Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

Sommario

Descriviamo un metodo per stabilire enteroidi umani da cripte intestinali tenue e colonoidi da cripte del colon raccolte sia da tessuto chirurgico che da biopsie. In questo articolo metodologico, presentiamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di successo di enteroidi e colonoidi umani.

Abstract

L'epitelio del tratto gastrointestinale si rinnova costantemente man mano che si capovolge. Questo processo è innescato dalla proliferazione delle cellule staminali intestinali (ISC) e della progenie che migrano e si differenziano progressivamente verso la punta dei villi. Questi processi, essenziali per l'omeostasi gastrointestinale, sono stati ampiamente studiati utilizzando molteplici approcci. Le tecnologie ex vivo, in particolare le colture cellulari primarie, si sono dimostrate promettenti per la comprensione delle funzioni epiteliali intestinali. È stato creato un sistema di coltura primaria a lungo termine per cripte intestinali di topo per generare organoidi epiteliali tridimensionali. Queste strutture epiteliali contengono domini simili a cripte e villi che ricordano il normale epitelio intestinale. Comunemente, chiamati "enteroidi" quando derivati dall'intestino tenue e "colonoidi" quando derivati dal colon, sono diversi dagli organoidi che contengono anche tessuto mesenchimico. Inoltre, questi enteroidi/colonoidi producono continuamente tutti i tipi di cellule che si trovano normalmente all'interno dell'epitelio intestinale. Questo sistema di coltura in vitro simile a un organo sta rapidamente diventando il nuovo standard di riferimento per lo studio della biologia delle cellule staminali intestinali e della fisiologia delle cellule epiteliali. Questa tecnologia è stata recentemente trasferita allo studio dell'intestino umano. La costituzione di enteroidi epiteliali e colonoidi di derivazione umana dall'intestino tenue e dal colon è stata possibile attraverso l'utilizzo di specifici terreni di coltura che ne consentono la crescita e il mantenimento nel tempo. Qui, descriviamo un metodo per stabilire un sistema derivato dalla cripta dell'intestino tenue e del colon da tessuto umano intero o biopsie. Sottolineiamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di successo di enteroidi e colonoidi umani.

Introduzione

L'epitelio rivestimento del tratto gastrointestinale è in costante rinnovamento. Questo processo è innescato da proliferazione delle cellule staminali intestinali (ISC) che producono continuamente progenie di sostituire rapidamente l'epitelio intestinale come si gira. Il vano proliferativa comprendente le ISC si limita al fondo delle cripte. Le ISC danno origine a una progenie che alla fine differenziarsi in assorbimento o lignaggi secretoria. Spostamento dalla cripta e sulla villi o la superficie epitelio, cellule si differenziano progressivamente quando migrano verso l'alto prima di esfoliazione nel lume ^1. ISC danno origine a tutti i tipi di cellule epiteliali intestinali tra cui enterociti, cellule, cellule microfold enteroendocrine, cellule del calice, cellule ciuffo e cellule Paneth. Il colon è caratterizzato da cripte allungati composte principalmente di colonociti e cellule calice, con enteroendocrine sparse e cellule ciuffo ^2.

Ex vivo culsistemi ture costituiscono strumento promettente per lo studio ISC manutenzione e omeostasi tessuto intestinale. Tuttavia, è difficile fare affidamento su tecnologie di coltura di tessuti come condizioni fisiologiche non sono completamente riprodotti e il microambiente epiteliale spesso alterati ^3,4. Un grande passo avanti nel campo ISC è stata la creazione di tecniche di coltura di tessuti per mantenere ed espandere i singoli CSI murini utilizzando fattori di crescita definiti per sostituire i normali segnali di nicchia intestinale. Condizioni di coltura a lungo termine sono stati descritti da Sato et al., In cui singoli cripte o cellule staminali isolate dalla epitelio intestinale crescono a formare strutture epiteliali 3-dimensionale compresa più domini cripta simili ^5-7. Queste strutture tridimensionali subiscono eventi di fissione per espandere continuamente. È interessante notare, tutti i tipi di cellule intestinali specifici del tessuto di origine vengono prodotti e così vengono estrusi in un lume ^8. Usando modifiche di questo sistema, epitelialeorganoidi possono essere generati dallo stomaco, intestino tenue e colon. Più specificamente, organoidi epiteliali dell'intestino tenue sono enteroids ^9, e quelli del colon sono colonoids ^9,10. Questi epiteliali sistemi di coltura organoide sono stati utilizzati per testare la capacità di isolate cellule singole a funzionare come cellule staminali in vitro, testando così la "staminalità" di cellule isolate ^5,6,10-15. Altri ricercatori hanno usato sia enteroids e colonoids per studiare la funzione di singole cellule epiteliali ^16-21. Così, le culture e enteroid colonoid possono essere utilizzati per valutare sia le funzioni di staminali e di cellule non-staminali e dare una nuova visione delle interazioni cellulari fondamentali all'interno dell'intestino.

Nel 2011, Sato e colleghi generato cultura a lungo termine di organoidi epiteliali derivati ​​dal piccolo intestino umano e colon ^22,23. Oltre alle differenze nella composizione media, le enteroids epiteliali umanee colonoids presentano le stesse caratteristiche come la loro controparte murina. Inoltre, possono essere generati da tessuti malati come l'esofago di Barrett, adenoma o adenocarcinoma, e fibrosi cistica ^22,24. Enteroids umane costituiscono un sistema prezioso per lo studio delle cellule staminali intestinali e epiteliali della mucosa biologia e servire come un sistema sperimentale romanzo studiare la fisiologia gastrointestinale sia normale e anormale ^3.

Qui si descrivono i metodi per stabilire enteroids e colonoids dal piccolo intestino umano e cripte del colon (Figura 1). In questa recensione metodologica, sottolineiamo la raccolta cripta dal tessuto insieme e biopsie. Abbiamo Ricapitoliamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di enteroids e colonoids umani e le possibili strategie sperimentali svolte da questo modello di successo.

Protocollo

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione utilizzando tessuti umani descritti nel presente documento è stato approvato da un IRB a CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2.014-0.427). Il consenso informato per la raccolta dei tessuti, lo stoccaggio e l'uso dei campioni è stato ottenuto da donatori a CCHMC.

1. Preparazione per la Cultura

NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nella tabella 1.

1. Preparare soluzione stock EDTA come segue: preparare 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico, pH 8 (EDTA) in ultrapura H ₂ O, filtro sterilizzato con 0,22 micron filtro. Facoltativamente, conservare la soluzione EDTA stock in RT a tempo indeterminato.
2. Preparare tampone chelante come segue: mescolare 2% sorbitolo, 1% di saccarosio, 1% frazione albumina sierica bovina V (BSA) e 1x Gentamicina / soluzione amfotericina in fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca ²⁺ e Mg ²⁺ (DPBS), filtro sterilizzato con 0,22 micron filtro. Preparare il buf chelantefer fresco.
3. Preparare medio Wnt-3A condizionata come segue: media Wnt-3A-condizionata è fatta in casa utilizzando la linea cellulare L Wnt-3A secondo le istruzioni del produttore (ATCC, CRL-2647). Supplemento alla media con glutammina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / ml di penicillina, 100 g / ml di streptomicina, 1 N2 supplemento, 1 B27 supplemento, 1% BSA e filtro sterilizzato con filtro 0,22 micron.
   NOTA: test ogni lotto per l'attività Wnt usando un test TOPflash. Utilizzare una stabile linea cellulare HEK293 TOPflash (Hans Clevers laboratorio) con un kit di test luciferasi Renilla secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare il saggio TOPflash con 100 ng / ml ricombinante Wnt-3A umana. Conferma almeno un'attività di 10 volte cambiamento dei media condizionati rispetto al controllo. Dividere fresco medio Wnt-3A-condizionata in 10 ml aliquote in 15 ml provette coniche e congelare a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. Conservare scongelato aliquote fino a 5 giorni a 4 ° C senza perdita di attività.
4. Prepare medio minigut umana come segue: Supplemento avanzata DMEM / F12 con glutammina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / mL di penicillina, 100 g / mL di streptomicina, 1 N2 integratore, 1 B27 supplemento, 1% BSA e filtro sterilizzato con 0,22 Filtro micron.
   NOTA: Dividere mezzo fresco minigut umano in 10 ml aliquote in 15 ml provette coniche e congelare a -20 ° C per un massimo di 3 mesi. Conservare scongelato aliquote fino a 5 giorni a 4 ° C senza perdita di attività.
5. Preparare mezzo completo minigut umana come segue: Preparare fresco prima cultura cripta o medio cambiamento medio minigut umana (cfr 1,4) integrato con il 50% Wnt-3A-condizionata medie (vedi 1.3), 1 mg / ml di R-spondina 1 (1: 1.000 diluizione di 1 mg / ml di brodo), 100 ng Noggin / ml (1: 1.000 diluizione di 100 g / mL archivio), 50 ng / mL EGF (1: 10.000 diluizione di 500 mg / mL archivio), 500 nM A-83 -01 (1: 1.000 diluizione 500 m stock), 10 mM SB202190 (1: 3.000 diluizione 30 magazzino mM), 10 nM [Leu] 15-Gastrina 1 (1: 10.000 diluizione 100 micronazione), Nicotinamide 10 mm (1: 100 diluizione di 1 m stock) e 1 mm N-Acetilcisteina (1: 1.000 diluizione di 1 m stock).
   NOTA: Conservare i media minigut umani completi fino a 2 giorni a 4 ° C senza perdita di attività.

2. Cripta isolamento da tutto il tessuto

NOTA: Dalla collezione tessuti, è essenziale mantenere il campione in soluzione salina. Si raccomanda di mantenere il tessuto in ghiaccio durante il trasporto. Preparazione del campione per l'isolamento della cripta deve essere eseguita appena possibile.
NOTA: Tutti i reagenti sono elencate nella Tabella 1, strumenti, attrezzature, e materiali di consumo sono elencate nella tabella 2.

1. Preparare tutti i reagenti prima di iniziare l'esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO ₂ incubatore a 37 ° C.
   NOTA: In alternativa fare un sottile strato di matrice membrana basale utilizzando 15 microlitri / pozzetto nel centro di un 24Piastra -well e collocarlo in un incubatore CO ₂ a 37 ° C. Questo passaggio facoltativo mantiene seminterrato matrice di membrana come una goccia durante la polimerizzazione.
2. Lavare il tessuto con ghiacciata fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca ²⁺ e Mg ²⁺ (DPBS). Proseguire fino al contenuto di DPBS è chiara.
3. Usando 0,2 millimetri di diametro minutien perni, fissare il tessuto su un vetro Petri dish siliconata riempito con DPBS gelide. Allungare e pin il tessuto piana con il lato rivolto verso l'alto della mucosa.
4. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere la mucosa sovrastante dalla sottomucosa e tessuto connettivo con le forbici micro-dissezione e punta fine pinze curve (Figura 2A, B).
5. Allungare e pin la sezionato mucosa piatta sul piatto di vetro siliconato Petri con il lato rivolto verso l'alto della mucosa. La sottomucosa rimanente e del tessuto connettivo possono essere scartati o utilizzati per ulteriori esperimenti (Figura 2C).
6. Delicatamenteraschiare la superficie della mucosa con pinze curve. Questo passo è necessario per migliorare la qualità della preparazione.
   1. Per tenue, raschiare delicatamente la mucosa per rimuovere i villi.
   2. Per colon, raschiare delicatamente la mucosa per rimuovere muco e detriti.
7. Lavare la mucosa 3-4 volte con tampone chelazione ghiacciato per rimuovere villi e detriti.
8. Coprire la mucosa con appena preparato tampone chelazione 2mM EDTA (200 ml 0.5 M EDTA in 49,6 ml tampone di chelazione).
9. Porre la capsula Petri sul ghiaccio e agitare delicatamente per 30 minuti su un agitatore orbitale orizzontale.
10. Lavare il tessuto 3-4 volte con tampone chelazione gelida, senza EDTA. Dopo il lavaggio, lasciare la mucosa in tampone chelazione gelida.
11. Elaborare la mucosa sotto un microscopio da dissezione con pinze curve e sottili. Raschiare delicatamente la mucosa per liberare cripte intestinali utilizzando le pinze curve.
12. Rimuovere delicatamente la sospensione cripta dalla capsula di Petri con un piPette e le trasferisce in una provetta conica da 50 ml.
    NOTA: controllare il tessuto per assicurarsi che quasi tutti cripte sono stati rimossi dalla mucosa.
13. Filtrare la sospensione cripte attraverso un 150 micron in rete 2 volte.
    NOTA: controllare il flusso attraverso cripta arricchimento al microscopio (Figura 2D).
14. Centrifugare la cripta di sospensione 5 min a 50 xg, 4 ° C. Scartare il surnatante.
15. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone chelazione ghiacciata.
16. Contare il numero di cripte per caduta di 10 microlitri della sospensione dal punto 2.15. Trasferire il numero di cripte necessari per la placcatura a 5 ml tubo a fondo rotondo. Usa 200 a 500 cripte per pozzetto di un piatto 24 pozzetti per stabilire enteroids o colonoids.
17. Centrifugare la frazione cripta per 10 minuti a 150 g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
18. Utilizzare cripte per la cultura successiva.

3. Cripta Isolamento da biopsia

1. Preparare tutti i reagenti primainizio dell'esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO ₂ incubatore a 37 ° C.
2. Lavare la biopsia con ghiacciata fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca ²⁺ e Mg ²⁺ (DPBS).
3. Usando 0,1 millimetri di diametro minutien perni, fissare la biopsia su un vetro Petri dish siliconata riempito con DPBS gelide. Allungare e pin mucosa piatta con il lato rivolto verso l'alto della mucosa (Figura 2E).
4. Raschiare delicatamente la superficie della mucosa con pinze curve per rimuovere villi e detriti. Questo passo è necessario per migliorare la qualità della preparazione.
5. Lavare la biopsia 3-4 volte con tampone chelazione ghiacciato per rimuovere villi e detriti.
6. Coprire la biopsia con appena preparato tampone chelazione 2mM EDTA (200 ml 0.5 M EDTA in 49,8 ml tampone di chelazione).
7. Porre la capsula Petri sul ghiaccio e agitare delicatamente per 30 minuti su un agitatore orbitale orizzontale.
8. Lavare la biopsia 3-4 volte con tampone chelazione gelida, senza EDTA. Dopo il lavaggio, lasciare la biopsia nel buffer di chelazione gelida.
9. Elaborare la biopsia sotto un microscopio da dissezione con pinze curve e sottili. Raschiare delicatamente la mucosa per liberare le cripte intestinali con pinze curve.
10. Rimuovere delicatamente la sospensione cripta dalla capsula di Petri con una pipetta e trasferirlo in una provetta da 50 ml.
    NOTA: controllare il tessuto per assicurarsi che quasi tutti cripte sono stati rimossi dalla mucosa.
11. Filtrare la sospensione cripta attraverso un nylon 150 micron maglia 2 volte.
    NOTA: controllare il flusso attraverso cripta arricchimento al microscopio.
12. Centrifugare la cripta di sospensione 5 min a 50 xg, 4 ° C. Scartare il surnatante.
13. Risospendere il pellet in 1 ml ghiacciata buffer di chelazione. Trasferire la sospensione cripta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
14. Centrifuga la frazione cripta per 10 minuti a 150 xg, 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
15. Utilizzare cripte per la cultura successiva.

4. Cripta Cultura a matrice di membrana basale

1. Utilizzando puntali pre-refrigerati, risospendere il pellet crypt (dal punto 2.18 o 3.15) in membrana basale matrice (200 a 500 cripte / 50 ml seminterrato matrice di membrana).
2. Applicare 50 ml di sospensione cripta a membrana matrice seminterrato per bene sul piatto pre-riscaldato. Lentamente estrarre la matrice di membrana basale nel centro del pozzo.
3. Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 30 min per permettere una completa polimerizzazione della matrice membrana basale.
4. Sovrapporre la matrice membrana basale con 500 ml di mezzo completo minigut umano integrato con 2,5 micron CHIR99021 (1: 4.000 diluizione 10 stock mM) e 2,5 micron Thiazovivin (1: 4.000 diluizione 10 stock mM).
5. Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
6. Sostituire il mezzo con Huma fresca completan minigut media ogni 2 giorni.

5. Passaging di Colta Enteroids e Colonoids.

NOTA: Passage Enteroids e Colonoids ogni 7 a 10 giorni dopo la placcatura iniziale. In generale, dividere un bene nel 3 a 4 pozzi.

1. Preparare tutti i reagenti prima dell'inizio dell'esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO ₂ incubatore a 37 ° C.
2. Rimuovere il supporto con punte sterili e overlay con 1 ml di DPBS ghiacciate.
3. Pipetta avanti e indietro con una punta di 1.000 ml. Trasferire la soluzione in un nuovo tubo da 15 ml.
4. Aggiungere 2 ml di terreno minigut umana integrata con 5% FBS per 1 ml di terreno.
5. Centrifugare la soluzione per 5 min a 50 xg, a 4 ° C. Scartare il surnatante.
6. Risospendere il pellet con 2 ml di dissociazione cellulare dell'enzima supplementato con 10 mM Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Incubare per 5 min a 37 ° C in un bagno d'acqua.
7. Dissociare il grumi di cellule utilizzando una siringa da 3 ml Luer-Lock dotato di un 18-G di riempimento / ago smussato. Pipetta delicatamente la soluzione avanti e indietro con la siringa per 10 volte.
8. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 500 xg, a 4 ° C. Scartare il surnatante.
9. Utilizzando puntali pre-refrigerati, risospendere il pellet cellulare in matrice di membrana basale.
10. Applicare 50 ml di sospensione cripta a membrana matrice seminterrato per bene sul piatto pre-riscaldato. Lentamente estrarre la matrice di membrana basale nel centro del pozzo.
11. Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 20 min per permettere una completa polimerizzazione della matrice membrana basale.
12. Sovrapporre la matrice membrana basale con 500 ml di mezzo completo minigut umano integrato con 10 pM Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM).
13. Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
14. Dopo 2 giorni, Sostituire il mezzo con fresco mezzo completo minigut umano supplementato con 10 micron Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Successivamente, sostituire il mezzo fresco con mezzo completo, minigut umana ogni altro giorno.

6. Il congelamento di Colta Enteroids e Colonoids

NOTA: Di solito congelare un pozzetto in 2-3 cryovials.

1. Ripetere i punti da 5.1 a 5.8.
2. Risospendere il pellet con il mezzo di congelamento freddo. Trasferire 1 ml di congelamento soluzione in una provetta Microbank ™ etichetta. Posizionare il esageratamente in un recipiente congelamento contenente 500 ml di alcool isopropilico.
3. Trasferire il contenitore di congelamento di un C congelatore 80 ° per 24 ore, poi il trasferimento esageratamente allo stoccaggio di azoto liquido.
   NOTA: Conservare Enteroids e Colonoids fino a 1 anno.

Risultati

La figura 2D mostra un tipico esempio di cripte appena isolate da tutto il tessuto (Figura 2D). Il numero di cripte isolate da una biopsia è inferiore nel tessuto intero. Utilizzando pinze capacità standard di biopsia con ago, di solito effettuiamo due morsi biopsia su un unico passaggio. Ogni risultati morso biopsia in una superficie 10 mm ² con una media di 50 a 100 cripte per biopsia (Figura 2F).

Dopo la cultura in matrice membrana basale, le cripte completano a formare enterospheres per tenue e colonospheres per colon. La cripta erba di solito si verifica entro 5 o 6 giorni, dopo la semina. Tuttavia non è raro vedere sia enteroids (enteroids) o colonoids (colonoids) formano sfere della matrice membrana basale (Figura 3A-C, Movie 1). Il passaging può essere effettuata dopo 7 giorni, a seconda delle dimensioni delle enteroids. Il enteroids o colonoids establmentata da biopsie subiscono lo stesso sviluppo della cultura. Tuttavia, poiché la densità cripta di semina è inferiore, il passaging viene di solito effettuata dopo 10 a 12 giorni di coltura (figura 4a, b). Enteroids e colonoids culture espandono in modo riproducibile.

Entrambi enteroids e colonoids presentano un lato luminale e sono rivestiti con un epitelio (Figura 5A, B). Le cellule proliferative si possono osservare nei enteroids e si trovano all'interno delle punte del germoglio (figura 5C, D). Confocale di enteroids colorati con E-caderina (Ecad) mostra le cellule epiteliali (Figura 5E).

Sia enteroids e colonoids possono essere stabiliti dal tessuto ottenuti da pazienti affetti da malattie genetiche / congenite. La figura 6 mostra enteroids rappresentativi che crescono da un paziente con fibrosi cistica (Figura 6A) e una enteropatia trapunto a causa di una mutazione congenita nell'annuncio cellule epitelialigene coesio molecola (EpCAM) (Figura 6B). Oltre al difetto genetico, i enteroids non presentano differenze di condizioni basali.

Figura 1. Flusso di lavoro di cripte dissociazione e la generazione di enteroids umani e colonoids in coltura. Cripte (dal piccolo intestino o colon umano) sono isolati dal EDTA chelazione. Cripte coltivate formano enteroids per l'intestino tenue e colonoids per il colon. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. processo di dissezione per l'isolamento cripta. (A) L'intestino tenue specimen è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (B) La mucosa è separata dalla sottomucosa sottostante. (C) La mucosa sezionato è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (D) Dopo EDTA chelazione, cripte sono isolate dal tessuto. (E) Una biopsia è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (F) Dopo EDTA chelazione, cripte sono isolati dalla biopsia. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. cultura Cripta e enteroid umana e la generazione colonoid dal tessuto intero. (A) cripte digiunale placcato in matrice membrana basale dopo l'isolamento. Le cripte stanno chiudendo dopo 3 a 4 ore e iniziano a palloncino fino a formare enterospheres oltre tale termine. In 7 giorni, le enteroids digiunali si formano. (B) Dopo l'isolamento e la cultura, cripte ileali si comportano come le cripte digiunali e forma enteroids ileale. (C) cripte del colon sono placcati in matrice membrana basale dopo l'isolamento. Le cripte stretti e formano colonoids dopo 7 giorni (bar Scala: 100 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. cultura Cripta e enteroid umana e la generazione colonoid dalla biopsia. (A) cripte duodenali placcato in matrice membrana basale dopo l'isolamento. Le cripte stanno chiudendo dopo 3 a 4 ore e iniziano a palloncino fino Beyond questa volta a formare enterospheres. In 7 giorni, le enteroids si formano. (B) Dopo l'isolamento e la cultura, cripte del colon sono placcati in matrice di membrana basale. Le cripte vicino a formare colonospheres poi colonoids dopo 7 giorni (bar Scala: 100 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. intestinali lignaggi dei enteroids umane. (A) enteroid umana dopo 6 giorni di coltura. (B) sezioni ematossilina-eosina dei enteroids in (A) dimostrare l'epiteliali che rivestono (bar Scala: 100 micron). (CD) confocale di enteroids dopo EdU colorazione (magenta) indica la presenza di cellule proliferative. (E Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. cultura Cripta e la generazione enteroid umana dal tessuto malato. (A) Enteroids stabilito da un campione di fibrosi cistica. (B) Enteroids stabilito da un congenito esemplare tufting enteropatia (barre di scala: 100 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Movie 1. Enterosphere formando enteroid umano nella cultura. 32 hr temporali girie filmato mostra un enterosphere stabilita dal piccolo intestino umano scomparsa per formare un enteroid in cultura. Clicca qui per vedere il video.

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Solvente	Archivio Concentrazione	Concentrazione finale	Commento
Fosfato di Dulbecco tamponata salina Ca 2+, Mg 2+ gratuito (DPBS)	Life Technology; Gibco	14190-144	-	-	1x
Etilendiammina tetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	431.788	Ultrapure dH 2 O		2 mm
Sorbitolo	Fischer Scientific	BP439-500	DPBS	Polvere	2%
Saccarosio	Fischer Scientific	BP220-1	DPBS	Polvere	1%
Albumina di siero bovino (BSA) Frazione V	Fischer Scientific	BP1600-100	DPBS	Polvere	1%
Soluzione Gzntamycin / amfotericina B	Life Technology; Gibco	R-015-10	-	500x	1x
Wnt-3A conditionned medio	in casa	-	-	-	-
Avanzate DMEM / F12	Life Technology; Gibco	12634-028	-	-	-
HEPES 1M	Life Technology; Gibco	15630-080	-	1 M	10 mM
Glutamax (glutamina)	Life Technology; Gibco	35050-061	-	100X	1X
Penicillina-streptomicina (10.000 U / mL)	Life Technology; Gibco	15140-148	-	100X	1X
N2 Supplemento	Life Technology; Gibco	17502-048	-	100X	1X
B27 Supplemento	Life Technology; Gibco	17504-044	-	50X	1X
N-Acetilcisteina	Sigma-Aldrich	A9165-5G	DPBS	1 M	1 mM
Nicotidamide	Sigma-Aldrich	N0636	DPBS	1 M	10 mM
Matrigel, GFR, fenolo (matrice membrana basale) gratis	Corning	356.231	-	-	-	RICHIESTO
Noggin ricombinante umana	R & S	6057-NG / CF	DPBS	100 ug / ml	100 ng / ml	Altri fornitori: R & S; Anaspec e Preprotech
umana ricombinante R-spondina	Preprotech	120-38	DPBS	1 mg / ml	1 ug / ml
EGF ricombinante umana	Sigma-Aldrich	E9644-.2MG	DBPs	500 mg / ml	50 ng / ml
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG	DPBS	10 mM	10 mM
A-83-01	Tocris	2939	DMSO	500 micron	500 nM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067-5MG	DMSO	30 mM	10 mM
umana [Leu] 15-Gastrin 1	Sigma-Aldrich	G9145-.1MG	DPBS	100 pM	10 nM
CHIR99021	Stemgent	04-0004	DMSO	10 mM	2,5 micron
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	DMSO	10 mM	2,5 micron
TrypLE espresso Enzyme (1X), rosso fenolo (cellule dissociazione enzimatica)	Life Technology; Gibco	12605-010	-	-	-	Per passaging
Siero fetale bovino	Life Technology; Gibco	10082-147	-	-	-	Per passaging
CTS Synth-a-Freeze (media di congelamento) Medium	Life Technology; Gibco	A13713-01	-	-	-	Per il congelamento
Linea cellulare L Wnt-3A	ATCC	CRL-2647	-	-	-	Wnt-3A conditionned produzione di media
Renilla test luciferasi	Promega	E2710	-	-	-	Wnt-3A conditionned attività dei media
umana ricombinante Wnt-3A	R & S	5036-WN / CF	DPBS	100 ug / ml	100 ng / ml
Linea cellulare HEK293 TOPflash	-	-	-	-	-	Wnt-3A conditionned attività dei media; Regalo da laboratorio di Hans Clevers

Tabella 1. Elenco dei reagenti dettagliato con il produttore preferito e numero di catalogo.

Attrezzatura	Consumabili	Strumenti
Cappa a flusso laminare	15 e 50 ml provette coniche	Dumont # 5 pinze normali (FST; # 11251-20)
CO 2 Incubatore	Tubi microcentrifuga	Dumont # 7, curve pinza sottile (FST; # 11274-20)
Stereomicroscopio	Piastre da 24 pozzetti	Forbici Belle (FST; # 14060-09)
0.22 micron filtri (Sartorius)	Forbici primavera Vännäs (FST; # 15018-10)
Shaker orbitale	Pipette sierologiche	0,2 millimetri di diametro minutien perni (FST; # 26002-20)
Contenitore congelamento (Nalgene)	Suggerimenti micropipetta	0,1 millimetri di diametro minutien perni (FST; # 26002-10)
Sylgard 184 Silicone (Dow Corning)	150 micron aperture di maglia, lo screening di nylon (Dynamic Aqua-fornitura)
Piatto di vetro Petri	5 ml tubi in polipropilene a fondo tondo (Falcon)
Pipetta sierologica	18G ago riempimento smussato (BD)
Micropipetta	3 ml lsyringes con punte Luer-Lock (BD)
	Cryovials

Centrifuga

Discussione

Questo metodo fornisce un sistema completo riprodurre linee dell'epitelio intestinale e dinamiche epiteliali che costituiscono un utile strumento per studiare la biologia epiteliale intestinale. Il metodo presentato qui è stato adattato dallo studio murino originale di Sato e Clevers ²² che si traduce in modo efficiente in enteroids umani e colonoids. Qui, abbiamo scelto manualmente le cripte per microdissezione per evitare contaminanti cellulari. Questo metodo permette una visualizzazione diretta delle cripte e porta a consistenza straordinari rispetto alla raccolta cripta originale "agitando". Altri gruppi hanno sviluppato tecniche simili utilizzando approcci leggermente diversi soprattutto sostituiscono la chelazione da EDTA con collagenasi ^25. Oltre alle differenze di raccolta cripta, tali tecniche utilizzano un supporto definito che è necessaria per far crescere i enteroids umani in coltura ^22. Per aumentare l'efficienza crescita a crypt semina, aggiungiamo un inibitore GSK3 (CHIR99021)per i primi due giorni ^{a 12.}

La movimentazione del tessuto o biopsie è importante e l'isolamento cripta deve essere eseguita non appena il tessuto arriva in laboratorio. Tuttavia, ritardata isolamento e la coltura cripta potrebbero essere eseguite fino a 24 ore dopo la raccolta del tessuto (dati non mostrati) come precedentemente descritto per il tessuto murino ^26. Il tessuto intestinale deve essere posto in una provetta conica completamente riempito con DPBS per evitare perturbazioni del tessuto devono essere mantenuti a 4 ° C. La preparazione ritardata permette per trasporto tessuto ma la variazione di temperatura deve essere evitato durante il trasporto. Il tempo complessivo necessario per il fasciame cripta iniziale è di circa 2 ore con 15 a 30 minuti per elaborare il tessuto e da 1 a 2 ore per isolare e piastra cripta. La microdissezione del tessuto è un fattore determinante e predicato di una preparazione crypt pulito. Tuttavia, il rilascio cripta mano tremare, come descritto in diversi protocolli è possibile ²2,23.

Nonostante le analogie con il sistema enteroid murino (enteroids), le enteroids umani richiedono specifiche molecole per migliorare e sostenere la loro crescita nel tempo. I fattori di crescita, EGF, Noggin, R-spondina vengono utilizzati in modo simile ai organoidi epiteliali murine. Tuttavia, l'uso di Wnt-3A è critica. Abbiamo notato che la formazione e l'efficienza di crescita è maggiore utilizzando un mezzo condizionato Wnt-3A rispetto alla proteina umana ricombinante. Contemporaneamente, abbiamo dimostrato condizioni di coltura migliorate utilizzando un inibitore della chinasi glicogeno sintasi 3 (CHIR99021) ^12. Fattori di crescita ricombinanti potrebbero essere sostituiti da Wnt-3A, R-spondina, e Noggin condizionato-media. Una linea L-cell-Wnt-3A espressione è disponibile in commercio (ATCC). Altri gruppi hanno sviluppato R-spondina 1- ^23,27, Noggin- ^19, e Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- ²⁸ esprimere linee cellulari. Due inibitori piccole molecole vengono utilizzati nella cultura media e sono necessari per il mantenimento della cultura ^29. A-83-01 è un inibitore selettivo della trasformazione β fattore di crescita e Activin / recettori nodali (activina-like chinasi 4, 5, 7) e SB202190 è un inibitore della proteina chinasi p38 mitogeno-attivata (MAPK). Entrambi gli inibitori sono stati utilizzati rispettivamente per sostenere umana indotte pluripotenti cellule staminali di auto-rinnovamento e di stabilire naïve cellule staminali pluripotenti umane ^30-32. Inoltre, nicotinamide, un precursore di nicotinamide adenina dinucleotide, è necessario per mantenere enteroids ed espansione colonoids in modo lungo termine ^22,29.

La chelazione EDTA è un passo importante in quanto determina il rendimento dalla preparazione cripta. Abbiamo avuto successo con 2 trattamento mM EDTA. Tuttavia, la concentrazione EDTA può essere modificato da 2 mM a 15 mM relative al tipo di tessuto. In tal caso, il tempo di incubazione deve essere determinato empiricamente. Dopo la placcatura iniziale, la cripta arrotonderà-up e alla fine formano enteroids. Tuttavia, i enteroids o colonoids spesso mostrano un fenotipo "radice" formando sfere con poco o nessun cellule differenziate. In tal caso, la differenziazione può essere avviata prelevando Wnt-3A, nicotinamide e l'inibitore p38 MAPK. L'uso di inibitori Notch come DAPT o DBZ aiuta migliorare la differenziazione all'interno dei enteroids ^22.

Questo modello ricapitola la fisiologia intestinale con eventi-cripta erba continui derivanti da un compartimento di cellule staminali e domini epiteliali dei villi-like contenenti sia di assorbimento e di secrezione differenziata lignaggi. È interessante notare che questo sistema non contiene cellule mesenchimali e utilizza specifiche condizioni dei media per soddisfare i requisiti del segnale di nicchia.

Come il modello murino, enteroids umani possono essere generati da isolate cellule epiteliali intestinali per testare la capacità di queste cellule di funzionare come una cellula staminale. Sevestudi ral hanno utilizzato gruppo di marcatori di differenziazione (CD44, CD24 e CD166) e le cellule positive EphB2 per arricchire per le cellule con proprietà staminali ^12,23,33. Insieme, questi studi dimostrano l'utilità di enteroids umane culture per testare la staminalità. Altri ricercatori stanno utilizzando questo modello per studiare malattie intestinali quali le malattie infettive diarroiche, la fibrosi cistica, o tumori colorettali ^22,34-37. Questi studi dimostrano che enteroids umani costituiscono un modello affidabile malattia umana con la possibilità di muoversi in direzione di uno screening personalizzato. Enteroids umani possono essere geneticamente modificati utilizzando trasfezione DNA o infezione con particelle virali ^38. Ciò fornisce un potente strumento per studiare le funzioni specifiche del gene nei organoidi epiteliali umane o correggere le mutazioni genetiche. Recentemente, Schwank e colleghi hanno dimostrato la possibilità di modificare il genoma con il sistema CRISPR / Cas9 e correggere la mutazione sul gene CFTR causando acfibrosi ystic ^24. Enteroids umane costituiscono un sistema prezioso per lo studio delle cellule staminali intestinali e epiteliali della mucosa biologia e servire come un sistema sperimentale romanzo di studiare sia normale e anormale fisiologia gastrointestinale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato Ca2+, Mg2+ free (DPBS)	Life technologies; Gibco	14190-144
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	431788
Sorbitolo	Fischer Scientific	BP439-500
Saccarosio	Fischer Scientific	BP220-1
Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V	Fischer Scientific	BP1600-100
Soluzione di Gzntamicina/Amfotericina B	Tecnologie per la vita; Fluido condizionato Gibco	R-015-10
Wnt-3A	in casa
Tecnologie avanzate DMEM/F12	Life; Gibco	12634-028
HEPES 1M	Life technologies; Gibco	15630-080
GlutaMAX (glutammina)	Tecnologie per la vita; Gibco	35050-061
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Life technologies; Gibco	15140-148
N2 Integratore	Tecnologie per la vita; Gibco	17502-048
B27 Supplemento	Tecnologie per la vita; Gibco	17504-044
N-acetilcisteina	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotidamide	Sigma-Aldrich	N0636
Matrigel, GFR, senza fenolo (matrice della membrana basale)	Corning	356231
Noggin ricombinante umano	R& D	6057-NG/CF
umano ricombinante R-Spondin	Preprotech	120-38
umano ricombinante EGF	Sigma-Aldrich	E9644-.2MG
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG
A-83-01	Tocris	2939
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067-5MG
umano [Leu]15- Gastrin 1	Sigma-Aldrich	G9145-.1MG
CHIR99021	Stemgent	04-0004
Thiazovivin	Stemgent	04-0017
TrypLE Express Enzyme (1X), rosso fenolo (enzima di dissociazione cellulare)	Life technologies; Gibco	12605-010
Siero fetale bovino Life	technologies; Gibco	10082-147
CTS Synth-a-Freeze Medium (mezzo di congelamento)	Tecnologie di vita; Linea cellulare Gibco	A13713-01
L Wnt-3A	ATCC	CRL-2647
Saggio della luciferasi Renilla	Promega	E2710
ricombinante umano Wnt-3A	R& D	5036-WN/CF
HEK293 Linea di celle