestite 10 centimetri ² cellule piatto cultura.
6. Day 7-12
   1. Le cellule dovrebbero iniziare a battere dopo 8-12 giorni. Controllare battendo foci di cellule giornaliera al microscopio. Le cellule iniziano a formare uno strato.
   2. Cambiare media giornaliera.
      NOTA: Dopo aver cambiato media, le cellule richiedono 3-4 ore per recuperare e per iniziare a battere di nuovo.
7. Giorno 12-15 Selezione delle cellule nodali del seno.
   1. Tre giorni dopo che le cellule hanno iniziato battendo (intorno al giorno 12-15), aspirare il terreno e pipetta 10 ml di media differenziazione fresco contenenti 400 mg / ml G418 alle cellule.
8. Quattro giorni dopo l'inizio della selezione dissocio lo strato di cellule.
   NOTA: E 'possibile che lo strato di cella è già staccato dalla superficie.
   1. Rimuovere accuratamente il mezzo senza aspirare lo strato di cellule.
   2. Aggiungere 10 ml di PBS e rimuovere con attenzione il PBS senza aspirare lo strato di cellule.
   3. Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi IV, trasferire le cellule in una provetta da 50 ml e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
   4. Mescolare energicamente la sospensione pipettando su e giù 10 volte e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. Deve avvenire Una sospensione di piccoli gruppi. Se ci sono ancora enormi parti del livello di sinistra, quindi ripetere il passaggio 2.8.4 altre due volte.
   5. Aggiungere 20 ml di PBS e centrifugare per 10 min a 300 x g.
   6. Aspirare accuratamente il PBS.
      NOTA: Se iSABs devono essere generati procedere con passo 2.8.7. Se Isab seno derivato nodali singole cellule devono essere generati andare avanti con il punto 2.9.
   7. Sospendere le cellulein 12 ml di mezzo di differenziazione contenente 400 mg / ml G418 e seminare su 6 pozzi rivestiti di gelatina 24 pozzi (2 ml / pozzetto).
9. Generazione di singola cellula nodale.
   1. Sospendere le cellule dal punto 2.8.6 in 5 ml Accutase e incubare a 37 ° C per 5 minuti.
   2. Mescolare energicamente la sospensione pipettando su e giù 10 volte e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
   3. Aggiungere 20 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 x g.
   4. Sospendere le cellule in 12 ml di mezzo di differenziazione contenente 400 mg / ml G418 e seminare su 6 pozzi di una gelatina rivestite 24 pozzi (2 ml / pozzetto).
10. Day 2 dopo dissociazione, aspirare il terreno e lavare le cellule tre volte con PBS. Aggiungere 1 ml di media differenziazione / bene.
11. Day 4-8 dopo dissociazione, cambiare Medio ogni 2 ^° giorno. Il giorno 10, dopo l'uso di dissociazione iSABs o ISAB seno derivati ​​nodale celle singole sono disponibili per ulteriori analisi.

Risultati

Il protocollo descritto consente la generazione di iSABs con una frequenza pestaggio di circa 450 bpm dal PSC (mostrati nel film) che si trova vicino alla frequenza battito del cuore del mouse. Dopo dissociazione iSABs (step 2.8.8) le osservati singole cellule mostrano la forma tipica di cellule del nodo del seno (cellule fusiformi e ragno) come mostrato in Figura 1. Queste cellule proteine ​​altamente espresso che sono noti per essere essenziali per la funzione del nodo del seno, come iperpolarizzazion...

Discussione

La capacità di produrre staminali cellulari derivate cellule pacemaker cardiaco può consentire la ricostituzione del corretto ritmo cardiaco nel senso di "pacemaker biologici". Allo stesso modo, droga test in vitro potranno beneficiare di loro disponibilità. PSC può dare origine a qualsiasi tipo di cellula del corpo dei mammiferi tra cui cardiomiociti con proprietà delle cellule pacemaker ^{8,9,10,11,12,13.} Tuttavia, in genere le popolazioni di cellule all'interno di "corpi embrionali" s...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreno liquido Iscove con glutammina stabile	Biochrom AG	FG 0465
DMEM terreno liquido senza Na-piruvato, con glutammina stabile	Biochrom AG	FG 0435
CLS tipo IV, CLS IV	Biochrom AG	C4-22
Aminoacidi non essenziali	Biochrom AG	K 0293
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
Piruvato di sodio (100 mM)	Biochrom AG	L 0473
G 418-BC liquido (soluzione pronta all'uso), sterile	Biochrom AG	A 2912
Serbatoio reagente PP per pip. multicanale 60ml, sterile	Marca	703409
Accutase	eBioscience,Inc.	00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, pipetta elettronica	Eppendorf	4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µ m	Falcon	352340
Penicillina/Streptomicina	GE Healthcare	P11-010
Piastre di Petri	Greiner BioOne	663102
DPBS senza Ca e Mg	PAN-Biotech	P04-36500
Siero fetale bovino	PAN-Biotech	P30-3302
Fattore inibitorio della leucemia	Phoenix Europe GmbH	LIF-250
Piastre di Petri quadratiche	Roth	PX67.1
Gelatina da pelle di pesce d'acqua fredda	SigmaAldrich	G7765
2-Mercaptoetanolo	SigmaAldrich	M3148
1-Tioglicerolo	SigmaAldrich	M6145
Piastre per coltura tissutale	TPP	93100
Pallone per coltura tissutale	TPP	90076
Piastre per test per colture tissutali (24 pozzetti)	TPP	92424