Articolo metodologico

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

DOI:

10.3791/52475

⸱

19 febbraio 2015

 ,  ,  , 
1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.

Abstract

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La degenerazione dei neuroni dopaminergici mesencefalici (mesDA) è il segno patologico della malattia di Parkinson. Lo studio dei processi biologici coinvolti nelle funzioni fisiologiche e nella vulnerabilità e morte di questi neuroni è utile per comprendere le cause sottostanti e svelare la cura per questa comune malattia neurodegenerativa. Le colture primarie di neuroni mesDA forniscono uno strumento per lo studio delle proprietà molecolari, biochimiche ed elettrofisiologiche, al fine di comprendere lo sviluppo, la sopravvivenza a lungo termine e la degenerazione di questi neuroni durante il decorso della malattia. Qui presentiamo un metodo dettagliato per l'isolamento, la coltura e il mantenimento di neuroni dopaminergici mesencefalici da embrioni di topo E12.5 (o di ratto E14.5). Le condizioni ottimizzate della coltura cellulare in questo protocollo determinano la presenza di proiezioni assonali e dendritiche, connessioni sinaptiche e altre proprietà morfologiche neuronali, che rendono le colture adatte allo studio delle caratteristiche fisiologiche, biologiche cellulari e molecolari di questa popolazione neuronale.

Introduzione

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La perdita di neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta conduce ai sintomi motori cardinali della malattia di Parkinson (PD), la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa. La causa della morte di questa popolazione neuronale mesencefalica non è nota. Per studiare i meccanismi biochimici responsabili dello sviluppo e modulando le proprietà neurofisiologiche e la sopravvivenza dei neuroni mesDA, diverse colture cellulari e sistemi modello animali sono stati utilizzati. Linee cellulari immortalizzate, compreso il ratto dopaminergica linea cellulare 1RB 3 AN 27 (N27), il dopaminergico umano linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y, la linea cellulare di ibridoma del mouse dopaminergica MN9D e mesencefalico umana LUHMES cellule sono state usate per gli studi meccanicistici biochimici e limitate 1 -5. Per lo studio della perdita di neuroni specifica mesDA, vari neurotossina-based e modelli genetici sono stati sviluppati 6-8. Culture mesencefalo ventrale primarie, Fornire uno strumento indispensabile per lo studio delle proprietà neuronali e sinaptiche dei neuroni dopaminergici e i meccanismi coinvolti nella patogenesi di questa malattia comune.

Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei neuroni dopaminergici mesencefalici, che contiene le modifiche con conseguente maggiore sopravvivenza e una maggiore resa di vetrini per dell'embrione. L'uso di pre-maturo mesencefalo del mouse E12.5 (E14.5 nel ratto) migliora la sopravvivenza. A questa età i neuroni non hanno ancora sviluppato assoni, che lascia intatte le cellule durante la dissezione e riduce al minimo lo stress incrementando in modo significativo la redditività. Inoltre, attenta dissezione del mesencefalo ventrale, come descritto nella sezione 2 del presente protocollo, migliora ulteriormente la capacità di sopravvivenza. Per aumentare il numero di vetrini per embrione, un metodo alternativo di placcatura è presentato nella sezione 4 del presente protocollo. Questo porta ad un rendimento di fino a 10 vetrini per dell'embrione rispetto a 4 coprioggetti sottocondizioni standard di placcatura riducendo così la quantità di animali per esperimento.

I neuroni in coltura mostra conseguenza di assoni e dentrites, formano connessioni sinaptiche e rivelano la presenza di marcatori neuronali e sinaptiche rendono queste culture adatto per l'imaging cellulare dal vivo, immunocitochimica e studi elettrofisiologici. Inoltre, l'uso di colture neuronali facilita la manipolazione genetica e farmacologica. Escrescenza dei neuriti dal giorno 2 in vitro consente per gli studi di sviluppo. Inoltre, la sopravvivenza a lungo termine di culture (fino a sei settimane) li rende adatti per lo studio della lenta, progressiva degenerazione dei neuroni questi.

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Protocollo

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NOTA: Gli animali sono stati mantenuti e gestiti in conformità con le linee guida istituzionali e tutte le procedure di animali sono stati approvati dal benessere degli animali del Imperial College e Ethical Review Body (AWERB) e il Ministero degli Interni e la Harvard University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC), in conformità alle normative federali e statali.

1. reagente e installazione attrezzature

  1. Thaw, aliquota e conservare 1 mg / ml soluzione laminina a -80 ° C. Sciogliere 2 microlitri in 1 ml DMEM / F12, ottenendo una concentrazione di rivestimento di 1-2 mg / cm 2.
    NOTA: Thaw laminina lentamente sul ghiaccio e si dissolvono in freddo DMEM / F12 e aggiungerlo ai piatti / coprioggetti immediatamente.
  2. Diluire 75 ml di 0,01% Poly-L-ornitina in 425 ml di PBS e conservare a 4 ° C.
    NOTA: La durata della soluzione di lavoro è fino a un mese.
  3. Sciogliere 25% (peso / volume) BSA in PBS, pH 7.4, e conservare a 4 ° C per un massimo di un year.
  4. Preparare 50% FBS (in HBSS) mezzi di disattivazione.
  5. Preparare terreno completo aggiungendo 50 U / ml di penicillina e streptomicina, 1x N2 supplemento, 5% (vol / vol) FBS, 0,36% D - (+) - Glucosio (peso / volume), 0,25% di BSA (peso / volume) di DMEM / F12 e conservare a 4 ° C.
    NOTA: La durata è fino a 10 giorni.
  6. Luogo coprioggetto in ebollizione il 70% (vol / vol) di etanolo per almeno 30 minuti per rimuovere eventuali tracce di grasso e di autoclave.
  7. Luogo coprioggetto in piastre da 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri soluzione Poli-L-ornitina in ciascun pozzetto. Incubare 1 ora sotto il cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente e poi, lavare 3 volte con 500 microlitri acqua. Aggiungere la soluzione laminina 500 microlitri per ogni piatto e incubare O / N in umidificata coltura tissutale incubatore a 37 ° C.
    NOTA: Anche se non sono necessari lavaggi dopo il trattamento laminina, lavare i poli-L-ornitina meno di tre volte provoca la morte delle cellule 24 ore dopo coltura.
  8. Lucidare le punte delle pipette di vetro oltre a gas naturale o torcia fzoppo.
    NOTA: Dopo questo passo il diametro della punta dovrebbe essere circa la metà della sua dimensione normale.
  9. Tagliare i tappi di provette da 1,5 ml microcentrifuga, utilizzando una forbice autoclave e autoclave.

2. dissezione embrionali ventrale Mesencefalo

  1. Narcotizzare gravide temporizzato (E12.5) dighe di CO 2 inalazione e quindi eutanasia da dislocazione cervicale.
  2. Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo e fare un'incisione addominale fino a quando le sacche uterine sono tutti esposti. Uso pinze tagliare l'attaccamento vaginale e rimuovere l'utero. Inserire l'utero in ghiacciata HBSS, in una piastra di Petri 100 mm.
  3. Rimuovere embrioni dall'utero e sacco amniotico, usando pinze (Figura 1C). Luogo embrioni in HBSS ghiacciata fresca.
    NOTA: Il rettangolo in figura 1D indica la posizione del mesencefalo ventrale embrionale.
  4. Mettere gli embrioni al microscopio dissezione (10x) e sezionare il mesencefalicaarch tagliando il cervello al istmo e mesencefalica-diencephalic regione di confine, con il bioscissor e pinza (Figura 1E, si prega di fare riferimento alla Figura 1A per le linee di incisione).
  5. Dopo aver preso l'intera mesencefalo, fare un taglio nel mesencefalo mediodorsale (Figura 1F).
  6. Rimuovere meningi, utilizzando due pinze (Figura 1H).
    NOTA: PUNTO CRITICO: Questo passaggio è fondamentale per la resa ottimale neuronale e la sopravvivenza. Poiché le condizioni di coltura sono ottimali per le cellule cerebrali, la maggior parte delle cellule del tessuto circostante muoiono dopo placcatura e il segnale apoptotico da questo tessuto può danneggiare l'integrità delle culture.
  7. Appiattire il tessuto mesencefalo sul piatto Petri per osservare la forma a farfalla e tagliare circa la metà di ogni ala, utilizzando una lama da barba sterilizzato (Figura 1H, I).
    NOTA: Figura 1J descrive isolato mesencefalo ventrale.
  8. Trasferire ilpezzo di mesencefalo ventrale in ghiaccio-freddo HBSS in un tubo da 15 ml e procedere con il successivo dell'embrione.
    NOTA: i passaggi 2,1-2,8 non dovrebbe prendere più di 1 ora. Mantenere gli embrioni di là di questo lasso di tempo sul ghiaccio diminuisce vitalità cellulare in modo significativo.

3. La dissociazione delle cellule ventrale Midbrain

  1. Trasferire i pezzi di mesencefalo ventrale sotto una cappa a flusso laminare. Rimuovere il HBSS e aggiungere 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) 0,05% tripsina-EDTA nel tubo conico (volumi sufficienti per un massimo di 12 pezzi di mesencefalo ventrale). Incubare il tessuto a 37 ° C per 5-10 minuti.
  2. Rimuovere tripsina-EDTA sotto il cofano e aggiungere 1 ml di mezzo di disattivazione (siero disattiverà tripsina) al tessuto.
  3. Rimuovere il mezzo disattivazione e lavare il tessuto in 1 ml di mezzo completo due volte.
    NOTA: evitare di rimuovere tutto il supporto dal tubo e pipettando il tessuto, per evitare che scartando le cellule dissociate.
  4. Aggiungere 1 ml terreno completo e triturato il tessuto con un bicchiere pipetta fuoco lucido. Evitare la formazione di bolle e continuare triturazione fino al raggiungimento sospensione di cellule singole.
    NOTA: Di solito, 8-10 passa attraverso la punta ristretta sono necessari per la completa dissociazione.
  5. Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti a RT e rimuovere il supporto.
  6. Risospendere il pellet in 1 ml di media completo lentamente pipettando su e giù per un massimo di quattro volte.

4. Cellule placcatura ventrale Midbrain

  1. Miscelare 10 ml di sospensione cellulare con 90 microlitri Trypan blue soluzione e contare il numero di cellule con un emocitometro.
    NOTA: la vitalità delle cellule può essere controllato in questa fase.
  2. Mettere tappi provetta sterilizzati in 100 millimetri piastre di Petri e trasferire i coprioggetti Poly-L-ornitina / laminina rivestite, utilizzando pinze, una alla volta sulla parte superiore dei tappi.
    NOTA: Non lavare i coprioggetti ed evitare l'essiccazione della laminina, poiché questo può causare uneveculture n e diminuzione sopravvivenza delle cellule.
  3. Regolare il volume a 1500 cellule per 1 ml aggiungendo mezzo completo e aggiungere 100 microlitri (totale di 150.000 cellule) della sospensione cellulare sopra l'coprioggetto (il volume è ottimale per coprire la superficie del vetrino senza perdite). Chiudere le piastre di Petri e incubare per 1 ora in un incubatore umidificato coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2).
    NOTA: PUNTO CRITICO: Questo passo è necessario per migliorare il collegamento e la vitalità delle cellule e per aumentare il numero di lamelle per dell'embrione. In alternativa, le cellule possono essere trasferiti direttamente nei pozzetti (contenenti coprioggetto), ma il numero di celle deve essere aumentata a 350.000 per pozzetto (invece di 150.000). In altre parole, con questo metodo, 8-10 coprioggetto possono essere acquisiti, mentre il trasferimento diretto produce circa 3-4 vetrini a causa delle cellule, che si attaccano alle piastre (accanto o sotto i coprioggetti). La viabili mediaty delle culture, con questo metodo è stato di circa il 90%.

5. Cultura crescita e manutenzione

  1. Dopo 1 ora di incubazione, trasferire accuratamente i coprioggetti compreso il terreno in piastre da 24 pozzetti, contenente 400 ml di pre-riscaldato (a 37 ° C) terreno completo (volume totale: 500 ml). Incubare le cellule O / N a 37 ° C.
  2. Entro 24 ore dopo incubazione dei pozzetti, aggiungere delicatamente 500 microlitri terreno completo in ogni pozzetto.
    NOTA: Le prime ore è la fase più critica per la sopravvivenza dei neuroni dopaminergici e il numero di cellule sopravvissute non cambia significativamente oltre questo punto.
  3. Non aggiungere supporti supplementare alle colture per le prime due settimane o finché il terreno diventa gialla. Se coltura per più di due settimane o cambiamenti di colore medio al giallo, cambio la metà dei mezzi di comunicazione (500 ml) con mezzi freschi completi pre-riscaldato (tipicamente ogni due settimane).
    NOTA: i neuroni dopaminergici nelculture sarebbero sopravvissuti per più di 6 settimane in queste condizioni.

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Risultati

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Immunoistochimica contro tirosina idrossilasi (TH) mostra che tra 0,5-1% delle cellule in coltura sono dopaminergica. Proiezioni neuronali sembrano in 2 ore dopo la placcatura e il primo giorno, assoni e dendriti sono distinguibili (figura 2), utilizzando la tirosina idrossilasi (TH) e proteina 2 (Map2) anticorpi associata ai microtubuli (Figura 3). I neuroni sopravvivono per più di sei settimane e mostrano un'ampia conseguenza. Il rapporto neurone-glia nelle colture è direttamente ...

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Discussione

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Neuroni dopaminergici nel mesencefalo sono la principale fonte di dopamina nel sistema nervoso centrale. Sono divisi in tre gruppi, pars compacta della sostanza nera (SNPC), area ventrale tegmentale (VTA) e campo retrorubral (RRF) 10, 11. I neuroni in SNPC e VTA danno luogo a grandi vie dopaminergiche, mesocorticali, mesolimbico e nigrostriatale, coinvolte in funzioni come il controllo delle emozioni, la motivazione e il comportamento del motore. Scomparsa dei neuroni in SNPC e disgregazione funzionale del si...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato svolto utilizzando i fondi della Divisione di Scienze del Cervello, Dipartimento di Medicina, Imperial College di Londra a K.N.A.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Miscela di nutrienti medi Eagle modificata di Dulbecco, F-12Invitrogen11330
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1X), siero bovino fetale liquidoInvitrogen24020-117
, inattivato termicamente (FBS),Invitrogen16140
N2 (100X), liquidoInvitrogen17502-048
D-(+)-glucosio soluzione (45% (wt/vol) in acquaSigmaG8769
Albumina sierica bovina BSASigmaA9430
Laminina da membrana basale del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-SwarmSigmaL2020
Penicillina/streptomicinaInvitrogen15070
Tripsina (0,05% (wt/vol)Invitrogen25300
Siero bovino coltura cellulare di albumina (BSA) testataSigma A9418
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)SigmaP3813
Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (Th)Pel-Freez BiologicalsP60101-0 
Poli-L-ornitina, soluzione allo 0,01%SigmaP4957
Anti-Map2 (proteina associata ai microtubuli-2A e -2B) anticorpoMilliporeMAB3418
Anticorpo anti-sinapsina-1MilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG    anticorpoSonde molecolariA-21206
Alexa Fluor 594 asino anti-coniglio IgG    anticorpiSonde molecolariA-21207
Alexa Fluor 488 asino anti-pecora IgG    anticorpoSonde molecolariA-11015
Alexa Fluor 594 asino anti-pecora IgG    anticorpiSonde molecolariA-11016
Alexa Fluor 594 asino anti-topo IgG    anticorpiSonde molecolariA-21203
Soluzione di blu di tripano (0,4% (wt/vol))Biowhittaker17-942E
StereomicroscopioCarl ZeissStemi 2000-C
Microscopio a contrasto di fase invertitoCarl ZeissAxiovert 40 C
Dumont ForcipeFine Scientific ToolsMay-45
Pinze antiscivolo – DumoxelFine Scientific Tools11251-33
Due pinze Dumont #45 – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
Portalama/Deruttore Impugnatura piatta - 11cmFine Scientific Tools10052-11
Forbici per iride per studenti - Dritta 11,5 cmFine Scientific Tools91460-11
Illuminatore alogeno in fibra otticaNikonMKII
Monouso in vetro borosilicato Pasteur PipetteFisherbrandEmocitometro 13-678-20C
ProscitechSVZ2NIOU
0,2 &; m unità filtranti steriliNalgeneNL-CE-156-4020
piastre di Petri 100x20 mmBD Biosciences351005
Tondo Cover Slip #1 Spessore Vetro tedesco 12 mmVetro Bellco1943-10012 
, integratore

Riferimenti

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