Articolo metodologico

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

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DOI:

10.3791/52480

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7 gennaio 2015

 ,  ,  , 
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

In questo articolo

Sommario

La capacità di endotelio infiammato per reclutare leucociti dal flusso è regolato da cellule stromali mesenchimali. Descriviamo due modelli in vitro che incorporano cellule umane primarie che possono essere utilizzati per valutare il reclutamento di neutrofili dal flusso e esaminare il ruolo che le cellule stromali mesenchimali svolgono nel regolare questo processo.

Abstract

Cellule stromali regolano il reclutamento dei leucociti circolanti durante l'infiammazione attraverso il cross-talk con le cellule endoteliali vicine. Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" in per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti dalla portata dalle cellule endoteliali infiammate. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiare il ruolo delle cellule stromali, in questo caso le cellule staminali mesenchimali (MSC), nel regolare il reclutamento dei leucociti.

Cellule endoteliali primarie sono state coltivate solo o insieme con MSC umana in contatto diretto sulla microslides Ibidi o su lati opposti di un filtro Transwell per 24 ore. Le colture sono state stimolate con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) per 4 ore e incorporati in un saggio di adesione a base di flusso. Un bolo di neutrofili è stato perfusosopra l'endotelio per 4 min. La cattura di fluire neutrofili e le loro interazioni con l'endotelio è stata visualizzata mediante microscopia in contrasto di fase.

In entrambi i modelli, citochine stimolazione aumentata endoteliale reclutamento di neutrofili scorre in modo dose-dipendente. Analisi del comportamento di neutrofili reclutati mostrato una riduzione dose-dipendente in rotolamento e un aumento dose-dipendente nella trasmigrazione attraverso l'endotelio. In co-coltura, MSC soppresso neutrofili all'endotelio TNF-stimolata.

I nostri modelli a base di adesione flusso imitano le fasi iniziali di reclutamento dei leucociti dalla circolazione. Oltre a leucociti, possono essere utilizzati per esaminare il reclutamento di altri tipi di cellule, come le cellule tumorali circolanti MSC o terapeuticamente somministrati. I nostri modelli di co-coltura multistrato hanno dimostrato che MSC comunicare con endotelio di modificare la loro risposta a citochine pro-infiammatorie, Altering il reclutamento dei neutrofili. Sono necessarie ulteriori ricerche utilizzando tali modelli per comprendere appieno le cellule stromali come di diversi tessuti e condizioni (malattie infiammatorie o il cancro) influenzano il reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione.

Introduzione

L'infiammazione è una risposta protettiva alle infezioni microbiche o lesioni dei tessuti che richiede stretta regolamentazione dell'entrata dei leucociti e l'uscita dal tessuto infiammato per consentire la risoluzione 1,2. Cross-talk tra cellule endoteliali (EC) che i vasi sanguigni linea, leucociti circolanti e cellule stromali tessuti residente è essenziale per coordinare questo processo 3. Tuttavia, l'assunzione incontrollata di leucociti e loro liquidazione inefficace alla base dello sviluppo delle malattie infiammatorie croniche 4. La nostra attuale comprensione del reclutamento dei leucociti in salute e malattia è insufficiente e sono necessari modelli più robusti per analizzare questo processo.

I meccanismi di sostegno al reclutamento dei leucociti dal sangue attraverso CE vascolare in venule post-capillari sono stati ben descritti 1,2,5. Leucociti circolanti vengono catturati dai recettori specializzati (ad esempio, VCAM-1, E-selectina, P-selectina) chesono up-regolati su endotelio infiammata. Queste interazioni transitorie consentono leucociti di interagire con chemochine superficie vincolata e mediatori lipidici di derivazione (o endoteliali o stromali in origine) che attivano integrine espresse dai leucociti 6- 11. Questo a sua volta stabilizza adesione e le unità di migrazione attraverso l'endotelio e nel tessuto 12- 15. All'interno del tessuto, reclutati leucociti sono sottoposti a agenti stromali di derivazione che influenzano la loro motilità, funzione e la sopravvivenza 16,17. Una crescente evidenza suggerisce fortemente che i segnali ricevuti in ogni fase delle condizioni di processo di reclutamento dei leucociti per il prossimo. Tuttavia, la nostra comprensione di reclutamento dei leucociti rimane incompleto e molto poco si sa circa il movimento dei leucociti componenti shaping all'interno del tessuto.

In Birmingham abbiamo sviluppato diversi modelli in vitro "vascolari" per studiare il reclutamento dei leucociti daflusso 9,18,19. Ora capiamo che vascolare atto CE per quanto immediati regolatori di reclutamento dei leucociti rispondere ai cambiamenti nel loro microambiente locale. In particolare, le cellule stromali tessuti residenti possono regolare attivamente la risposta infiammatoria, in parte conversando con i paesi limitrofi CE vascolare di influenzare il loro ruolo nel reclutamento 3. Abbiamo precedentemente dimostrato che varie cellule stromali modulano la capacità di CE di sostenere l'adesione e la migrazione di leucociti in modo tessuto-specifico, e che tali effetti diventare alterato nelle malattie croniche 13,16,20,21. Così, le cellule stromali stabilire tessuto 'indirizzo codici "che definiscono il contesto di ogni risposta infiammatoria 22. Più recentemente, abbiamo dimostrato che il midollo osseo derivate MSC (BMMSC) potentemente down-regolare la risposta della CE alle citochine, portando ad una riduzione del reclutamento di neutrofili e linfociti 23.

I meccanismi govErning reclutamento chiarito in vitro hanno in gran parte utilizzato dosaggi incorporano un tipo singola cella (ad esempio, CE) o proteine ​​in isolamento. Tuttavia, questi studi non prendono in considerazione gli effetti dell'ambiente tessuto locale (cioè, la presenza di cellule stromali) sul reclutamento dei leucociti e la loro successiva migrazione nel tessuto. Qui si descrivono due metodi basati sul flusso in cui le cellule stromali, in particolare le cellule staminali mesenchimali (MSC), sono co-coltura con EC 23. Tali modelli consentono di esaminare l'effetto delle cellule stromali sulle risposte endoteliali, in particolare la loro capacità di sostenere il reclutamento dei leucociti dal flusso.

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Protocollo

1. Isolamento e la coltura di cellule endoteliali umane primarie e cellule staminali mesenchimali

  1. Cellule isolamento e la coltura di umane ombelicali endoteliali vena (HUVEC):
    1. Mettere cordone ombelicale su un vassoio con carta assorbente e spruzzare con il 70% di etanolo. Mettere in una cappa coltura tissutale. Identificare la vena e cannulate ad entrambe le estremità. Posizionare una fascetta intorno alla fine cannulata per fissarlo.
    2. Lavare sangue venoso con PBS usando una siringa. Riempire la siringa con l'aria e passare attraverso la vena per rimuovere ed eliminare il residuo PBS.
    3. Scongelare 10 mg / ml di collagenasi tipo Ia e diluire 1:10 in PBS (con calcio e cloruro di magnesio) ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Passare soluzione di collagenasi nella vena finché entrambe cannule sono riempiti. Chiudere i morsetti di cannule ad entrambe le estremità.
    4. Coprire il vassoio con il tessuto e spruzzare con il 70% di etanolo. Posizionare il cavo in un incubatore per 20 minuti a 37 ° C e 5% CO 2.
    5. Prendere il cavo fuoridell'incubatore e stringere fascette. Massaggiare il cavo delicatamente per 1 min. Lavare la sospensione cellulare con 10 ml di PBS e raccogliere in una provetta da centrifuga da 50 ml.
    6. Riempire la siringa con l'aria e passare attraverso la vena per rimuovere eventuali residui PBS due volte, raccogliendo il PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml utilizzato nel passaggio 1.1.5. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    7. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 1 ml completo di media CE. Mezzo CE consiste di M199 supplementato con 35 mg / ml gentamicina solfato, 10 ng / ml fattore di crescita epidermico umano, 1 mg / ml idrocortisone, 2,5 ug / ml di amfotericina B, e siero fetale bovino 20%.
    8. Aggiungere 4 ml di terreno CE e la sospensione CE ad una beuta da 25 cm 2. Modificare il supporto il giorno successivo e poi ogni 2 giorni.
    9. CE presentano una morfologia ciottoli-simile (Figura 1AI). Per i saggi di adesione, CE sono generalmente seminato quando raggiungono il 100% di confluenza (vedere Sezione 1.4 ).
  2. L'isolamento di cellule staminali mesenchimali gelatina di Wharton (WJMSC) da cordoni ombelicali umani:
    1. Isolare gelatina di derivazione MSC di Wharton (WJMSC) da cordoni ombelicali fresche o da cavi che sono già stati utilizzati per isolare CE. Tagliare il cordone ombelicale in 5 cm di lunghezza pezzi. Tagliare ogni pezzo longitudinalmente per rivelare i vasi sanguigni (arterie 2 [bianche, rigida] e 1 vena [giallo, distesa]).
    2. Utilizzando forbici sterili e pinze rimuovere i vasi sanguigni e scartare. Tagliare tutto il tessuto in 2 - 3 mm3 pezzi. Utilizzando pinze posto 2-3 mm 3 pezzi in una provetta da centrifuga da 50 ml.
    3. Scongelare 100 mg / ml di collagenasi di tipo II magazzino e diluite 1: 100 in 10 ml di PBS ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Scongelare 20.000 U / ml di brodo ialuronidasi e diluire 1: 400 ad una concentrazione finale di 50 U / ml in soluzione di collagenasi.
    4. Aggiungere cocktail enzimatica nella provetta da centrifuga contenente i frammenti di tessuto. Incubare le frammentazione del tessutots per 5 ore a 37 ° C su un rotatore lenta.
    5. Diluire la sospensione cellulare 1: 5 in PBS. Inserire un filtro 100 micron pori in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Versare la sospensione cellulare sul filtro pori 100 micron.
      NOTA: frammenti di tessuto rimanente verrà trattenuto sul filtro e le cellule saranno raccolti nel tubo 50ml centrifuga.
    6. Eliminare il filtro. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 10 min a RT. Aspirare il surnatante e risospendere WJMSC pellet in 12 ml di mezzo completo di coltura WJMSC (DMEM bassa di glucosio, il 10% FCS e 100 U / ml di penicillina + 100 mg / ml di streptomicina mix).
    7. Seed tutte le cellule in 75 cm 2 tessuti pallone di coltura. Cambiare il medio dopo 24 ore con 12 ml di mezzo completo di coltura WJMSC. Sostituire media ogni 2 - 3 giorni. Le cellule devono raggiungere il 70 - 80% confluenza entro 2 settimane. Passage quando WJMSC raggiungere il 70 - 80% di confluenza (vedi Sezione 1.4).
  3. Espansione di midollo osseo derivate da MSC (BMMSC):
    1. Isolare umana MSC midollo osseo (BMMSC) come descritto in precedenza 24. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato medio di crescita MSC (MSCGM) in una provetta da centrifuga da 15 ml.
    2. Scongelare una fiala di p2 BMMSC mettendo in un bagno d'acqua a 37 ° per 2 minuti. Aggiungere la sospensione BMMSC alla provetta contenente MSCGM. Mescolare bene pipettando.
    3. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante completamente.
    4. Risospendere le cellule in 1 ml MSCGM e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule digitale come un cellometer.
    5. Cellule seme in 75 centimetri 2 fiasche coltura ad una densità di 5.000 - 6.000 cellule per cm 2 in 12 ml MSCGM. Cambiare il medio dopo 24 ore con 12 ml MSCGM. Le cellule di alimentazione con 12 ml MSCGM ogni 2 - 3 giorni.
    6. Passage quando BMMSC raggiungere il 70 - 80% di confluenza (vedi Sezione 1.4). Le cellule presentano una morfologia fibroblastico (Figura 1Aii).
  4. Distacco di CE e MSC:
    1. Aspirare media da 25 cm 2 palloni di coltura. Aggiungere 2 ml di 0,02% EDTA per circa 2 min. Aspirare EDTA e aggiungere 2 ml di tripsina (2,5 mg / ml). Vista al microscopio fino a quando le cellule diventano round.
    2. Toccare il pallone per staccare le cellule. Disattivare la tripsina aggiungendo terreno di coltura 8 ml (a seconda del tipo di cellula, media CE per HUVEC, DMEM LG per WJMSC e MSCGM per BMMSC) al pallone cultura e la sospensione trasferimento in una provetta da centrifuga da 15 ml.
    3. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet come descritto di seguito.
      1. Per passaging di MSC, risospendere pellet in 3 ml terreno di coltura. Aggiungere 11 ml di terreno di coltura in tre distinti 75 centimetri 2 fiasche di coltura. Aggiungi sospensione cellulare 1 ml di ogni pallone di coltura (1: 3 split). Passage WJMSC e BMMSC 3 volte (P3) prima dell'utilizzo in saggi di co-coltura.
      2. Per seeding CE o MSC in saggi di adesione - vedi sezioni 2 e 3.
  5. MSC congelamento:
    1. Al passaggio 3 Staccare MSC come descritto nella Sezione 1.4. Aspirare il surnatante e risospendere in 3 ml ghiacciata CryoSFM. Dispensare 1 ml della sospensione cellulare in 1,5 ml cryovials gelide. Mettere cryovials in un contenitore di congelamento.
    2. Conservare il contenitore a -80 ° CO / N. Trasferimento azoto liquido. Flacone Thaw di MSC (seguire i passaggi 1.3.1 - 1.3.6). Risospendere MSC in 5 ml terreno di coltura (scegliere terreno adeguato per WJMSC o BMMSC) e le sementi in un pallone a 25 cm2.

2. Stabilire Stem Cell Co-culture-Endothelial mesenchimali on Ibidi Microslides

  1. Trypsinize un cm 2 fiasco di CE confluenti 25 (~ 1,5 x 10 6 cellule, come sezione 1.4). Risospendere CE in 380 ml ​​MSCGM (1 x 25 cm 2 pallone seminerà due microslides 6 canali Ibidi (~ 1,25 x 10 5 / canale), per tutti i saggi di adesione ty cellularepes sono coltivate in MSCGM). Aggiungere 30 ml di sospensione CE per ciascun canale (questo coprirà l'area di crescita attraverso l'azione capillare). Incubare Ibidi MicroSlide a 37 ° C e 5% CO 2 per 1 ora.
  2. Aggiungere 140 microlitri MSCGM per ogni canale e quindi aspirare via. Ripetere due volte per un totale di 3 lavaggi. Aggiungere 140 microlitri MSCGM e posto in incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 ore.
  3. Per co-colture staccare MSC (Sezione 1.4). Eseguire un conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o un cellometer. Regolare la concentrazione di MSC di 1,5 x 10 5 cellule / ml.
  4. Aspirare eccesso medio dai canali Ibidi (lasciando solo la zona di crescita del canale in media). Aggiungere 30μl di MSC sospensione ai canali Ibidi. Aspirare il mezzo che è stato espulso dalla zona crescita del canale e aggiungere altri 30 ml di sospensione MSC. Ripetere ancora una volta e poi posizionare il MicroSlide Ibidi in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 </ Sub> per 1 ora.
  5. Aggiungere 140 microlitri MSCGM per ogni canale e quindi aspirare via. Ripetere due volte per un totale di 3 lavaggi. Aggiungere un volume finale di 140 microlitri MSCGM a ciascun canale e posto in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore.
  6. Scongelare 1 x 10 5 U / ml magazzino TNFa e diluito 1: 1000 in MSCGM ad una concentrazione finale di 100 U / ml (equivalente a ~ 10 ng / ml). Eseguire una diluizione seriale diluendo 100 U / ml TNF da 1:10 in MSCGM per ottenere 10 U / ml. Diluire 10 U / ml TNFa da 1:10 in MSCGM per ottenere 1 U / ml.
  7. Trattare canali con TNFa a 37 ° C per 4 ore prima del test. Variazioni di temperatura durante il trattamento citochina altereranno i modelli di reclutamento dei neutrofili osservati. Aggiungi MSCGM fresco ai canali non trattati.

3. Stabilire endoteliale-Cellule staminali mesenchimali da co-colture su Filtri

  1. Staccare WJ o BMMSC come descritto nella Sezione 1.4. Risospendere il pelletin 1 ml MSCGM. Eseguire un cellule conta delle cellule utilizzando un emocitometro o un cellometer.
  2. Regolare il volume in modo che la concentrazione finale è di 5 x 10 5 MSC in 500 ml di MSCGM.
  3. Con pinza sterile invertono 6-bene, 0,4 micron filtri PET Transwell e posto in una scatola sterile.
  4. Seme 5 x 10 5 MSC sulla superficie esterna dei filtri. Incubare filtri a 37 ° C e 5% CO 2 per 1 ora.
  5. Raccogliere supporti dalla superficie esterna del filtro. Contare il numero di non-aderenti MSC nei media. Re-invertito filtri utilizzando una pinza sterile e posto in un 6-pozzetti corrispondenza contenente 3 ml MSCGM.
  6. Aggiungere 2 ml di MSCGM sulla superficie interna del filtro (Figura 1B). Inserire in termostato a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore. Trypsinize un cm 2 fiasco di CE confluenti 25 (Figura 1AI, come sezione 1.4).
  7. Risospendere CE in 8 ml MSCGM (1 x 25 centimetri 2 fiasco wiseme ll quattro filtri 6 pozzetti; ~ 5 x 10 5 EC / filtro). Aspirare il terreno dalla parte superiore e inferiore dei filtri porosi. Aggiungere MSCGM 3 ml fresche nella camera inferiore (sotto il filtro). Aggiungere 2 ml di sospensione CE alla superficie interna di ciascun filtro. Incubare per 1 ora a 37 ° C e 5% CO 2.
  8. Aspirare medio lavare non aderente CE e sostituirlo con fresco MSCGM. Impostare filtri mono-cultura CE parallele seminando le cellule sulla superficie interna senza prima MSC seeding. Incubare O / N a 37 ° C e 5% CO 2.
  9. Controllare che il monostrato CE è confluente e non contiene spazi vuoti. Sub-monostrati confluenti non possono essere utilizzate per saggi di adesione (Figura 1B).
  10. Trattare le camere superiori e inferiori dei filtri con 1, 10, o 100 U / ml TNFa (equivalente a ~ 10 ng / ml) a 37 ° C per 4 ore prima del test (descritto nella Sezione 2).

4. Isolamento dei leucociti

  1. Prendere venososangue di volontari sani e un'aliquota immediatamente in provette EDTA. Tubi capovolgere delicatamente per mescolare.
  2. Layer 2,5 ml HISTOPAQUE 1077 sul 2,5 ml Histopaque 1119 in un 10 ml a fondo tondo tubo. Layer 5 ml di sangue intero sul gradiente Histopaque. Centrifugare a 800 xg per 40 minuti a temperatura ambiente.
  3. Harvest neutrofili periferici polimorfonucleati (PMN) all'interfaccia di Histopaque 1077 e il 1119 (al di sopra del livello di eritrociti). Mettere in un 10 ml a fondo arrotondato da tubo e portare a 10 ml con PBSA. Capovolgere delicatamente provetta e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Diluire 7,5% soluzione BSA 1:50 100 ml PBS (con calcio e cloruro di magnesio) ad una concentrazione finale di 0,15% (w / v; PBSA). Aspirare il surnatante e risospendere in 10 ml PBSA. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Risospendere in 1 ml PBSA. Prendete una un'aliquota 20 microlitri di sospensione cellulare e aggiungere 380 microlitri PBSA (diluizione 1:20). Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un cellometer. Diluire il conce richiestantration (1 x 10 6 / ml per i filtri Transwell e Ibidi MicroSlide) in PBSA. Mantenere la sospensione dei neutrofili al RT fino al dosaggio.

5. Montaggio del Flow System

  1. Impostare il sistema di flusso come illustrato nella Figura 1C. Accendere il riscaldatore e impostare a 37 ° C. Attaccare una siringa da 20 ml (rimuovere lo stantuffo) e una siringa da 5 ml di un rubinetto a 3 vie. Attaccare il rubinetto alla camera Perspex con del nastro Micropore.
  2. Misurare e tagliare un lungo pezzo di silicio 2/4 mm (spessore) tubo che è circa la distanza tra la valvola e il rubinetto a 3 vie. Tagliare un 8 - lungo pezzo di 1/3 mm (sottile) tubo 10 mm e inserire in una estremità del tubo di spessore. Fissare il lato tubo di spessore sul 3-way rubinetto.
  3. Collegare l'estremità tubo sottile su una porta del elettronica microvalvola 3 vie. Questo è il "serbatoio di lavaggio". Tagliare un 6 - lungo pezzo di tubo spessi e sottili 8 mm.
  4. Inserire il tubo sottile in un'estremità del tubo di spessore. AttACH fine il tubo di spessore su una siringa da 2 ml (togliere il pistone).
  5. Collegare l'estremità tubo sottile della siringa 2 ml su una porta del microvalvola elettronica per rendere il "serbatoio campione". Collegare la valvola alla camera di flusso del filtro misurando e tagliando un lungo pezzo di tubo sottile che è la distanza tra il microvalvola e il centro del palco microscopio.
  6. Per il modello MicroSlide, collegare un 8 - mm pezzo di tubatura in 10 alla estremità del tubo sottile. Inserire un connettore a forma di L alla estremità del tubo di spessore. Ciò si connetterà al MicroSlide. Per il modello di filtro, collegare un 8 - mm pezzo di Portex Blue Line manometro 10 il collegamento di tubi alla estremità del tubo sottile.
  7. Posizionare l'estremità del tubo sottile sul microvalvola. Questa è l'uscita comune per il lavaggio e campione serbatoi. Riempire serbatoi con PBSA. Tubi Prime scorrendo PBSA attraverso di loro per eliminare eventuali bolle d'aria.
  8. Collegare il tubo manometro per 29 mm (50 ml) di vetro syringe. Prime la siringa riempiendo con 10 ml PBSA. Invertire la siringa in modo che l'estremità collegata al tubo rivolta verso l'alto e spingere fuori tutte le bolle d'aria. Riempire con 5 ml PBSA.
  9. Per solo il modello MicroSlide, collegare un 10 - piece 12 mm tubo di spessore alla estremità del tubo manometro porta alla siringa di vetro. Inserire un connettore a forma di L sulla estremità del tubo di spessore. Posizionare la siringa di vetro in una pompa a siringa per infusione / ritiro.
  10. Calcolare la portata di ricarica (Q) necessaria per generare la tensione di taglio parete desiderata (τ w in Pascal, Pa) di 0,1 (filtri Transwell) Pa o 0,05 (microslides Ibidi) Pa utilizzando le seguenti formule:
    γ w = (6.Q) / (wh 2)
    τ = n.γ
    Dove larghezza w = interna ed h = profondità interna del canale di flusso. n = viscosità della soluzione scorrevole; PBSA è n = 0.7 mPa.s. Per la camera di flusso filtro a piastra parallela, la larghezza (w) è di 4 mm e la profondità (h) è 0,133 millimetri. Il depth della camera può variare leggermente a causa di differenze di spessore della guarnizione Parafilm utilizzato. Per il MicroSlide Ibidi, la larghezza è di 3,8 mm e la profondità è di 0,4 mm.
    NOTA: A causa delle differenze nelle dimensioni del canale di flusso, e la dinamica di acquisizione usiamo diverse sollecitazioni di taglio per il modello MicroSlide rispetto al modello di filtro 6.

6. Installazione della piastra Parallel camera di flusso Incorporando Filtri

  1. Tagliare un pezzo di Parafilm (le stesse dimensioni coprioggetto vetro) utilizzando un modello di metallo. Tagliare una fessura 20 x 4 mm nella Parafilm (per creare il canale di flusso) utilizzando un modello di metallo. Utilizzare la guarnizione per contrassegnare il canale di flusso sul vetrino di vetro.
  2. Allineare i bordi del filtro 6 pozzetti sul vetrino di vetro. Assicurarsi che il filtro copre le segnale per i canali di flusso. Asportare accuratamente il filtro con un bisturi di tipo 10A.
  3. Coprire con cura il filtro con una guarnizione Parafilm, assicurando che il canale di flussoslot è nel mezzo del filtro (Figura 1D). Usare un pezzo di panno pulito e spingere fuori tutte le bolle.
  4. Posizionare il coprioggetto nella cavità della piastra inferiore della camera di flusso Perspex. Posizionare la piastra superiore Perspex sopra la parte superiore della guarnizione ed avvitare le piastre insieme (Figura 1D).
  5. Girare il rubinetto a 3 vie per consentire tampone di lavaggio (PBSA) di fluire attraverso la valvola. Collegare il tubo Manometro alla porta di ingresso della piastra Persex superiore. Eseguire PBSA attraverso il canale di flusso per consentire il passaggio di bolle.
  6. Collegare il tubo manometro dalla pompa a siringa nella porta di uscita della piastra Perspex. Impostare la pompa a siringa per riempire e premere run. Pulire qualsiasi PBSA che ha gocciolato sulla piastra superiore della camera.
  7. Posizionare la camera sul palco di un microscopio invertito a contrasto di fase. Regolare la messa a fuoco per visualizzare il CE sopra i filtri (Figura 1B).

7. Impostazione Microslides per flusso

  1. Posizionare il MicroSlide sul palco di un microscopio a contrasto di fase invertito. Collegare il connettore a L nella porta di ingresso di un canale. Eseguire PBSA attraverso il canale di flusso.
  2. Posizionare il connettore a forma L dalla pompa a siringa nella porta di uscita del canale. Impostare la pompa a siringa per riempire e premere run. Pulire qualsiasi PBSA che ha gocciolato sul MicroSlide. Regolare la messa a fuoco per visualizzare il monostrato CE.

8. perfusione delle cellule endoteliali leucociti corso

  1. Mettere 2 ml di neutrofili purificati nel serbatoio del campione e lasciare scaldare per 2 min. Lavare l'endotelio con PBSA per 2 min.
  2. Girare la valvola ON per perfusione neutrofili su endotelio. Consegnare il bolo neutrofili per 4 min. Spegnere l'valvola e profumato PBSA dal serbatoio di lavaggio per il resto dell'esperimento.
  3. Assicurarsi che l'aria bolle non passano attraverso il canale di flusso in qualsiasi momento durante il test per evitare di falsare il monolay CEer e la causa il distacco di neutrofili aderenti.

9. Registrazione neutrofili Capture and Behavior

  1. Record di reclutamento dei neutrofili sia durante il flusso di neutrofili o post-perfusione.
  2. Effettuare tutte le registrazioni digitali di almeno di 5 - 10 campi al centro del canale di flusso. Identificare il centro del canale spostando l'obiettivo di bordo del canale alla luce di ingresso e identificare il centro della porta.
    1. Per la registrazione durante il flusso dei neutrofili, prendere le immagini di un singolo campo ogni 10 sec per 1 min. Spostare lungo il canale e registrare un altro campo per 1 min. Ripetere l'operazione per la durata del bolo.
    2. Per la registrazione post-perfusione, effettuare la registrazione 10 sec su 5 - su 10 campi lungo il centro del canale di flusso per valutare il comportamento dei leucociti (tipicamente 2 minuti dopo la fine del bolo neutrofili). Prendere immagini ogni secondo entro l'intervallo di 10 sec. Questo permette di tempo sufficiente per la cattura da flusso e il comportamento neutro aderentephils da analizzare.
    3. Registrazione di un singolo campo contenente almeno 10 neutrofili trasmigrato per 5 minuti, prendendo immagini ogni 30 sec. Questo può essere usato per calcolare la velocità di cellule migrate (sopra o sotto l'endotelio).
    4. Registra un'altra serie di 10 campi sec (tipicamente 9 min post-perfusione). Questo permette neutrofili tempo di migrare attraverso il monostrato endoteliale.
    5. Arrestare la pompa a siringa e rimuovere il tubo. Smontare la camera di flusso e sciacquare il serbatoio del campione e il tubo. Ripetere per filtri successivi / canali MicroSlide.

Analisi 10. di reclutamento dei leucociti e comportamento

  1. Contare il numero di neutrofili in ogni campo durante i 10 registrazioni sec al punto di tempo 2 min. Tutte le cellule devono essere presenti nel primo secondo campo per essere contati. Le cellule che sono parzialmente in campo su 2 lati (ad esempio, superiore frontiera / destra) del campo di vista sono inclusi ini conteggi, fintanto che rimangono nel campo per la piena 10 sec.
  2. Calcolare il numero medio di neutrofili aderenti per campo. Misurare la lunghezza e la larghezza del campo registrata. Calcolare l'area del campo. Calcola quanti campi ci sono in 1 mm 2. Moltiplicare la conta dei neutrofili media per il numero di campi in 1 mm 2.
  3. Calcolare il numero totale di neutrofili perfusi moltiplicando la quantità di neutrofili perfuso (ad esempio, 2 x 10 6 / ml * Q [ad esempio, 0,0999 ml / min per piastre parallele camera di flusso]) per la durata del bolo (ad esempio, 4 min ).
  4. Dividere la conta dei neutrofili / mm 2 per il numero totale di neutrofili perfusi per determinare il numero totale di cellule che hanno aderito (cellule aderenti / mm2 / 10 6 perfuso).
  5. Valutare se i neutrofili aderenti sono a rotazione, aderente o trasmigrato (Video complementare 1 e 2).
    1. Laneutrofili laminazione è fase luminosa e lentamente si muovono lungo il monostrato endoteliale (1 - 10 micron / sec; Video supplementare 1).
    2. Cellule saldamente aderenti sono fase luminose e legato alla superficie CE, sia rimanendo stazionario (cioè, non in movimento durante la registrazione) o hanno subito un cambiamento di forma e stanno migrando sulla superficie CE (Figura 1Ei).
    3. Un neutrofili trasmigrato è fase di buio e sotto il livello CE (Figura 1Eii).
  6. Calcolare la percentuale di cellule aderenti che sono a rotazione, fermo e trasmigrato. In alternativa, il comportamento dei neutrofili può essere espresso come numeri cellulari totali che presentano i diversi comportamenti applicando la stessa formula utilizzata per calcolare l'adesione totale (come descritto nei passaggi 10,6-10,7).
    1. Mark il bordo di neutrofili laminazione. Segnare il bordo anteriore della stessa cella al termine della sequenza di 10 sec. Disegnare una linea di scommessaween i punti 2 e misurare la distanza che la cella ha viaggiato.
    2. Dividere questo valore per la durata della registrazione in cui la cella è a rotazione (cioè, 10 sec). Prova e selezionare neutrofili che sono nel campo per l'intero intervallo di 10 sec.
  7. Per calcolare la velocità di neutrofili migrano sulla superficie (forma mutata luminoso fase) o sotto l'endotelio (fase di buio) utilizzare il 5 min registrazione (Video integrativa 2).
    1. Disegnare un contorno di cellule migrate all'inizio della sequenza e seguire i loro movimenti in tutta la sequenza. Rendere nota delle posizioni X e Y del centroide ad ogni intervallo di 1 minuto per ogni cella. Sottrarre valori della posizione X e Y dalla prima immagine della sequenza dei valori nella seconda immagine. Questo si basa sul teorema di Pitagora '.
    2. Sottrarre i valori della seconda immagine dalla terza immagine. Fate questo per tutte le immagini della sequenza. Piazza tha valori xey e aggiungerli insieme.
    3. Radice quadrata il valore risultante. Calcolare la velocità per ogni cella mediando le velocità calcolate a ogni intervallo minuti. Traccia 10 migrato neutrofili e calcolare la velocità media.

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Risultati

Inizialmente, abbiamo analizzato l'effetto di stimolare CE con TNF sul reclutamento di neutrofili dal flusso utilizzando il modello MicroSlide Ibidi (Sezione 7 - 9). In assenza di TNFa, poca o nessuna neutrofili rispettate monostrato endoteliale (Figura 2A). Questo è stato previsto, come non trattata / riposo CE non esprimono le molecole necessarie adesione (selectine) o chemochine per sostenere vincolante 25,26. Al contrario, citochine stimolazione aumentato significativ...

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Discussione

Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" in per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti da endotelio infiammata. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Abbiamo già osservato un aumento dose-dipendente in neutrofili adesione e la trasmigrazione attraverso TNF-stimolata CE 9,29. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiare g...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

I cordoni ombelicali sono stati raccolti con l'assistenza del Birmingham Women's Health Care NHS Trust. HMM è stato supportato da una borsa di studio per lo sviluppo della carriera nel Regno Unito per la ricerca sull'artrite (19899) e da Systems Science for Health, Università di Birmingham (5212).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi Tipo IaSigmaC2674Diluire in 10 ml di PBS per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/ml. Conservare a -20 gradi C in aliquote da 1 ml.
SigmaD8662di Dulbeccocon cloruro di calcio e magnesio. Conservare sterile e conservare presso RT.
1X medio M199Gibco31150-022caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
Gentamicina solfatoSigmaG1397Conservare a 4 °C. Aggiungere al flacone M199 da 500 ml.
Fattore di crescita epidermico umanoSigmaE9644Conservare a -20 C su 10 µ l aliquote.
Siero fetale di vitello (FCS)SigmaF9665FCS deve essere testato in batch per garantire la crescita e la vitalità dell'EC isolata. Inattivare il calore a 56 °C. Conservare in aliquote da 10 ml a -20 °C.
Amfotericina BGibco15290-026Potente e diventa tossico entro una settimana, quindi il terreno HUVEC completo fresco deve essere preparato ogni settimana. Conservare a -20 ° C in aliquote da 1 ml.
L'idrocortisoneSigmaH0135Stock è in etanolo. Conservare a -20 ° C su 10 µ l aliquote.
Collagenasi Tipo IISigmaC6885Diluire il brodo in PBS ad una concentrazione finale di 100 mg/ml. Conservare a -20 gradi C su 100 µ l aliquote.
IaluronidasiSigmaH3631Diluire il brodo in PBS fino a una concentrazione finale di 20.000 U/ml. Conservare a -20 gradi; C su 100 µ l aliquote.
100 µ Filtro cellulare m per provetta centifuga da 50 mlScientific Lab Supplies (SLS)352360Possono essere utilizzati anche altri filtri cellulari disponibili in commercio (ad es. Greiner bio-one).
DMEM a basso contenuto di glucosioBioseraLM-D1102/500Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
Mix di penicillina/streptomicinaSigmaP4333Conservare a -20 C in aliquote da 1 ml.
Pallone per coltura tissutale da 25 ccSLS353109
Pallone per coltura tissutale da 75 ccSLS353136
Fiala di cellule staminali mesenchimali per midollo osseoLonzaPT-2501Conservare in azoto liquido all'arrivo. Le celle si trovano al passaggio 2 all'arrivo, ma sono designate come passaggio 0. Passare al passaggio 3 e conservare in azoto liquido per un uso successivo.
Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (MSCGM)LonzaPT-3001Warm in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso. Per la colorazione verde Cell Tracker utilizzare un mezzo senza FCS.
Soluzione EDTA (0,02%)SigmaE8008Conservare a 4 °C. Caldo a 37 °C. C bagnomaria prima dell'uso.
Soluzione di tripsinaSigmaT4424Conservare a -20 C in aliquote da 2 ml. Scongelare a RT e utilizzare immediatamente.
CryovialsGreiner bio-one2019-02Conservare in ghiaccio prima di aggiungere prima di aggiungere la sospensione cellulare.
Mr. Frosty Congelamento ContenitoreNalgene5100-0001Negozio presso RT. Quando si aggiungono crioviali con celle conservare a -80 ° C per 24 ore prima di trasferire le cellule in azoto liquido.
Ibidi u-Slide VI (0,4), trattato con T/C, sterileIbidiIB-80606I modelli alternativi includono capillari in vetro, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), piastre BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) e camere di flusso a piastre parallele GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker colorante verde LifetechnologiesC2925Negozio in 5 µ l. aliquote a -20 °C. Diluire in 5 ml preriscaldato (a 37 °C; C) MSCGM.
Camere di conteggio delle celluleNexcelomSD-100In alternativa è possibile utilizzare un emocitometro.
Cellometro contatore automatico di cellule T4NexcelomAuto T4-203-0238
Fattore di necrosi tumorale & alfa; (TNFα)R& D Systems210-TA-100Diluire il materiale in PBS fino a una concentrazione finale di 100.000 U/ml. Conservare a -80 gradi C su 10 µ l aliquote.
6 pozzetti, 0,4 &; micro; m Filtri Transwell in PETSLS353090
K2-EDTA in tubi da 10 mlSarstedtStore presso RT.
Histopaque 1119Sigma11191Conservare a 4 °C. Riscaldare a RT prima dell'uso.
Histopaque 1077Sigma10771Conservare a 4 °C. Riscaldare a RT prima dell'uso.
Tubo a fondo tondo da 10 mlAppleton WoodsSC211 142 AS
7,5% BSA Frazione V soluzioneLife technologies15260-037Conservare a 4 °C.
Siringhe Plastipak da 20 ml 300613
siringhe Plastipak da 5 ml SiringheBD falcon302187
Siringhe Plastipak da 2 ml BDfalcon300185
Nastro chirurgico ipoallergenico 3M 9 m x 2,5 cmMicropore1530-1Utilizzare per fissare il rubinetto della siringa sulla parete della camera in perspex.
Tubo in gomma siliconica, diametro interno/diametro esterno (ID/OD) di 1/3 mm (tubo sottile)Fisher ScientificFB68854Tagliare il tubo in silicone alla dimensione appropriata. Tutti i tubi che portano direttamente alla microvalvola elettronica devono essere sottili.
Tubo in gomma siliconica ID/OD di 2/4 mm (tubo spesso)Fisher ScientificFB68855
Portex Blue LineTubo Smiths200/495/200Tubo che porta alla pompa a siringa.
Rubinetto a 3 vieBOC Ohmeda AB
Siringa in vetro da 50 ml per pompaPopper Micromate550962Deve essere adescato prima dell'uso rimuovendo eventuali bolle d'aria.
Vetrino coprioggettiRaymond A Lamb26 x 76 mm vetrini coprioggetti su ordinazione. Numero di lotto 2440980.
Guarnizione in parafilmAmerican National Can CompanyTagliare un pezzo di parafilm di 26 x 76 mm utilizzando una dima di alluminio e tagliare una fessura di 20 x 4 mm utilizzando un bisturi 10a. Lo spessore della guarnizione è di circa 133 µm.
Due piastre parallele in perspexWolfson Applied Technology LaboratoryCamera appositamente progettata composta da piastre parallele tenute insieme da 8 viti. La piastra inferiore ha una fessura di visualizzazione ritagliata al centro e un incavo poco profondo fresato per lasciare spazio per il vetrino coprioggetti, il filtro e la guarnizione. La piastra superiore in perspex ha un foro di ingresso e uscita posizionato sopra il canale di flusso.
Microvalvola elettronica a 3 vie con spazio morto minimoLee Products Ltd.LFYA1226032HCollegato elettronicamente a un'alimentazione a 12 volt CC.
Pompa a siringa per infusione/prelievo (PHD2000)Harvard Apparatus70-2001Impostare il diametro su 29 mm e la velocità di riempimento (flusso).
Connettore a forma di LLabhutLE876Da collegare alle porte di ingresso e uscita sul canale microslide Ibidi.
VideocameraQimaging01-QIC-F-M-12-CCollegata a un computer che consente la registrazione di video digitali.
Image-Pro Plus 7.0Media Cybernetics41N70000-61592Per l'analisi dei dati. Contrassegna manualmente le celle che mostrano i diversi comportamenti. Tracciare le celle per l'analisi delle velocità di rotolamento e migrazione.
Fare riferimento alle schede tecniche dei prodotti per i dettagli sui rischi derivanti dall'uso dei reagenti descritti qui.
PBS Tubo manometro

Riferimenti

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