Articolo metodologico

Una guida per generazione e l'uso hiPSC NPC derivati ​​per lo Studio delle Malattie Neurologiche

DOI:

10.3791/52495

⸱

21 febbraio 2015

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive come le cellule progenitrici neurali possono essere differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane, al fine di produrre una popolazione di cellule neurali robusta e replicativa, che può essere utilizzata per identificare le vie di sviluppo che contribuiscono alla patogenesi della malattia in molti disturbi neurologici.

Abstract

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Gli studi post-mortem sulle malattie neurologiche non sono l'ideale per identificare le cause sottostanti all'inizio della malattia, poiché molte malattie includono un lungo periodo di progressione della malattia prima dell'insorgenza dei sintomi. Poiché i fibroblasti dei pazienti e dei controlli sani possono essere riprogrammati in modo efficiente in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) e successivamente differenziati in cellule progenitrici neurali (NPC) e neuroni per lo studio di queste malattie, è ora possibile ricapitolare gli eventi di sviluppo che si sono verificati prima dell'insorgenza dei sintomi nei pazienti. Presentiamo un metodo con cui differenziare in modo efficiente le hiPSC in NPC, che oltre ad essere in grado di differenziarsi ulteriormente in neuroni funzionali, possono anche essere robustamente passate, congelate o trasferite per crescere come neurosfere, consentendo un rapido screening genetico per identificare i fattori molecolari che influenzano i fenotipi cellulari tra cui la replicazione, la migrazione, lo stress ossidativo e/o l'apoptosi. Le NPC hiPSC derivate da pazienti sono una piattaforma unica, ideale per la verifica empirica delle conseguenze cellulari o molecolari della manipolazione dell'espressione genica.

Introduzione

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Studi di espressione genica di neuroni differenziati in vitro da umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) da noi 1 e altri 2,3 indicano che i neuroni hiPSC assomigliano fetale piuttosto che adulti tessuto cerebrale. Allo stato attuale, i modelli basati hiPSC può essere più appropriato per lo studio della predisposizione, piuttosto che di fine 'di, malattia neurologica. Abbiamo precedentemente riportato che una frazione significativa della firma gene della schizofrenia neuroni hiPSC-derivati ​​è conservata in celle schizofrenia hiPSC di derivazione progenitrici neurali (NPC), che indica che i PNG può essere un tipo di cellule utili per lo studio dei meccanismi molecolari che contribuiscono alla schizofrenia 1 . Noi e altri hanno segnalato la migrazione aberrante, aumento dello stress ossidativo e le specie reattive dell'ossigeno, la sensibilità al di sotto della soglia stress ambientali e alterata funzione mitocondriale nella schizofrenia hiPSC NPC 1,4-6, così come è diminuito neuronale connectivity e funzione sinaptica nei neuroni schizofrenia hiPSC 5,7-10. Se i fattori molecolari che contribuiscono alla migrazione aberranti e / o stress ossidativo nella schizofrenia hiPSC NPC alla base anche la connettività neuronale ridotta in schizofrenia neuroni hiPSC-derivati, PNG potrebbero essere una popolazione neurale robusto e altamente replicativa con cui studiare i meccanismi responsabili della malattia. Inoltre, perché si può rapidamente generare un gran numero di cellule e hanno bisogno di non aspettare settimane o mesi per la maturazione neuronale, test a base di NPC sono adatti per lo studio di coorti di pazienti più grandi e sono più suscettibili di screening ad alto rendimento. Crediamo che hiPSC NPC può servire come proxy per i percorsi di sviluppo potenzialmente contribuiscono alla patogenesi della malattia, come è già stato dimostrato in disturbi diversi come la schizofrenia 1 e Huntington della malattia 11.

Per differenziare NPC da hiPSCs, neurale inizialeproduzione si ottiene l'inibizione dual-SMAD (0,1 mM LDN193189 e 10mM SB431542) 12. Antagonizzando BMP e TGF segnalazione con queste piccole molecole, endoderma e mesoderma specifica è bloccato, accelerando la differenziazione neuronale e che porta alla formazione di rosette neurali visibili entro una settimana dalla placcatura. Patterning neurale si verifica all'inizio di questo processo, presumibilmente durante il periodo di formazione di rosette neurale e subito dopo. In assenza di altre indicazioni, queste cellule neurali primitive assumono una anterior proencefalo simile destino 13. Subito dopo la formazione di rosette neurale, e continua per tutta l'espansione NPC, NPC prosencefalo sono coltivate con FGF2 8,14. Hanno dual potenziale lignaggio e possono essere differenziati a popolazioni neurali del 70-80% neuroni III-TUBULINA-positivi e 20-30% proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) astrociti -positive (Figura 1). La maggior parte dei neuroni del prosencefalo hiPSC sono VGLUT1-positivi, E così sono presumibilmente glutamatergica, anche se circa il 30% dei neuroni sono GAD67-positivi (GABAergica) 8.

NPC sono regolarmente diversi passaggi più di dieci volte in vitro, pur mantenendo i profili di differenziazione coerenti, e senza accumulare anormalità del cariotipo. Gruppi hanno riportato PNG Passaging più di 40 volte 15, però, scopriamo che oltre dieci passaggi, PNG mostrano maggiore propensione per la differenziazione astrociti. NPC ben tollera più freeze-disgelo e può essere la transizione a crescere come neurosfere semplicemente coltura in piastre non aderenti. NPC sono efficacemente trasdotti da vettori virali, consentendo una rapida valutazione delle conseguenze molecolari e cellulari di perturbazioni genetiche, e facilmente espandibile per produrre materiale sufficiente per studi biochimici. Inoltre, poiché i vettori virali consentono robusto over-espressione e / o atterramento di geni-malattia rilevanti, sia di controllo o paziente derivato neurcellule di Al, si può utilizzare questa piattaforma per testare l'effetto di background genetico in queste manipolazioni. Anche se non è adatto per synaptic o saggi di attività a base richiedono neuroni maturi, PNG può essere una pratica alternativa per molte analisi molecolari o biochimici semplici di cellule neuronali derivate dal paziente.

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Protocollo

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1. hiPSC Differenziazione di cellule neurali progenitrici

  1. Crescere ed espandere hiPSCs in cellule staminali embrionali umane (HES) supporto (Tabella 1) co-coltura di un mouse fibroblasti embrionali (MEF) feeder layer fino grandi (ma subconfluenti) le colonie sono pronti per la differenziazione neuronale attraverso un corpo embrioide (EB) intermedio (Figura 2). Routine condizioni di coltura hiPSC sono ben descritte altrove 16,17; brevemente, crescere hiPSCs nei media HES su uno strato alimentatore mEF fino confluenti, passaggio poi enzimaticamente con collagenasi (1 mg / ml di DMEM) ed espandere di circa 1: 3 ogni 7 giorni.
  2. Per preparare piastre rivestite Poly-L-ornitina / laminina, piastre cappotto con 10 g / ml Poly-L-ornitina in acqua sterile per superfici plastiche (50 g / ml per superfici di vetro) e incubare a temperatura ambiente per 3-24 ore. Lavare almeno una volta con acqua sterile e poi cappotto con 5g / ml laminina in PBS sterile a temperatura ambiente per 3-24 ore.
    NOTA: Se avvolto in plastica, piastre possono essereimmagazzinato per fino a sei mesi a -20 ° C.
  3. Il giorno 1, enzimaticamente sollevare hiPSCs subconfluenti (generalmente coltivate su MEF, o hiPSCs coltivate in mezzi definiti quali TeSR 18 su Matrigel) dalla piastra come grandi colonie utilizzando 1mg / ml Collagenase IV in DMEM / F12.
    NOTA: Dopo 1-2 ore di incubazione a 37 ° C, le colonie sarà fluttuante nel piatto.
  4. Lavare delicatamente le colonie hiPSC (da stabilirsi, non centrifugazione) 1-2x con DMEM / F12, risospendere in 2 ml / pozzetto di N2 media / B27 (Tabella 1) e il trasferimento a piatti non aderente 6 pozzetti (combinare 3-pozzetti in 1 -Beh) 19.
    NOTA: Durante la notte, le colonie si formano ammassi sferici fluttuanti definito "corpi embrionali" (EbS). Aspettatevi morte cellulare sostanziale.
  5. Il giorno 2, piastre di inclinazione e permettere EBs di stabilirsi. Rimuovere con attenzione dei media e lavare una volta con DMEM / F12 per rimuovere i detriti. Gli alimenti con N2 / B27 multimediale integrato con inibitori SMAD doppio (0.1M LDN193189 e 10M SB431542) 12 .
  6. Nei giorni 3-7, neuralization avverrà nel contesto di una doppia inibizione SMAD; controllare che EBs sono rotondi ma non cistica. Concime EBs ogni secondo giorno con mezzi N2 / B27 integrati con 0.1M LDN193189 e 10M SB431542.
  7. Nei giorni 7-14, dopo placcatura di EB per Poli-L-Ornitina / laminina piastre rivestite, controllare utilizzando un microscopio in campo chiaro che rosette neurali cominciano ad apparire nel giro di pochi giorni (caratterizzata da grappoli di cellule rotonde neuroepiteliali con apico-basale polarità; Figura 1). Continuare ad alimentare EB aderenti ogni secondo giorno con N2 / B27 multimediale integrato con 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 e 1 g / ml laminina.

2. Raccolta di Neural Rosette

NOTA: Si consiglia di rosette neurali siano enzimatica raccolti utilizzando Neural Rosette Selection reagente 20 o reagente simile selezione. Anche se rosette neurali possono essere raccolti manualmente in 6 pozzetti rivestiti Poli-L-Ornitina / laminina, thimetodologia s prende una formazione da padroneggiare, e, a seconda abilità dell'utente, può richiedere una seconda fase di raccolta a 20 giorni per arricchire ulteriormente per i PNG e riducono tipi di cellule non neuronali.

  1. Per la selezione enzimatica di rosette neurali al giorno 14, i media aspirato da EBs aderito e aggiungere 1 ml di neurale reattivo selezione rosetta per bene per un 6-pozzetti. Incubare a 37 ° C per 1 ora.
  2. Con un Pipetman P1000, rimuovere delicatamente enzima da ciascun pozzetto. Aggiungere 1 ml di DMEM / F12 per pozzetto per lavare.
  3. Con un P1000, raccogliere i 1 ml di DMEM / F12 e rapidamente espellere il DMEM / F12 di nuovo nel pozzo, staccando così le rosette dalla piastra. Raccogliere le rosette in un tubo falco.
  4. Dispensare un altro 1 ml di DMEM / F12 e rapidamente espellere nello stesso bene a staccare restanti rosette. (Non triturare. Cerca di non rompere gli aggregati rosetta). Raccogliere le rosette neurali nella stessa provetta falco.
  5. Ripetere il punto 2.4, se necessario. Se rosette non si staccano facilmente, aggiungere mori enzima e ripetere il processo (punti 2.1-2.4)
  6. Spin cellule a 300 xg per 3 min. Aspirare il lavaggio, e ri-sospendere rosette a 2 ml di NPC supporti (Tabella 1). Trasferire le cellule (1: 1) in un poli-L-Ornitina / laminina rivestite 6 pozzetti.
  7. Da giorni 15-21, le rosette neurali si espanderanno; rosette di alimentazione ogni secondo giorno con NPC media.
  8. Valutare la qualità delle rosette neurali e garantire che fibroblasti, come piatti, non si stanno espandendo all'interno della cultura.
    NOTA: Se non rosette persistono, la cultura NPC a volte può essere salvato dalla raccolta manuale, selezionando solo il meglio delle rosette raccolte in Accutase. Dissociarsi 15 min a 37 ° C. Pellet, lavare e piatto in NPC mezzi su 24 pozzetti rivestiti Poli-L-Ornitina / laminina.

3. espansione delle cellule progenitrici neurali

NOTA: hiPSC NPC può essere coltivata su entrambi Matrigel- o Poli-L-Ornitina / laminina piastre rivestite. Usiamo tipicamente Matrigel-piastre quanto possono essere preparati in modo più rapido ed a costi inferiori.

  1. Per preparare piastre Matrigel rivestite, scongelare rapidamente e risospendere un'aliquota congelate 1mg di Matrigel in 24 ml freddo DMEM / F12 e distribuire immediatamente 2 ml per ciascun pozzetto di due piastre a sei pozzetti. Incubare per almeno 1 ora a 37 ° C.
    NOTA: Matrigel deve solo essere aspirato, non lavato, immediatamente prima dell'uso.
  2. Concime NPC ogni secondo giorno e mantenere ad altissima densità o saranno spontaneamente differenziarsi a neuroni.
    NOTA: PNG se più consolidati sono in genere divisi 1: 4 ogni settimana, NPC molto basse di passaggio possono essere suddivisi 1: 2 come di rado come una volta ogni due settimane.
  3. Per dividere, supporti primo aspirare e aggiungere 1 ml di caldo Accutase (1X) per pozzetto di 6-pozzetti. Incubare a 37 ° C per 10-15 minuti.
  4. Trasferire delicatamente le cellule staccate in una provetta da 15 ml contenente DMEM / F12 con il minor stress meccanico possibile. Non titolare cellule mentre in enzima. Cellule pellet di Spinning a 1000 xg per 5 min.
  5. Aspirare il lavaggio, e risospendere NPC in ~ 1 ml NPC supporto per pozzetto originale di 6-bene.
    NOTA: Aspettatevi che un pozzo confluente di un piatto 6-bene ha 5-10.000.000 cellule; questo può essere confermato contando un'aliquota 10l di cellule usando un hematocytometer prima di ri-placcatura.
  6. Dopo ri-sospensione, NPC ri-piastra come NPC, neuroni o neurosfere. Per mantenere NPC, piatto circa 1-2 milioni di cellule per pozzetto di un 6-pozzetti. L'efficienza della formazione neurosfere può variare tra esperimenti e linee cellulari, ma generalmente si verifica meglio se tra 200.000 e 1.000.000 cellule vengono seminate per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti non aderente; se si verifica aggregazione delle neurosfere, ridurre il numero delle cellule seminate. Per differenziare a neuroni, piastra circa 200.000 cellule per pozzetto di un 6-pozzetti, sostituendo i media NPC con i media neurone.
  7. Immunoistochimica validare ogni linea NPC stabilito. Una volta che il materiale cellulare sufficiente è stata EXPANded, PNG etichette con anticorpi per nestina e SOX2. Linee Validated NPC dovrebbero essere differenziate in neuroni per 4-6 settimane, ed etichettati con anticorpi per III-TUBULINA e MAP2AB.
    1. Fissare cellule in 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° C per 10 min. Permeabilize NPC a temperatura ambiente per 15 min in 1,0% Triton in PBS, e quindi bloccare nel siero asino 5% con 0,1% Triton a temperatura ambiente per 30 min.
    2. Incubare con anticorpo primario nel siero asino 5% con 0,1% Triton, durante la notte a 4C.
      NOTA: Si consiglia i seguenti anticorpi: capra anti-Sox2, 1: 200; Nestin topo anti-umana, 1: 200; coniglio anti-βIII-tubulina, 1: 500; topo anti-βIII-tubulina, 1: 500; topo anti-MAP2AB, 1: 200. (Figura 2).
    3. A seguito di un lavaggio con PBS, incubare cellule anticorpi secondari con l'appropriato anticorpo secondario coniugato alla capra, il mouse o il coniglio a 1: 300, in in 5% di siero asino con 0.1% Triton per 1-2 ore a temperatura ambiente. Per visualizzare i nuclei, cellule macchia con 0,5 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) e poi montare con Vectashield.

4. NPC trasduzione

  1. Utilizzare spinfection (centrifugazione di piastre di coltura di cellule in presenza del virus a 1.000 xg per 1 ora) per aumentare la percentuale di cellule trasfettate 21. Aspirare i media e sostituirlo con la sovraespressione pertinente (o controllo) lentivirus (o retrovirus), titolato alla molteplicità desiderato di infezione (MOI) (in genere 1-10), diluito nei media NPC. Utilizzare 1,5 ml di volume per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti (o un volume opportunamente scalati per altri tipi di piastre di coltura tissutale). Spin a 1.000 xg e 37 ° C per 1 ora in una centrifuga piatto.
    NOTA: Idealmente, la trasduzione NPC con lentiviral o vettori retrovirali entro 1-2 giorni di scissione. Sia che si utilizzi commerciali o virus in laboratorio preparati, può essere utile per poi titolare adeguatamente lotti di virus in anticipo per diluizione seriale. (Figura 3).
  2. Per ridurre celmorte lular, sostituire il supporto entro 8 ore di spinfection.
    NOTA: l'integrazione virale e l'espressione del transgene dovrebbero essere rilevabili entro 24 ore dal gene reporter fluorescenza. (Se il virus non ha un reporter fluorescente, questo è più difficile da valutare; trasfezione di successo può essere meglio convalidato da immunoblot, immunoistochimica o qPCR per i prodotti iperespressione.) Espressione completa può richiedere 3-7 giorni; spinfections ripetuti con virus possono essere richieste ulteriori per aumentare la percentuale di cellule transfettate. Spinfections ricorrenti possono verificarsi ogni giorno, ma non deve essere così frequenti. Idealmente, se si utilizza un reporter fluorescente,> 80% delle cellule deve essere etichettato.

5. neurosfere Migration Assay

NOTA: Neurosfere forma spontaneamente, seguendo la dissociazione enzimatica di NPC (da un modo identico a quello utilizzato per l'espansione NPC - passaggi 3,3-3,6), se le cellule sono coltivate in sospensione in NPC media.

  1. In breve, crescere dissociarsid NPC nei media NPC per 48 ore in piastre non aderenti al fine di generare neurosfere. (Figura 4).
  2. Per la migrazione neurosfere, preparare piatti Matrigel freschi utilizzando supporti NPC freddo, piuttosto che DMEM, in una piastra a 96 pozzetti, 1-2 ore prima di neurosfere raccolta. Non aspirare Matrigel dai pozzi.
  3. Come originariamente pubblicato per cellule staminali embrionali derivate da neurosfere 22, selezionare manualmente neurosfere NPC-derivati ​​al microscopio, dopo il lavaggio una volta nei media NPC per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire una neurosfere a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti Matrigel rivestite.
  4. Aggiungere un ulteriore 0,5 mg Matrigel, diluito nei media NPC freddi, le neurosfere in ciascuna piastra da 96 pozzetti.
  5. Centrare manualmente ogni singolo neurosfere nel mezzo del pozzo con un puntale.
    NOTA: È importante scegliere neurosfere di dimensioni simili, al fine di ridurre la variabilità nei risultati.
  6. Lasciare la migrazione a verificarsi per 48 ore e poi fissare le cellule wesima 4% paraformaldeide e macchia con marcatori immunoistochimici desiderati.
  7. Se la migrazione radiale è determinato, neurosfere fotografia nel loro interamente utilizzando un obiettivo 4x microscopio. Escludere qualsiasi contatto neurosfere bordo del pozzo o una seconda neurosfere dall'analisi.
    NOTA: Se si verifica la migrazione per più di 48 ore, la migrazione radiale risultante sarà probabilmente troppo grande per immagine utilizzando un obiettivo 4x.
  8. Misurare la migrazione media da ogni neurosfere utilizzando il software NIH ImageJ (Figura 5). Questo può essere fatto utilizzando uno dei metodi di analisi descritti di seguito:
    1. Migrazione Radial:
      1. Tracciare manualmente il bordo delle più lontane migrazione delle cellule con lo strumento di selezione a mano libera quindi utilizzare la funzione (Ctrl + M) Misura per calcolare l'area della forma risultante. Prima di misurare l'area assicurarsi che Area sia selezionata nella finestra Imposta Misurazioni trovato nella scheda Analizza. Utilizzare ilvalore della misura dell'area e l'equazione per l'area di un cerchio (A = πr 2) per determinare il raggio (esterno).
      2. Tracciare il bordo del neurosfere originale, misurare l'area e calcolare il raggio (interna) nello stesso modo. Calcolare la migrazione totale radiale come differenza fra il raggio esterno ed interno.
    2. Greatest migrazione cellulare:
      1. Misurare la distanza percorsa delle cinque celle lontane dal bordo del neurosfere interna utilizzando lo strumento di selezione lineare seguita dalla funzione (Ctrl + M) Misura.

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Risultati

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Rosette neurali possono essere identificati morfologicamente, utilizzando un microscopio campo chiaro, per l'aspetto caratteristico come cluster rotonde di cellule neuroepiteliali con apico-basale polarità (Figura 1). Anche se gli NPC sono tipicamente coltivate a densità molto elevata delle cellule, subito dopo passaging, leggermente a forma di piramide soma e bipolare struttura neurite è visibile (Figura 1D). NPC convalidate esprimono nestina e SOX2 nella maggior parte delle cellule, s...

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Discussione

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Abbiamo descritto i metodi con cui differenziare hiPSCs in PNG, un tipo di cellule neurali in cui una frazione significativa della firma genica dei neuroni hiPSC derivati ​​si conserva e che possono servire come proxy per i percorsi di sviluppo potenzialmente contribuiscono alla patogenesi della malattia 8, 11. Inoltre, come abbiamo descritto, gli NPC sono una popolazione neuronale robusto replicativa e facilmente trasdotta, che riteniamo possa essere adatto per studi molecolari e biochimici di predisposizion...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Kristen Brennand è una Investigatrice della New York Stem Cell Foundation - Robertson. Il Brennand Laboratory è supportato da una sovvenzione per giovani ricercatori Brain and Behavior, da una sovvenzione R01 MH101454 del National Institute of Health (NIH) e dalla New York Stem Cell Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/F12Life Technologies#11330per terreni HES
DMEM/F12Life Technologies#10565per terreni neurali
KO-Serum ReplacementLife Technologies#10828Deve essere testato molto
GlutamaxLife Technologies#35050
NEAALife Technologies #11140
N2Life Technologies #17502-048Deve essere testato per lotto
B27-RALife Technologies #12587-010Deve essere testato per lotto
FGF2Life Technologies#13256-029Risospensione in PBS + 1%
BSA LDN193189Stemgent#04-0074
SB431542Stemgent#04-0010
BDNFPeprotech#450-02Risospensione in PBS + 0,1% BSA
GDNF Peprotech #450-10Risospensione in PBS + 0,1% BSA
Dibutirril-AMP ciclicoSigma #D0627Risospensione in PBS + 0,1% BSA
Acido L-ascorbicoSigma#A0278Risospensione in H20
STEMdiff Neural Rosette Selezione ReagenteStemcell Technologies #05832
AccutaseInnovativo Cell TechnologiesAT-104
Collagenasi IVLife Technologies#17104019
CF1 mEFsMillipore#PMEF-CF
Poli-L-OrnitinaSigmaP3655
Laminina, Topo Naturale 1 mgLife Technologies#23017-015
BD MatrigelBD#354230Risospendere su ghiaccio in DMEM freddo a 10 mg/ml, utilizzare 1 mg per due piastre equivalenti a 6 pozzetti
Piastre a 6 pozzetti trattate con coltura tissutaleCorning3506
Piastre a 6 pozzetti con attacco ultra bassoCorning3471
capra anti-Sox2 Santa Cruzsc­ 17320uso in 1:200
topo anti-umano NestinMilliporeMAB5326uso in 1:200
coniglio anti-β III-tubulinaCovancePRB­ 435Putilizzo a 1:500
mouse anti-β III-tubulinaCovanceMMS­ 435Putilizzo in scala 1:500
mouse anti-MAP2ABSigmaM1406utilizzo in scala 1:200
Centrifuga a piastreBeckman CoulterBeckman Coulter Allegra X-14 (con portatarga SX4750)

Riferimenti

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