Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Sommario

La capacità di endotelio infiammato per reclutare leucociti dal flusso è regolato da cellule stromali mesenchimali. Descriviamo due modelli in vitro che incorporano cellule umane primarie che possono essere utilizzati per valutare il reclutamento di neutrofili dal flusso e esaminare il ruolo che le cellule stromali mesenchimali svolgono nel regolare questo processo.

Abstract

Cellule stromali regolano il reclutamento dei leucociti circolanti durante l'infiammazione attraverso il cross-talk con le cellule endoteliali vicine. Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" in per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti dalla portata dalle cellule endoteliali infiammate. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiare il ruolo delle cellule stromali, in questo caso le cellule staminali mesenchimali (MSC), nel regolare il reclutamento dei leucociti.

Cellule endoteliali primarie sono state coltivate solo o insieme con MSC umana in contatto diretto sulla microslides Ibidi o su lati opposti di un filtro Transwell per 24 ore. Le colture sono state stimolate con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) per 4 ore e incorporati in un saggio di adesione a base di flusso. Un bolo di neutrofili è stato perfusosopra l'endotelio per 4 min. La cattura di fluire neutrofili e le loro interazioni con l'endotelio è stata visualizzata mediante microscopia in contrasto di fase.

In entrambi i modelli, citochine stimolazione aumentata endoteliale reclutamento di neutrofili scorre in modo dose-dipendente. Analisi del comportamento di neutrofili reclutati mostrato una riduzione dose-dipendente in rotolamento e un aumento dose-dipendente nella trasmigrazione attraverso l'endotelio. In co-coltura, MSC soppresso neutrofili all'endotelio TNF-stimolata.

I nostri modelli a base di adesione flusso imitano le fasi iniziali di reclutamento dei leucociti dalla circolazione. Oltre a leucociti, possono essere utilizzati per esaminare il reclutamento di altri tipi di cellule, come le cellule tumorali circolanti MSC o terapeuticamente somministrati. I nostri modelli di co-coltura multistrato hanno dimostrato che MSC comunicare con endotelio di modificare la loro risposta a citochine pro-infiammatorie, Altering il reclutamento dei neutrofili. Sono necessarie ulteriori ricerche utilizzando tali modelli per comprendere appieno le cellule stromali come di diversi tessuti e condizioni (malattie infiammatorie o il cancro) influenzano il reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione.

Introduzione

L'infiammazione è una risposta protettiva alle infezioni microbiche o lesioni dei tessuti che richiede stretta regolamentazione dell'entrata dei leucociti e l'uscita dal tessuto infiammato per consentire la risoluzione ^1,2. Cross-talk tra cellule endoteliali (EC) che i vasi sanguigni linea, leucociti circolanti e cellule stromali tessuti residente è essenziale per coordinare questo processo ^3. Tuttavia, l'assunzione incontrollata di leucociti e loro liquidazione inefficace alla base dello sviluppo delle malattie infiammatorie croniche ^4. La nostra attuale comprensione del reclutamento dei leucociti in salute e malattia....

Protocollo

1. Isolamento e la coltura di cellule endoteliali umane primarie e cellule staminali mesenchimali

1. Cellule isolamento e la coltura di umane ombelicali endoteliali vena (HUVEC):
   1. Mettere cordone ombelicale su un vassoio con carta assorbente e spruzzare con il 70% di etanolo. Mettere in una cappa coltura tissutale. Identificare la vena e cannulate ad entrambe le estremità. Posizionare una fascetta intorno alla fine cannulata per fissarlo.
   2. Lavare sangue venoso con PBS usando una siringa. Riempire la siringa con l'aria e passare attraverso la vena per rimuovere ed eliminare il residuo PBS.
   3. Scongelare 10 mg / ml di collagenasi tip....

Risultati

Inizialmente, abbiamo analizzato l'effetto di stimolare CE con TNF sul reclutamento di neutrofili dal flusso utilizzando il modello MicroSlide Ibidi (Sezione 7 - 9). In assenza di TNFa, poca o nessuna neutrofili rispettate monostrato endoteliale (Figura 2A). Questo è stato previsto, come non trattata / riposo CE non esprimono le molecole necessarie adesione (selectine) o chemochine per sostenere vincolante ^25,26. Al contrario, citochine stimolazione aumentato significativ.......

Discussione

Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" in per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti da endotelio infiammata. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Abbiamo già osservato un aumento dose-dipendente in neutrofili adesione e la trasmigrazione attraverso TNF-stimolata CE ^9,29. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiare g.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagenasi Tipo Ia	Sigma	C2674	Diluire in 10 ml di PBS per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/ml. Conservare a -20 gradi C in aliquote da 1 ml.
Sigma	D8662	di Dulbecco	con cloruro di calcio e magnesio. Conservare sterile e conservare presso RT.
1X medio M199	Gibco	31150-022	caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
Gentamicina solfato	Sigma	G1397	Conservare a 4 °C. Aggiungere al flacone M199 da 500 ml.
Fattore di crescita epidermico umano	Sigma	E9644	Conservare a -20 C su 10 µ l aliquote.
Siero fetale di vitello (FCS)	Sigma	F9665	FCS deve essere testato in batch per garantire la crescita e la vitalità dell'EC isolata. Inattivare il calore a 56 °C. Conservare in aliquote da 10 ml a -20 °C.
Amfotericina B	Gibco	15290-026	Potente e diventa tossico entro una settimana, quindi il terreno HUVEC completo fresco deve essere preparato ogni settimana. Conservare a -20 ° C in aliquote da 1 ml.
L'idrocortisone	Sigma	H0135	Stock è in etanolo. Conservare a -20 ° C su 10 µ l aliquote.
Collagenasi Tipo II	Sigma	C6885	Diluire il brodo in PBS ad una concentrazione finale di 100 mg/ml. Conservare a -20 gradi C su 100 µ l aliquote.
Ialuronidasi	Sigma	H3631	Diluire il brodo in PBS fino a una concentrazione finale di 20.000 U/ml. Conservare a -20 gradi; C su 100 µ l aliquote.
100 µ Filtro cellulare m per provetta centifuga da 50 ml	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Possono essere utilizzati anche altri filtri cellulari disponibili in commercio (ad es. Greiner bio-one).
DMEM a basso contenuto di glucosio	Biosera	LM-D1102/500	Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
Mix di penicillina/streptomicina	Sigma	P4333	Conservare a -20 C in aliquote da 1 ml.
Pallone per coltura tissutale da 25 cc	SLS	353109
Pallone per coltura tissutale da 75 cc	SLS	353136
Fiala di cellule staminali mesenchimali per midollo osseo	Lonza	PT-2501	Conservare in azoto liquido all'arrivo. Le celle si trovano al passaggio 2 all'arrivo, ma sono designate come passaggio 0. Passare al passaggio 3 e conservare in azoto liquido per un uso successivo.
Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso. Per la colorazione verde Cell Tracker utilizzare un mezzo senza FCS.
Soluzione EDTA (0,02%)	Sigma	E8008	Conservare a 4 °C. Caldo a 37 °C. C bagnomaria prima dell'uso.
Soluzione di tripsina	Sigma	T4424	Conservare a -20 C in aliquote da 2 ml. Scongelare a RT e utilizzare immediatamente.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Conservare in ghiaccio prima di aggiungere prima di aggiungere la sospensione cellulare.
Mr. Frosty Congelamento Contenitore	Nalgene	5100-0001	Negozio presso RT. Quando si aggiungono crioviali con celle conservare a -80 ° C per 24 ore prima di trasferire le cellule in azoto liquido.
Ibidi u-Slide VI (0,4), trattato con T/C, sterile	Ibidi	IB-80606	I modelli alternativi includono capillari in vetro, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), piastre BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) e camere di flusso a piastre parallele GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker colorante verde Life	technologies	C2925	Negozio in 5 µ l. aliquote a -20 °C. Diluire in 5 ml preriscaldato (a 37 °C; C) MSCGM.
Camere di conteggio delle cellule	Nexcelom	SD-100	In alternativa è possibile utilizzare un emocitometro.
Cellometro contatore automatico di cellule T4	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Fattore di necrosi tumorale & alfa; (TNFα)	R& D Systems	210-TA-100	Diluire il materiale in PBS fino a una concentrazione finale di 100.000 U/ml. Conservare a -80 gradi C su 10 µ l aliquote.
6 pozzetti, 0,4 &; micro; m Filtri Transwell in PET	SLS	353090
K2-EDTA in tubi da 10 ml	Sarstedt		Store presso RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Conservare a 4 °C. Riscaldare a RT prima dell'uso.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Conservare a 4 °C. Riscaldare a RT prima dell'uso.
Tubo a fondo tondo da 10 ml	Appleton Woods	SC211 142 AS
7,5% BSA Frazione V soluzione	Life technologies	15260-037	Conservare a 4 °C.
Siringhe Plastipak da 20 ml 300613
siringhe Plastipak da 5 ml Siringhe	BD falcon	302187
Siringhe Plastipak da 2 ml BD	falcon	300185
Nastro chirurgico ipoallergenico 3M 9 m x 2,5 cm	Micropore	1530-1	Utilizzare per fissare il rubinetto della siringa sulla parete della camera in perspex.
Tubo in gomma siliconica, diametro interno/diametro esterno (ID/OD) di 1/3 mm (tubo sottile)	Fisher Scientific	FB68854	Tagliare il tubo in silicone alla dimensione appropriata. Tutti i tubi che portano direttamente alla microvalvola elettronica devono essere sottili.
Tubo in gomma siliconica ID/OD di 2/4 mm (tubo spesso)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line	Tubo Smiths	200/495/200	Tubo che porta alla pompa a siringa.
Rubinetto a 3 vie	BOC Ohmeda AB
Siringa in vetro da 50 ml per pompa	Popper Micromate	550962	Deve essere adescato prima dell'uso rimuovendo eventuali bolle d'aria.
Vetrino coprioggetti	Raymond A Lamb		26 x 76 mm vetrini coprioggetti su ordinazione. Numero di lotto 2440980.
Guarnizione in parafilm	American National Can Company		Tagliare un pezzo di parafilm di 26 x 76 mm utilizzando una dima di alluminio e tagliare una fessura di 20 x 4 mm utilizzando un bisturi 10a. Lo spessore della guarnizione è di circa 133 µm.
Due piastre parallele in perspex	Wolfson Applied Technology Laboratory		Camera appositamente progettata composta da piastre parallele tenute insieme da 8 viti. La piastra inferiore ha una fessura di visualizzazione ritagliata al centro e un incavo poco profondo fresato per lasciare spazio per il vetrino coprioggetti, il filtro e la guarnizione. La piastra superiore in perspex ha un foro di ingresso e uscita posizionato sopra il canale di flusso.
Microvalvola elettronica a 3 vie con spazio morto minimo	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Collegato elettronicamente a un'alimentazione a 12 volt CC.
Pompa a siringa per infusione/prelievo (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Impostare il diametro su 29 mm e la velocità di riempimento (flusso).
Connettore a forma di L	Labhut	LE876	Da collegare alle porte di ingresso e uscita sul canale microslide Ibidi.
Videocamera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Collegata a un computer che consente la registrazione di video digitali.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	Per l'analisi dei dati. Contrassegna manualmente le celle che mostrano i diversi comportamenti. Tracciare le celle per l'analisi delle velocità di rotolamento e migrazione.
Fare riferimento alle schede tecniche dei prodotti per i dettagli sui rischi derivanti dall'uso dei reagenti descritti qui.

PBS Tubo manometro