Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per la co-coltura in tre dimensioni, che è utile per studiare le interazioni multicellulari e la modulazione dipendente dalla matrice extracellulare del comportamento delle cellule tumorali. In questo modello sperimentale, le cellule tumorali vengono coltivate su gel di collagene incorporati con fibroblasti umani associati al cancro.

Abstract

La progressione del cancro (inizio, crescita, invasione e metastasi) avviene attraverso interazioni tra le cellule maligne e le cellule stromali tumorali circostanti. Il microambiente tumorale è costituito da una varietà di tipi di cellule, come fibroblasti, cellule immunitarie, cellule endoteliali vascolari, periciti e cellule derivate dal midollo osseo, incorporate nella matrice extracellulare (ECM). I fibroblasti associati al cancro (CAF) hanno un ruolo pro-tumorigenico attraverso la secrezione di fattori solubili, l'angiogenesi e il rimodellamento della ECM. I modelli sperimentali per la sopravvivenza, la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali si sono basati principalmente su colture di tessuti bidimensionali monocellulari e monostrato o su saggi della camera di Boyden. Tuttavia, questi esperimenti non riflettono esattamente le condizioni fisiologiche o patologiche in un organo malato. Per ottenere una migliore comprensione delle interazioni tra tumore, stroma o matrice tumorale, le colture multicellulari e tridimensionali forniscono strumenti più potenti per studiare la comunicazione intercellulare e la modulazione dipendente dalla ECM del comportamento delle cellule tumorali. Come piattaforma per questo tipo di studio, presentiamo un modello sperimentale in cui le cellule tumorali vengono coltivate su gel di collagene incorporati con colture primarie di CAF.

Introduzione

Il tessuto tumorale può essere percepito come un tipo di organo, che si evolve attraverso strette interazioni tra il cancro e il microambiente stromale tumorale, composto da fibroblasti associati al cancro (CAF), cellule immunitarie, vasi tumorali e matrice extracellulare (ECM). I CAF sono la principale fonte di fattori solubili (citochine, fattori di crescita e chemochine) che esercitano effetti mitogeni, pro-migratori e pro-invasivi sulle cellule tumorali. Stimolano anche la formazione dei vasi tumorali e reclutano cellule precursori, come le cellule derivate dal midollo osseo (BMDC). I CAF attivati sono coinvolti nella produzione e nel rimodellamento della MEC, promuovendo così la crescita e la diffusione delle cellule tumorali¹. I CAF forniscono anche una nicchia che facilita la colonizzazione e la metastasi delle cellule tumorali e sono in grado di conferire fenotipi di cellule staminali alle cellule tumorali vicine. Le osservazioni patologiche suggeriscono che le reazioni stromale o le alterazioni fibrotiche nei tessuti tumorali sono indicative di una prognosi infausta. Studi recenti hanno anche dimostrato che le caratteristiche stromali del tumore, come la firma genica, possono predire la prognosi del paziente. Inoltre, i fattori derivati dai CAF possono modulare la sensibilità alla chemioterapia, evidenziando il ruolo dei CAF nel determinare la sensibilità e la resistenza ai farmaci².

Poiché i CAF svolgono un ruolo multiforme nella promozione della progressione tumorale attraverso vie di segnalazione che mediano le interazioni tra CAF e diversi tipi di cellule all'interno del microambiente tumorale, hanno attirato una crescente attenzione come nuovi bersagli per le terapie antitumorali. L'eterogeneità delle popolazioni cellulari all'interno del microambiente tumorale rappresenta un ostacolo per il targeting dei CAF. Sono stati proposti diversi marcatori per i CAF, come l'actina muscolare liscia α (α-SMA), la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP) e il proten-1 specifico dei fibroblasti (FSP-1: chiamato anche S100A4); tuttavia, questi marcatori molecolari non sono specifici per distinguere i CAF da altre cellule presenti nei tessuti non cancerosi³. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per ottenere maggiori conoscenze sulle proprietà specifiche dei CAF. A tal fine, è istruttivo caratterizzare i CAF primari in coltura rispetto ai fibroblasti normali abbinati al paziente.

Recentemente, sono state riportate analisi su CAF derivati da pazienti in diversi tipi di cancro, rivelando modelli di espressione genica e comportamenti cellulari unici rispetto ai fibroblasti derivati da tessuti non cancerosi. Utilizzando CAF isolati da tessuti di cancro del polmone umano, abbiamo sviluppato un metodo di co-coltura tridimensionale, che ci ha permesso di valutare le proprietà dei CAF polmonari. In questo modello, abbiamo studiato gli effetti dei CAF sull'invasione, la proliferazione e la contrazione del gel di collagene delle cellule tumorali del polmone, che hanno ricapitolato sperimentalmente i ruoli di promozione del tumore dei CAF polmonari⁴.

Protocollo

NOTA: Questo studio è stato approvato dai comitati etici appropriati.

1. Cultura primario umano Polmone fibroblasti

1. Raccolta di tessuto polmonare:
   1. Ottenere campioni di tessuto polmonare umano dalla sala operatoria chirurgica direttamente. Raccogliere circa 1 cm ³ isolati da tessuto polmonare cancerose e non cancerose, con il campione non cancerose raccolto più lontano dal tumore possibile.
   2. Sospendere i campioni in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 0,25 ug / ml di amfotericina B (terreno privo di siero). Mantenere i campioni sospesi in sterili provette da 50 ml e trasferire al laboratorio.
      NOTA: I fibroblasti sono altamente migratori e proliferative rispetto ad altri tipi di cellule, come le epiteliali, endoteliali e cellule muscolari lisce. Il metodo conseguenza sfrutta queste caratteristiche di fibroblasti, e outgrocellule ala da sezioni di tessuto sono abbondanti in fibroblasti. Dopo diversi passaggi in coltura, altri tipi di cellule non riescono a sopravvivere e propagarsi in DMEM con siero fetale bovino 10% (FBS), risultando in colture cellulari di fibroblasti purificate. Le cellule potrebbero essere usate 3-7 passaggi seguenti colture primarie.
2. Espianto e condizionamento per escrescenza cellulare:
   1. Eseguire colture primarie di fibroblasti con un protocollo precedentemente riportato con modifiche ^5.
   2. In laboratorio, posizionare il campione di tessuto su un piatto di 10 centimetri di coltura tissutale senza terreno di coltura e tagliato in piccole sezioni ~ 2-3 mm di dimensioni con pinza sterile e un bisturi. Durante questo processo, evitare di fare parte asciutta, altrimenti l'efficienza della cella escrescenza è compromessa.
3. Separazione dello strato di cellule epiteliali e tessuto connettivo:
   1. Immergere le sezioni di tessuto tagliato in mezzo di coltura contenente 2.000 PU / ml dispasi I e cultura per 16 ore a 4 ° C.
   2. Trasferire le sezioni di tessuto ad un piatto, e separare lo strato di cellule epiteliali dal tessuto connettivo adiacente. Elaborare le sezioni di un banco pulito per evitare la contaminazione di microrganismi.
      NOTA: Se è necessaria colture primarie di cellule epiteliali, eseguire il passaggio 1.3. Se solo fibroblasti devono essere isolati, omettere il passo 1.3, perché le successive Espianto e cellulari passaggi sono sfavorevoli per le cellule epiteliali, che danno le popolazioni di fibroblasti purificate.
4. Montaggio di sezioni di tessuto:
   1. Tritare i tessuti a pezzi 1 millimetro con due bisturi. Se i pezzi non sono sufficientemente piccoli, spiccano più facilmente dal piatto, e le cellule non riuscirà a superare sulla superficie del piatto.
   2. Inserire piccole sezioni di tessuto polmonare uno dall'altro per mantenere un'area vuota circostante ogni pezzo. Effettuare graffi sulla superficie del piatto di coltura tissutale con una lama di bisturi per facilitare il fissaggio di sezioni di tessuto.
      NOTA: Graffioappare anche per facilitare escrescenza cellulare, fornendo piste lungo le quali le cellule possono migrare.
      1. In alternativa, inserire pezzi di tessuto tritate individualmente in ogni pozzetto di un 6-pozzetti, e coprire con un vetrino. Fissare il vetrino alla superficie della piastra con grasso al silicone.
      2. Mettere grasso al silicone in due punti 1,5 centimetri a parte in ogni pozzetto usando un pin sterile. La copertura di pezzi di tessuto migliora l'efficacia di escrescenza cellulare e la propagazione delle cellule dopo diversi passaggi.
5. Successivamente Espianto:
   1. Aggiungere delicatamente mezzo di coltura al piatto prima che le sezioni di tessuto asciugano, come conseguenza cella efficiente è perso in gran parte, se i campioni asciugare. Non versare il medium troppo rapidamente come le sezioni di tessuto sarebbe staccare.
   2. Cellule culturali in DMEM con 10% FBS. Utilizzare abbastanza medio coprire appena il tessuto, ma non troppo che permette galleggiante, come galleggiabilità supplementare promuove distacco dalpiatto.
6. Brano Cell:
   1. Maneggiare il terreno di coltura con cura in ogni momento, come ripetuti movimenti del piatto cultura può portare al distacco delle sezioni di tessuto.
   2. Porre le capsule di coltura in un incubatore a 37 ° C per 5-7 giorni. Aggiornare il mezzo di ogni altro giorno, e gestire i piatti della cultura minimamente durante le medie modifiche. I fibroblasti troppo grande dal bordo delle sezioni di tessuto nelle prossime settimane.
      NOTA: Dopo ~ 2-3 settimane, fibroblasti diventano troppo grandi raggiungono quasi confluenza, a seconda della quantità di superficie.
   3. Lavare le cellule con 1x PBS, e aggiungere 1 ml di tripsina I alla piastra.
   4. Dopo tripsinizzazione, staccare le cellule utilizzando 9 ml di DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere cellule sospese nel mezzo in una provetta da 10 ml, insieme alle sezioni di tessuto. Dopo la centrifugazione per formare pellet cellulari, risospendere il pellet con conseguente nuovo mezzo.
   5. Seed le celle e sezioni di tessuto su un nuovo culpiatto ture, al punto che i tessuti non riescono a collegare al piatto, mentre le cellule aderiscono e crescono. Il giorno seguente, rimuovere i pezzi di tessuto galleggianti per aspirazione, e cambiare il mezzo. Fibroblasti Attached propagano con culture successive.

2. tridimensionale Co-cultura umano Polmone fibroblasti e cellule tumorali

1. Preparazione delle cellule e reagenti:
   1. Circa utilizzare 2 x 10 ⁵ cellule epiteliali e 2,5 x 10 ⁵ fibroblasti per pozzetto. Preparare collagene di tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampone di ricostituzione (NaOH 50 mm, 260 NaHCO mM _3, HEPES 200 mm), 5x DMEM, DMEM integrato con il 10% FBS per la cultura di fibroblasti, e un mezzo di co-coltura 3D (una miscela 1: 1 di coltura di fibroblasti medie e terreno di coltura per le cellule tumorali).
   2. Cultura A549 cellule di adenocarcinoma del polmone, i fibroblasti e la co-coltura A549 3D in DMEM supplementato con 10% FBS.
2. Collagene gel formazione:
   1. Lavare fibroblasti coltivati ​​su 10 centimetri piatto con 1x PBS, e aggiungere 1 ml di tripsina I alla piastra. Dopo tripsinizzazione per ~ 5 min a 37 ° C, staccare le cellule utilizzando 9 ml DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere cellule sospese nel mezzo in una provetta da 10 ml, e centrifugare a 200-300 xg per formare pellet cellulari.
   2. Risospendere il pellet risultanti a 100% FBS ad una densità di 5 x 10 ⁵ / ml.
   3. Preparare il gel di collagene su ghiaccio. Raffreddare i reagenti, pipette e tubi in frigorifero prima della seguente procedura. Anche su ghiaccio, la miscela solidifica in una certa misura, ed il volume totale è inferiore alla somma di tutti i componenti.
   4. In ogni pozzetto, preparare il gel di collagene miscelando 0,5 ml di sospensione fibroblasti (2,5 x 10 ⁵ cellule) in FBS, 2.3 ml di collagene tipo IA, 670 microlitri DMEM 5x, e 330 microlitri tampone di ricostituzione. Lasciare i gel di impostare facilmente a temperatura ambiente.
      1. Vigorosamente pipetta per garantire a mi omogeneaxture. Evitare di creare bolle durante il processo di pipettaggio.
   5. Aggiungere la miscela (3 ml) a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e lasciare gelatinizzare in incubatore a 37 ° C senza disturbo per 30-60 min.
3. Coltura cellulare Cancer sul gel di collagene:
   1. Eseguire co-coltura tridimensionale utilizzando un protocollo precedentemente riportato con modifiche ^6.
   2. Risospendere le cellule tumorali nel medio 3D co-coltura (o in DMEM con 10% FBS in caso di cellule A549) ad una densità di 1 x 10 ⁵ / ml.
   3. Versare 2 ml della soluzione di cellule risospeso (2 x 10 ⁵ cellule) sulla superficie di ciascun gel. Modifica numero di cellule delle cellule tumorali o fibroblasti in co-coltura a seconda delle condizioni sperimentali.
4. Gel contrazione:
   1. Incubare gel notte a 37 ° C in modo che le cellule tumorali possono aderire al gel di collagene. Staccare ogni gel, e generare una 'cultura fluttuante' in ogni pozzetto of la piastra da 6 pozzetti.
      NOTA: utilizzando una cultura galleggiante, vari cambiamenti nella dimensione gel sono indotti dalla tensione meccanica e la degradazione del collagene, che sono mediati da interazioni cellulari tra cellule e fibroblasti tumorali co-coltura.
   2. Utilizzare un angolato 21 ago G o spatola per separare ciascun gel dal bordo del pozzo. Ogni 2-3 giorni, aggiornare i pozzetti con 2 ml di 3D medio co-coltura. Misurare la dimensione di ciascun gel ogni giorno per 5 giorni.
5. Analisi di gel di collagene:
   1. Misurare il contenuto di collagene di ogni gel con metodi di quantificazione di collagene, come ad esempio il test Sircol. Eseguire l'analisi trascrittomica o RT-PCR dopo aver raccolto RNA da gel ^5.

3. Aria liquida Cultura Interfaccia e Invasion Assay

1. Dopo coltura i gel di collagene a 37 ° C per 5 giorni, esporre i gel contratte all'aria ponendoli su una maglia (70 micron dimensione dei pori) in una nuova 6-pozzetti. Effettuare la maglia da filtri cellulari disponibili in commercio utilizzati per citometria a flusso.
2. Riempire delicatamente ogni pozzetto con 11 ml di 3D medio co-coltura.
3. Posizionare il gel sulla rete utilizzando un cucchiaio sterile e rimuovere qualsiasi supporto rimanente dal gel. In questa condizione, immergere gel nel mezzo, mentre esporre la superficie superiore del gel all'aria. Definire questa condizione cultura come interfaccia aria-liquido.
   NOTA: Dopo 5-7 giorni di mantenimento della coltura interfaccia aria-liquido a 37 ° C in incubatore, le cellule tumorali invasive migrano nel gel. A seconda del tipo di cellula e come risultato di interazioni cellulari, gradi variabili di cellule variazione morfologica nelle cellule tumorali sono indotte dalla cultura all'interfaccia aria-liquido.
4. Per la valutazione istologica, fissare il gel in soluzione di formalina notte a temperatura ambiente e incorporare in paraffina. Macchia sezioni verticali (4 micron) con ematossilina eosina (H & E). Eseguire l'analisi immunoistochimica on sezioni ^4.

Risultati

Questo metodo di co-coltura, imitando il microambiente tumorale, è uno strumento utile per studiare le interazioni tra cellule tumorali e fibroblasti incorporati in gel di collagene. Nello studio precedente, tre parametri sono stati valutati in questo modello sperimentale: collagene contrazione gel, l'invasione delle cellule tumorali e cambiamento morfologico. La proliferazione delle cellule del cancro è stato stimato utilizzando anche Ki67 immunostaining ^4. Campioni di tessuto polmonare sono stati raccol...

Discussione

CAF formano una componente importante della ECM circostante le cellule tumorali e non solo forniscono una impalcatura per il tumore, ma anche partecipare attivamente nello sviluppo del tumore ^7. Accumulando prove dipana l'impatto dei CAF o loro molecole correlate alla eventuale previsione, mettendo in evidenza il ruolo critico della progressione tumorale CAF-mediata ^8.

Nello studio precedente, abbiamo utilizzato il metodo conseguenza di isolare CAF polmonari ^4....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
Collagene tipo IA	Gelatina Nitta Inc.	Tampone di ricostituzione CELL-1A
	Nitta gelatin Inc.
Vetrino coprioggetto	NUNC	174934
Grasso siliconico	Dow Corning Toray	Grasso
Dispase I	WAKO	386-02271
Piastra a 6 pozzetti	BD Falcon	353046
Filtro cellulare (70 μ m)	BD Falcon	352350