Articolo metodologico

Monitoraggio midollo osseo di topo monociti In Vivo

DOI:

10.3791/52476

⸱

27 febbraio 2015

 ,  ,  , 
1Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses (CIMI), INSERM, U1135, CNRS, ERL 8255, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7

In questo articolo

Sommario

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I monociti sono regolatori chiave dell'immunità innata e svolgono un ruolo critico nel rinnovamento del sistema fagocitario mononucleare periferico e in caso di infiammazione. Questo manoscritto descrive la procedura di imaging in tempo reale del midollo osseo calvaria di topo per studiare il meccanismo di mobilizzazione dei monociti.

Abstract

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L'imaging multifotone in tempo reale offre una grande opportunità per studiare il traffico cellulare e le interazioni cellula-cellula nel loro ambiente fisiologico tridimensionale. Le attività biologiche delle cellule immunitarie si basano principalmente sulle loro capacità di motilità. I monociti del sangue hanno una breve emivita nel flusso sanguigno; Hanno origine nel midollo osseo e ne vengono rilasciati costitutivamente. In condizioni infiammatorie, questo processo è potenziato, portando alla monocitosi ematica e alla successiva infiltrazione dei tessuti infiammatori periferici. L'identificazione degli eventi biomeccanici che controllano il traffico dei monociti dal midollo osseo verso la rete vascolare è un passo importante per comprendere la rilevanza fisiopatologica dei monociti. Abbiamo eseguito l'imaging time-lapse in vivo mediante microscopia a due fotoni del midollo osseo del cranio del topo Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). Il topo MacBlue esprime la proteina fluorescente ciano potenziata con reporter fluorescenti (ECFP) sotto il controllo di un promotore specifico mieloide 1, in combinazione con la marcatura della rete vascolare. Descriviamo come questo approccio consenta il monitoraggio dei singoli monociti midollari in tempo reale per quantificare ulteriormente il comportamento migratorio all'interno del parenchima del midollo osseo e del sistema vascolare, nonché le interazioni cellula-cellula. Questo approccio fornisce nuove informazioni sulla biologia dei sottogruppi di monociti del midollo osseo e consente di approfondire il modo in cui queste cellule possono essere influenzate in specifiche condizioni patologiche.

Introduzione

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Il midollo osseo svolge un ruolo centrale nell'emopoiesi e rappresenta il principale serbatoio di monociti che ricircolano costitutivamente tra il sangue e il parenchima midollare, rinnovano il pool di monociti circolanti con una breve durata di vita 2,3 e partecipano alla ricostituzione dei tessuti allo stato stazionario-macrofagi e cellule dendritiche 4. Durante l'infiammazione o dopo l'aplasia transitoria, i monociti vengono attivamente mobilizzati dal midollo osseo o dalla milza 5, 6, 7 e colonizzano gli organi infiammati. Diversi assi chemioattrattivi sono stati coinvolti nel processo di mobilizzazione delle cellule mieloidi dal midollo osseo 8, 5, 6,9. Oltre al compartimento mieloide, il midollo osseo è anche un importante sito di priming dei linfociti T 10 e una nicchia di memoria immunologica 11,12. Pertanto, questo tessuto è centrale per numerose indagini nel campo dell'ematologia e dell'immunologia. Le nostre conoscenze sull'organizzazione strutturale delle cellule mieloidi midollari derivano principalmente dall'analisi della sezione istologica di tessuti fissati 13. Questa visione statica non consente di studiare la dinamica di scambio cellulare tra i diversi compartimenti del midollo osseo, che è alla base della sua attività funzionale.

L'imaging intravitale costituisce un importante input biologico nello studio della mobilità cellulare, dell'aderenza cellulare e delle interazioni cellula-cellula, che in precedenza erano descritte solo da sistemi in vitro. Le sfide tecniche per un corretto imaging intravitale includono la capacità di raggiungere il tessuto di interesse da un punto di vista ottico e di massimizzare il suo isolamento da derive fisiologiche (respiro, contrazioni muscolari o peristaltiche) o meccaniche (rottura ed estensione dei tessuti dopo l'intervento chirurgico e l'esposizione all'obiettivo del microscopio, nonché le perturbazioni di temperatura e vascolare/ossigenazione). Le derive microscopiche possono limitare la capacità di mantenere la messa a fuoco per lungo tempo e potrebbero introdurre artefatti nella quantificazione della motilità cellulare. Un'alternativa, convalidata per diversi tessuti per ridurre queste difficoltà tecniche, è quella di lavorare su tessuto espiantato incubato in un terreno termostatato e ossigenato; Tuttavia, l'interruzione completa della circolazione linfatica e vascolare può essere problematica. L'imaging intravitale del midollo osseo del cranio presenta diversi vantaggi riguardo a questi problemi. In primo luogo, richiede un'azione chirurgica minima. In secondo luogo, lo spessore dell'osso in questa regione consente la visualizzazione diretta delle nicchie del midollo osseo senza abrasione, riducendo così le perturbazioni fisiologiche. La rete midollare può essere visualizzata nella regione parasagittale dell'osso; Tuttavia, le sinusoidi sono più visibili nella zona fronto-parietale dove la matrice ossea è più sottile12,14.

L'imaging intravitale si basa sulla disponibilità del reporter fluorescente più accurato che tagga la popolazione di interesse. La marcatura in vitro della popolazione cellulare purificata prima del trasferimento adottivo ha portato a un'importante caratterizzazione delle nicchie di cellule staminali ematopoietiche 15 o dei microdomini endoteliali del midollo osseo che favoriscono l'attecchimento tumorale 16 e ha fornito diversi input fondamentali su concetti chiave in immunologia 17 . Tuttavia, questo approccio di solito richiede centinaia di migliaia di cellule per avere la possibilità di rilevarle successivamente in vivo. Ciò potrebbe essere spiegato dall'alto tasso di mortalità dopo la colorazione, dalla diluizione in tutto il corpo e dal cambiamento nello stato di attivazione, che potrebbe portare a un homing distorto. Il marcaging endogeno da un sistema di topi transgenici supera notevolmente queste limitazioni e ha permesso di visualizzare il comportamento dell'osteoblasto endogeno 8, dei megacariociti 18 o dei sottogruppi di linea mieloide 6. Tuttavia, bisogna essere cauti quando si considera la specificità del reporter fluorescente nel sottogruppo studiato.

Il Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, chiamato MacBlue mouse 1, è un prezioso sistema transgenico per studiare i monociti midollari con imaging in tempo reale 6. L'iniezione endovenosa di rodamina-destrano ad alto peso molecolare distingue il parenchima midollare dalla rete sinusoidale vascolare del midollo osseo. Utilizzando questo approccio, è possibile tracciare il comportamento dei monociti nei diversi compartimenti midollari in uno specifico contesto fisiopatologico di interesse. Inoltre, proponiamo un'ulteriore strategia per confrontare la dinamica dei monociti con quella dei neutrofili attraverso la marcatura in vivo con un anticorpo specifico.

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Protocollo

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NOTA: Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dalla sperimentazione animale ed etica Comitato francese e validati dal "Protection Service et Santé Animales, Environnement" con il numero A-75-2065. Le dimensioni dei campioni sono scelti in modo riproducibilità degli esperimenti, e secondo la 3R della regolamentazione etica animale.

1. Preparazione del mouse

  1. Anestesia
    1. Per breve periodo di immagini (meno di 1 ora), anestetizzare il mouse con una iniezione intraperitoneale di 200 ml di una soluzione salina contenente ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
    2. In alternativa, per un periodo di più immagini (fino a 4 ore), anestetizzare il mouse con inalazione di isoflurano 2,5% vaporizzato in una miscela di 70/30 O 2 / N 2 O, attraverso una maschera adattato.
    3. NOTA: In questo modo fornisce per incoscienza più stabile ed evita l'iniezione di serie intraperitoneale di droghe.
    4. Una volta che il mouse è anestetizzato, verificare la presenza di incoscienza attraverso la stimolazione del pad piede con pinze.
  2. Colorazione vascolare / colorazione supplementare
    1. Per la colorazione vascolare: Iniettare per via endovenosa nella vena della coda, 200 ml di Rhodamin-Destrano (2 MdA, 10 mg / ml in tampone salino).
    2. Per neutrofili colorazione: iniettare 2 ug di Ly6G-PE (clone 1A8) in 100 ml di soluzione salina per via endovenosa nella vena della coda.
  3. Immobilizzazione
    1. Per l'immobilizzazione, utilizzare un supporto stereotassica misura adattato al microscopio e l'inalatore gas anestetico.
      NOTA: Il supporto Sterotactic è un supporto in metallo con due staffe in lamiera metallica, uno essendo fissato e l'altra estraibili e adattabili, per stringere la testa dell'animale.
    2. Installare la testa del mouse tra le piastre di fissaggio per assicurare l'isolamento dai movimenti respiratori. Serrare le orecchie tra le piastre di fissaggio e la testa per allungare la skin. Controllare la stabilità e la respirazione benessere degli animali.
  4. Rimuovere il cuoio capelluto
    1. Usare cautela etanolo al 70% per bagnare i capelli del cuoio capelluto con un applicatore sterile, evitando il contatto con gli occhi.
    2. Tagliare la pelle con forbici sterili e tronchesi per rimuovere completamente il cuoio capelluto dal all'indietro dell'osso parietale all'osso frontale. Tenere lontano fino a 3 mm da occhi e orecchie per prevenire vasta emorragia. Rimuovere il tessuto connettivo lasso che copre il cranio (periostio). Lavare i capelli rimanenti con caldo tovagliolo di carta PBS-impregnati.
  5. Sistema Immersion istituito
    1. Incollare un anello di gomma di 18 mm di diametro con colla chirurgica direttamente sul cranio con un piccolo ago calibro di controllare la distribuzione. Colla l'intera periferia dell'anello di gomma per evitare perdite (30 microlitri dovrebbero essere sufficienti).
    2. Pulire il cranio sotto l'anello per l'ultima volta con un tovagliolo di carta imbevuta di PBS e poi aggiungere 37 ° C PBS per una completa immersione delcranio. Aggiungere una goccia di soluzione di NaCl allo 0,9% o specifica pomata oftalmica su ciascun occhio del mouse per evitare secchezza oculare. Trascinare il titolare stereotassica nell'ambito dell'obiettivo.
    3. Circa posizionare il campo con l'oculare del microscopio attraverso la trasmissione diretta.

2. due fotoni Imaging Acquisition

  1. Utilizzare un microscopio multifotone accoppiato con un laser Ti: zaffiro, che fornisce 140fs impulsi di luce NIR, selettivamente sintonizzabile da 680 a 1.080 nm, e un modulatore acustico-ottico per il controllo della potenza del laser. Utilizzare una configurazione di cui 3 rilevatori esterni non descanned (NDD) (che consentono la registrazione simultanea di 3 canali fluorescenti) con una combinazione di due specchi dicroici (565 nm e 690 nm), 565/610 e 500/550 filtri passa-banda, e una 485 breve filtro passa, con un piano di apochromat × 20 (NA = 1) Obiettivo immersione in acqua.
  2. Impostare la camera di riscaldamento per consentire una buona omeotermia delle ANAESMouse thetized.,
    NOTA: temperatura potrebbe essere impostato a 1 ora prima di imaging sessione per una migliore stabilità. Nel nostro caso, 32 ° C è stata scelta per ottenere la temperatura corporea ottimale del mouse anestetizzato (36-37 ° C) ed è mantenuta fino a 4 ore. Questa temperatura può essere adattato al sistema utilizzato (sonda digitale può essere utilizzato per controllare questo punto). Inoltre, la camera di riscaldamento utilizzato è scuro / nero e copre una parte del sistema (obiettivi e piattello motorizzato) per evitare la contaminazione luce esterna.
  3. Accendere il sistema
    1. Accendere il laser Ti: zaffiro, l'intero sistema di microscopio. Avviare il software di acquisizione. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda laser a 870 nm. Selezionare appropriata NDD per la registrazione.
      NOTA: Nel nostro caso, generazione di seconda armonica (SHG) 19 e proteina fluorescente ciano (ECFP) vengono rilevati dal NDD dopo il filtro passaggio corto 485. ECFP viene anche rilevato dal NDD dopo il filtro passa-banda 500/550 e Rhodamin destrano viene rilevato da tegli NDD dopo il filtro passa-banda 565/610.
  4. Regolare le impostazioni di acquisizione
    1. Utilizzare la "acquisizione dal vivo" il comando di imaging del software e con il controllo direzionale del microscopio, regolare la messa a fuoco su una regione con il segnale ECFP e Rhodamine. Impostare la potenza del laser al minimo per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore con minima foto-danni.
      NOTA: L'impostazione di potenza utilizzato varia a seconda della profondità della regione di interesse. In genere le impostazioni AOM sono disposte intorno al 20%, che rappresenta una potenza laser oltre l'obiettivo di circa 15 mW. E 'meglio aumentare la potenza plusvalenza PMT per ogni NDD per ridurre fotometabolismo e foto-danni. Impostazioni di acquisizione tipiche sono la scansione singola con un tempo di permanenza di pixel di 1,58 ms e una risoluzione di 512 x 512 pixel con un ingrandimento di 1,5.
  5. Selezionare le regioni di interesse
    1. Una volta che i parametri di registrazione sono impostati, usare di nuovo il comando di acquisizione "in diretta",e rilevare il tessuto di scegliere un (x, y, z) campo desiderato da monitorare in tempo reale.
      NOTA: in genere, abbiamo scelto un campo che include sia vascolare e aree parenchimali.
    2. Registrare il campo con il comando software "posizione".
      NOTA: Questo comando memorizza x, y, z coordinate di diversi campi lontani.
    3. Selezionare e registrare ulteriori campi di interesse (fino a 3) utilizzando la stessa procedura.
    4. Impostare un z-stack 3D con il comando software "z-stack" sulla prima posizione memorizzata secondo il volume richiesto con ingrandimento scelto. Memorizza posizione più profonda, e poi la posizione più alta. Normalizza potenza del laser con la profondità.
      NOTA: Per più immagini campo concomitante, acquisiamo 5 fette separate da 3 micron z-punti per ogni campo di acquisire un volume di 12 micron di spessore. Queste impostazioni possono essere adattati al tipo di cellula studiati.
  6. Acquisizione di lancio
    1. Selezionare il220; serie comando "software e scegliere la durata dell'intervallo di tempo e del numero di cicli di tempo. Inizia time-lapse imaging in base al lasso di tempo e la durata richiesta selezionando il comando software "avviare esperimento".
      NOTA: Nel nostro caso, acquisiamo un volume ogni 30 secondi per 60 cicli che rappresentano 30 minuti in tempo reale. Più piccolo lasso di tempo può essere effettuata per tenere traccia di laminazione delle cellule veloce nel vaso sanguigno. In questo caso diluente z-stack e non più di 2 campi differenti possono essere registrati contemporaneamente.
    2. Monitoraggio regolare del set up.
      1. Controllare sempre l'animale per assicurarsi che è inconscio.
        NOTA: Agitazione di baffi o gambe dell'animale sono indicatori di ripresa. In caso di respirazione dell'animale è a scatti, la quantità di isoflurano può essere leggermente ridotta. Forte deriva tessuti durante l'acquisizione è un indicatore del mouse del risveglio.
      2. Assicurarsi che l'obiettivo sia correttamente immersa. Rinnova 37 ° C PBS between due acquisizioni (30 min).
        NOTA: la scomparsa progressiva di segnale durante l'acquisizione è l'indice di perdita PBS.
  7. Fine della procedura
    1. Una volta che i video richiesti vengono registrati, eutanasia animale da dislocazione cervicale rapidamente prima rianimazione.
      NOTA: guarigione delle ferite porta alla formazione di una crosta in 24 a 48 ore, che limita la possibilità di effettuare l'imaging longitudinale.

Analisi 3. Dati

  1. Correzione Drift
    1. Utilizzare software Imaris Bitplane per il 3D tracking automatico.
    2. Aprire la sequenza di immagini 3D su Imaris. Selezionare "spot" di comando, e generare tracciamento manuale (mouse + shift) per tutti i punti di tempo per un minimo di 4 diversi punti di ancoraggio, se possibile, omogeneamente distribuito in campo.
    3. Applicare la correzione della deriva mediante il comando "corretto deriva" nella scheda "Modifica brano".
    4. Verificare la presenza di tha qualità della correzione in x, ye z in particolare per evitare esitazioni artefatti.
      NOTA: Se la correzione non è soddisfacente, provare altri punti di ancoraggio o escludere il video dall'analisi.
  2. Monitoraggio cellulare
    1. Utilizzare "aggiungere nuovi spot" di comando e selezionare "macchie traccia nel tempo" Impostazione algoritmo. Andare al passo successivo.
    2. Applicare procedura automatica di monitoraggio cellulare o su tutto il canale di interesse utilizzando "canale di origine" comando. Set oggetti (cioè, le cellule) diametro 10 micron. Andare al passo successivo.
      NOTA: La scelta dipenderà dalla distinzione tra oggetti e specificità del segnale misurato. In breve, inseguimento automatico l'intero canale è possibile solo se il segnale rilevato è specifico per l'oggetto di interesse. Poiché sia ​​SHG e ECFP vengono rilevati dal NDD dopo il filtro 485 passaggio corto, il monitoraggio sarà più specifico ed efficace utilizzando il segnale ECFP registrato dal NDD dopo la 500/550 filtri passa-banda. Raggruppati o oggetti confezionati densi richiederanno selezione manuale dei singoli oggetti simili al punto 3.1.2.
    3. Selezionare "qualità" tipo di filtro, impostare la soglia di escludere il monitoraggio di oggetti non specifici. Andare al passo successivo.
    4. Scegliere "browniano Algoritmo Motion" con i parametri esatti di "distanza Max" e "size Gap" tra due punti. Convalidare generazione track.
    5. Una volta che le tracce vengono calcolate automaticamente, selezionare "Durata del brano" tipo di filtro, impostare la soglia di eliminare le tracce più breve di 120 secondi (in rappresentanza di 4 punti di tempo).
    6. Obbligatorio: Dopo inseguimento automatico, controllare la qualità delle tracce.
      1. Srotolare la barra del tempo per verificare che gli oggetti seguono i percorsi della pista. In caso contrario, utilizzare le opzioni di correzione del punto di traccia disponibili nella scheda "edit": Cancellare le tracce false o improprie con comando "Elimina" (eliminare qualsiasi traccia pmista individualmente utilizzando il comando "disconnect"). Se il percorso tracciato è discontinua, aggiungere momento del dato mancante (click del mouse + SHIFT), selezionare tutti i punti di una determinata traccia, e usare "collegare" il comando nella scheda "Modifica brano".
  3. Parametri di quantificazione
    1. Selezionare la scheda "Statistiche" in "Preferenze" il comando, scegliere i parametri dinamici di interesse nella lista. Selezionare "Esporta tutte le statistiche su file" di comando e salvare il file excel generato.
      NOTA: Diversi parametri dinamici sono ottenuti direttamente dal software, come lunghezza della pista, velocità istantanea, velocità media, e tenere traccia rettilineità. Coefficiente Motilità 6, 20 può essere determinata, ma non è fornita direttamente dal software.
    2. Per ogni cella, calcolare la media degli spostamenti per ciascun periodo di tempo (T) (per un film lasso di tempo di 30 sec, Dt saranno 30, 60, 90 sec, ecc).Tracciare la media dello spostamento quadrata in funzione dell'intervallo di tempo. Ottenere coefficiente motilità calcolando la pendenza della parte lineare della curva.

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Risultati

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Struttura del cranio del mouse offre una buona opportunità di studiare la fisiologia del midollo osseo da imaging intravitale. L'osso essendo sottile intorno alla zona anteriore-parietale, è possibile ottenere l'accesso a nicchie midollari, senza abrasione dell'osso. La figura 1 rappresenta un campo 2D ampio del cranio di un MacBlue topo transgenico. La matrice ossea si compone principalmente di collagene I facilmente rilevabile con SHG 19. Iniezione di Rhodamin-destrano macchia la rete vasco...

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Discussione

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I punti critici della metodologia di imaging in vivo devono garantire la stabilità della messa a fuoco per massimizzare la durata di imaging e di minimizzare il rischio di contaminazione batterica e infiammazione, che potrebbe influenzare le dinamiche delle cellule infiammatorie. Imaging del cranio midollo osseo segue questi obiettivi, come l'intervento chirurgico effettuato per ottenere l'accesso al midollo osseo è minimo. L'uso di materiale sterile e antisettici è essenziale per limitare il...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Anne Daron e Pierre Louis Loyher per l'assistenza editoriale, il Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) per l'assistenza con il microscopio a due fotoni e Facility animale "NAC" e Camille Baudesson per topi allevamento assistenza. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7 / 2007-2013), contratto di sovvenzione n ° 304810 - RAID, e n ° 241440-Endostem, da Inserm, da Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", da la" Ligue contre le cancer ", da" Association pour la Recherche sur le Cancer "e da" Agence Nationale de la Recherche "Programma Emersione 2012 (ANR-EMMA-050). PH è stata sostenuta da la "Ligue contre le cancer".

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
KetaminMerial100 mg/ml, anestetico
XylazinBayer HealthCare10 mg/ml, anestetico
IsofluranBaxter2,5%, anestetico
O2/NO270/30 miscela, anestetico
Rhodamin-DextranInvitrogen2 MDa, 10 mg/ml, Colorazione vascolare
Ly6G-PEBecton-Dickinsonclone 1A8, colorazione dei neutrofili
Supporto stereotassico Chirurgiafatta in
Etanolo 70%chirurgia
Chirurgia sterile di forbici e tronchesi
Anellodiametro 18 mm, chirurgia
Glubran 2Queryo chirurgica, fissaggio ad anello in gomma Aghi
di piccolo calibro ChirurgiaTerumoMicroscopio
multifotone Zeiss LSM 710 NLO Microscopio Carl Zeiss
Ti:Laser a cristalli di zaffiroCoherent Chameleon Ultra140 impulsi fsec di luce NIR
Zen 2010Carl ZeissAcquistion Software
Imaris Bitplane Bitplane, tracciamento automatico 3D
PBS 1XD. Chirurgia D. Dutscher
Camera termostaticaImaging intravitaleCarl Zeiss
casa di gomma Colla medica Software di analisi

Riferimenti

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