Articolo metodologico

Manipolazione e

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DOI:

10.3791/52496

⸱

9 febbraio 2015

 ,  , 
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

In questo articolo

Sommario

Descriviamo i metodi di manipolazione degli ovociti immaturi di Xenopus laevis, la maturazione in vitro degli ovociti in ovuli e l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi. Questo protocollo consente la degradazione di alcune proteine materne e la sovraespressione di geni di interesse alla fecondazione, e quindi è prezioso per studiare il ruolo di fattori specifici nello sviluppo embrionale precoce.

Abstract

Le uova di anfibi sono state ampiamente utilizzate per studiare lo sviluppo embrionale. Lo sviluppo embrionale precoce è guidato da fattori immagazzinati dalla madre accumulati durante l'ovogenesi. Al fine di studiare i ruoli di tali fattori materni nello sviluppo embrionale precoce, è auspicabile manipolare le loro funzioni fin dall'inizio dello sviluppo embrionale. I metodi convenzionali di interferenza genica si ottengono mediante l'iniezione di oligonucleotidi antisenso (oligo) o mRNA in uova fecondate, consentendo rispettivamente la sotto- o la sovra-espressione di proteine specifiche. Tuttavia, questi metodi richiedono normalmente più di diverse ore prima che l'espressione proteica sia influenzata e, quindi, l'interferenza delle funzioni geniche non è efficace durante le prime fasi embrionali. Qui, introduciamo un sistema sperimentale in cui i livelli di espressione delle proteine materne possono essere alterati prima della fecondazione. Gli ovociti di Xenopus laevis ottenuti dalle ovaie vengono defollicolati mediante incubazione con enzimi. Gli oligo antisenso o mRNA vengono iniettati negli ovociti defollicolati allo stadio di vescicola germinale (GV). Questi ovociti vengono maturati in vitro in ovuli allo stadio di metafase II (MII), seguiti da iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI). In questo modo, fino al 10% degli embrioni ICSI può raggiungere lo stadio di girino natatorio, consentendo così test funzionali di knockdown o sovraespressione di geni specifici. Questo approccio può essere un modo utile per studiare i ruoli dei fattori immagazzinati dalla madre nello sviluppo embrionale precoce.

Introduzione

Xenopus laevis è un diffuso, potente organismo modello per studiare lo sviluppo 1. Questo perché le uova di Xenopus sono insolitamente grande (circa 1,2-1,4 mm, in confronto alle controparti di mammifero essendo circa 0,1 mm) e abbondante. Le uova contengono componenti maternamente sintetizzati e conservati, che sono sufficienti per guidare lo sviluppo embrionale fino transizione a metà blastula (MBT, che si verificano nella fase 8-8.5 con 4.000-8.000 cellule). MBT è accompagnata da attivazione del genoma zygotic, che quindi produce prodotti genici embrionali che indirizzano un ulteriore sviluppo.

Numerosi studi volti a identificare i fattori materni importanti per lo sviluppo. Molti studi si basano sulla iniezione di oligonucleotidi antisenso (oligonucleotidi) compresi oligonucleotidi morfolino in embrioni fecondati, nel qual caso la degradazione di proteine ​​materni può essere osservato nella fase gastrula 2-4. In alternativa, mRNA sono iniettati a em fecondatobryos a disturbare le funzioni del gene o di tracciare sorti di proteine ​​sovraespresse. Tuttavia, l'iniezione in embrioni stadio unicellulare normalmente non influenza i livelli di espressione delle proteine ​​materne alle primissime fasi embrionali prima MBT.

Heasman e Wylie stabilito il metodo di trasferimento dell'host per superare questo problema 5. In loro metodo, gli ovociti defolliculated manualmente vengono iniettati con oligonucleotidi antisenso e trasferiti in femmine di accoglienza 6. Le proteine ​​sono inibiti prima della fecondazione in modo che i ruoli delle proteine ​​ha diminuito in sviluppo embrionale precoce possono essere esaminate. Questo metodo esaurimento materno ha portato all'identificazione di numerosi ruoli di sviluppo uniche di proteine ​​materne, come rivisto in 7.

In questo rapporto, abbiamo dettaglio il nostro metodo recentemente sviluppato, in cui è raggiunto l'esaurimento materno o sovraespressione di mRNA prima della fecondazione, senza defolliculation manuale e trasferimento di accoglienza8. Defolliculation manuale richiede un sacco di tempo e di trasferimento di accoglienza spesso ha bisogno di tecniche abili e la licenza specifica per la chirurgia degli animali, ostacolando così l'uso frequente del metodo di esaurimento materno. Defolliculation e trasferimento di accoglienza sono sostituite da defolliculation enzimatica 9,10 e iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) 11-13, rispettivamente. ICSI alle uova è stato originariamente utilizzato per la produzione di rane transgeniche 12. Sperma ed embrionali nuclei sono stati trapiantati in in vitro ovociti maturati anfibi 11,14,15. Qui, dimostriamo il nostro metodo step-by-step per iniettare sperma al vitro ovociti maturati che sono stati pre-iniettato con oligonucleotidi antisenso o mRNA.

Protocollo

NOTA: Tutte sperimentazione di rane è stata effettuata secondo i requisiti del Regno Unito Home Office.

1. Preparazione di Xenopus laevis ovociti

  1. Circa una settimana prima del prelievo ovocitario, iniettare rane femminili con 150 U di incinta Mare Serum gonadotropina (PMSG) per la pre-priming utilizzando 1 ml siringa sterile con un ago 27 G. Iniezione viene eseguita per via sottocutanea nella linfa dorsale sac.
    NOTA: E 'ottimale per utilizzare le rane che non depongono le uova per un lungo periodo (almeno più della metà anno) o che non hanno mai previsto uova prima.
  2. Conservare rane già predisposte in un serbatoio di acqua fissato a 18 ° C in luce ambiente controllata (07:00-19:00: su, 19:00-07:00: off).
  3. Il giorno della raccolta degli ovociti, preparare 1 l di 1x modificati Solution (MBS) di Barth da 10x MBS magazzino diluendo con acqua bidistillata (DDH 2 O), e aggiungere la penicillina e la streptomicina alla concentrazione finale di 10 mg / mlciascuno (MBS + PS). 10x MBS magazzino composto da 880 mM NaCl, KCl 10 mM, NaHCO 3 24 mm, 8,2 mm 4 MgSO .7H 2 O, 3,3 mM Ca 2 .4H 2 O, 4.1 CaCl (NO 3) mm 2 6H 2 O, 100 HEPES mM, pH 7,5.
  4. Anestetizzare una rana pre-imbeccato da iniezione sottocutanea di 120 mg (in 400 ml) di Tricaine methanesulfonate (MS222). Mantenere la rana iniettato in un piccolo serbatoio d'acqua.
  5. Dopo 10 minuti, controlla la rana anestetizzato girando sopra dal successo rane anestetizzati non rispondono a questo. Se l'anestesia è incompleta, aggiungere ghiaccio nel serbatoio e attendere per altri 10 min.
  6. Prendete la rana dal piccolo serbatoio e posto in decubito dorsale su un panno umido pulire.
  7. Utilizzando pinze e un piccolo forbici chirurgiche, pizzicare la pelle e fare una piccola incisione (2 cm) nella parte inferiore dell'addome, lateralmente alla linea mediana. Fare un'altra incisione sull'altro lato.
  8. Dopo aver tagliato la pelle, sollevare lo strato muscolare wiforcipe ° e rendono l'incisione nello strato muscolare.
  9. Osservare dell'ovaio dopo strato muscolare viene tagliato e tirare l'ovaio fuori dalle incisioni con pinze.
  10. Trasferimento estratto ovaio di un tubo da 50 ml con la soluzione MBS.
    NOTA: cercare di raccogliere quanto più possibile da ovaio due incisioni.
  11. Massacrare la rana femminile per dissanguamento, seguita da zero per il successivo smaltimento adeguato.
  12. Sciacquare dell'ovaio estratto un paio di volte con MBS + PS fino sangue viene lavato via. Poi, il trasferimento l'ovaio a un piatto di 9 centimetri Petri contenente MBS + PS
    NOTA: Controllare la qualità degli ovociti sotto un microscopio da dissezione, a questo punto. Se ovociti sono apparentemente cattiva qualità, come ad esempio gli ovociti con pigmentazione irregolare nella metà degli animali (Figura 1A), non trattare ulteriormente e invece ottenere un nuovo ovaio. Idealmente, gli ovociti devono avere emisferi animali ugualmente pigmentati e di circa altrettanto dimensioni.
  13. Tease l'ovaio in piccoli pezzi(1-2 cm 2) e raccogliere 5 ml di oociti in un nuovo tubo 50 ml.
  14. Lavare 5 ml dell'ovaio strappato un paio di volte con MBS + PS e aggiungere MBS + PS a 15 ml.
  15. Aggiungi 7 unità di enzima per defolliculation alla sospensione ovaio (vedi Materiali List).
    NOTA: Ricostituire enzima liofilizzato con 10 ml di DDH 2 O (28 unità / ml). Posizionare la fiala per 30 min in ghiaccio con occasionali vorticoso delicato. Aliquotare 250 microlitri e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
  16. Incubare il pezzo ovario con l'enzima per 1 ora con agitando delicatamente sul agitatore (velocità di 15 giri / minuto, pari a circa 0.014 xg).
    NOTA: Per la rimozione quasi totale delle cellule del follicolo, 2 hr a 2 ore 15 min incubazione con è normalmente necessaria l'enzima. Più lungo di incubazione è necessario per l'esperimento di trasferimento nucleare ovocita 16.
  17. Dopo 1 ora di incubazione, prendere un piccolo numero di ovociti trattati (10-20 ovociti) e trasferimento in un piatto di 6 centimetri di Petri contenente MBS + PS Controllare il extent di defolliculation sotto un microscopio da dissezione. Se ovociti sono separati gli uni dagli altri ed almeno parzialmente defolliculated (Figura 1B), procedere immediatamente alla successiva reazione di arresto (passo 18). Se ovociti vengono ancora pesantemente circondate da cellule del follicolo, incubare per un extra 15 minuti al massimo.
  18. Aggiungere un sacco di MBS + PS per fermare la reazione e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio per 10 volte.
    NOTA: Aggiungere MBS + PS versando alla parete di un tubo da 50 ml, ma non direttamente ovociti. Dopo sospensione in MBS + PS, piccoli ovociti immaturi tendono a galleggiare in cima tampone di lavaggio ed eliminare tali piccoli ovociti galleggianti.
  19. Dopo i lavaggi, trasferimento in un piatto di 9 centimetri Petri contenente MBS + PS
    NOTA: Da questo punto in poi, mantenere ovociti a 16-18 ° C per quanto possibile. Questo può essere fatto mantenendo il piatto-ovociti contenente una fase a temperatura controllata.
  20. Selezionare fase VI ovociti secondo la classificazione di Dumontper usi successivi e il trasferimento ad un nuovo nove centimetri piastra Petri contenente MBS + trasferimento degli ovociti PS può essere fatto utilizzando una pipetta di vetro con una dimensione appropriata punta (più grande della dimensione ovocita).
    NOTA: ovociti di buona qualità dovrebbero avere un emisfero animale uniformemente pigmentata con netto contrasto tra l'emisfero animale e l'emisfero vegetali, e sono circa uguali dimensioni (Figura 1C). Fase VI ovociti rappresentano ovociti in grado di rispondere al progesterone completamente sviluppati (diametro degli ovociti è di circa 1,2-1,4 mm).

2. iniezione di oligonucleotidi antisenso o mRNA in oociti

NOTA: Tutte le fasi di questa sezione dovrebbe essere fatto a 16-18 ° C su un palco microscopio dotato di acqua circolante a temperatura controllata o in una scatola di plastica pieno di ghiaccio.

  1. Trasferire 200-300 ovociti selezionati in un nuovo piatto Petri 9 centimetri riempito con MBS + PS, in cui verrà eseguita microiniezione.
    NOTA: In each condizioni, vengono normalmente utilizzati 200-300 ovociti. In totale, circa 1.000 ovociti vengono utilizzati in un esperimento.
  2. Per la preparazione di iniezione di oligonucleotidi antisenso o mRNA, estrarre lo stantuffo di metallo di un microinjector.
  3. Riempire un capillare di vetro con olio minerale con la siringa e inserire il capillare di vetro piena di olio al pistone di metallo di microinjector.
    NOTA: Un capillare di vetro è tirato dalla micropipetta estrattore. Questi aghi sono tenuti in una scatola senza danneggiare punte.
  4. Tagliare la punta dell'ago utilizzando piccole forbici chirurgiche al microscopio puntando come piccola punta diametro iniettabile possibile.
    NOTA: La punta dell'ago può essere affilata utilizzando un micro fucina o micropipetta beveler. Per smussare l'ago con un angolo di 25 ° migliora la capacità di penetrare la parete ovocita.
  5. Mettere una piccola striscia di Parafilm sul palco di un microscopio da dissezione ed erogare una goccia 3 ml di oligo antisenso o soluzione mRNA.
  6. Spostare il tip dell'ago iniezione nel piccola goccia di soluzione e riempire l'ago con la soluzione da iniettare.
    NOTA: Se la punta dell'ago di iniezione è troppo piccola, le bolle d'aria dovrebbe apparire sulla punta del pistone metallico. Poi, fare una punta più grande sul ago di iniezione fino a quando questo non accade.
  7. Segnare l'ago dell'iniezione circa 0,5 mm dalla punta. Questo simbolo è utilizzato come indicatore della profondità di iniezione.
  8. Inserire la punta dell'ago in un oocita lungo il confine equatoriale puntando al punto centrale del ovocita (sotto la vescicola germinale) mentre delicatamente tenendo il lato opposto del ovocita al punto di iniezione con una pinza per impedire movimenti indesiderati durante l'iniezione ovociti .
    NOTA: Trovare l'area libera di cellule del follicolo (Figura 1B) e inserire l'ago da quel punto in quanto anche un ago sottile non può spesso penetrare in uno strato di cellule del follicolo.
  9. Espellere 4.6 ng / 4.6 nl o 9.2 ng / 9.2 nl di antisoligo Ense, o un volume adeguato di mRNA (250 pg a 13,8 ng) utilizzando l'interruttore a pedale. Dettagli di preparazione sono descritti oligo antisenso in 7.
  10. Trasferire gli ovociti iniettati in un piatto di 6 centimetri Petri piena di MBS + PS integrato con 0,1% di BSA (mezzo di incubazione di ovociti e sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,45 micron pori).
  11. Incubare gli ovociti a 16 ° C o 18 ° C per 1-2 giorni.
    NOTA: iniettato ovociti possono essere sottoposti a maturazione in vitro diverse ore dopo l'iniezione, nel qual caso l'iniezione di 4,6 ng oligonucleotidi antisenso è preferibile. Una regola generale è che più breve è il periodo di incubazione, migliore il successivo sviluppo embrionale.

3. In Vitro Maturazione (IVM) di ovociti

  1. La sera di questo esperimento di maturazione dell'ovocita, prendere soluzione progesterone magazzino (30 mm di etanolo) da -80 ° C freezer e sciogliere precipitati a temtemperatura con vortice occasionale.
    NOTA: Il progesterone magazzino è normalmente lasciato a temperatura ambiente per 30 minuti a 1 ora.
  2. Aggiungere 5 ml di progesterone magazzino in 50 ml di MBS + PS (Maturazione mezzo; concentrazione finale del progesterone a 3 mM) e Agitare per 30 minuti per distribuire progesterone nella soluzione altrettanto.
  3. Preparare agarosio rivestite sei centimetri piatti per vitro trattamento di maturazione in.
    1. Aggiungere 1 g di agarosio a 50 ml di 1x MBS senza magnesio e calcio.
    2. Sciogliere agarosio mediante riscaldamento in un forno a microonde.
    3. Versare un piccolo volume di soluzione di agarosio a 6 piatti cm per coprire il fondo di piatti.
    4. Attendere almeno 30 minuti fino a quando la solidificazione.
    NOTA: Rivestimento Agarose impedisce incollaggio di ovociti per piatti. Una volta in ovociti maturati in vitro sono strettamente collegati a piatti, è più probabile che gli ovociti vengono attivati ​​da stimoli che ricevono durante il distacco dalla dishes.
  4. Versare 5-8 ml di maturazione medio piatti agarosio rivestite e trasferire 200-300 ovociti in ogni 6 piatti cm.
    NOTA: tenta di trasferire gli ovociti con una minima quantità di mezzo di ovociti incubazione.
  5. Incubare per 16 ore a 16 ° C.
    NOTA: Per esempio, iniziare il trattamento alle 5 del pomeriggio e terminare alle ore 9 del giorno successivo.

4. Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI)

  1. Sperma congelato Stock preparazione
    NOTA: La seguente preparazione sperma dovrebbe essere fatto prima di iniziare l'esperimento di maturazione degli ovociti, e le scorte di sperma congelato sono conservati a -80 ° C per ICSI.
    1. Raccogliere i testicoli da una rana maschio seguendo i passaggi 1,4-1,11, fatta eccezione per tirare grasso e testicoli fuori dalle incisioni con pinze e rimozione testicoli dal grasso.
    2. Lavare testicoli in 1x Modified Ringers di Marc (MMR, NaCl 100 mM, KCl 2 mm, 1 MgSO mm 4, 2 mM CaCl 2, 5 HEPES mM, pH 7,4).
    3. Rimuovere un grassovasi sanguigni d rotolando testicoli lavati su un fazzolettino di carta pulito e poi rimuovendo restanti vasi sanguigni usando pinze.
    4. Mettete ogni testicolo in un piatto 3,5 centimetri Petri contenente 1 ml di 1x MMR.
    5. Tagliare longitudinalmente con le forbici sottili, e strappare in piccoli pezzi con pinza fino a quando rimangono grossi pezzi.
    6. Pipetta su e giù con 1 ml di punta di plastica il cui fine è tagliato, e il carico 1 ml di soluzione testicoli schiacciati in un omogeneizzatore vetro.
    7. Li Omogeneizzare di 2-3 colpi e poi versare la soluzione su un filtro a pori 50 micron fissato alla parte superiore di un tubo da centrifuga da 15 ml. Lasciare che la soluzione per passare attraverso il filtro.
    8. Ripetere il punto 4.1.7 risospendendo restante testicolo tagliato in 1 ml di 1x MMR. Infine, lavare il omogeneizzatore un paio di volte con 1x MMR e passare attraverso il filtro.
    9. Ripetere i punti 4.1.5 a 4.1.8 per l'altro testicolo e la piscina due testicoli in uno 15 ml tubo da centrifuga.
    10. Spin le cellule a 800 xg a 46; C per 20 min.
    11. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule pellet in 2 ml di 1x MMR. Poi, trasferire in un nuovo tubo.
      NOTA: Accertarsi che non le cellule del sangue visibili sono presenti.
    12. Preparare un gradiente passo di un ultra-trasparente tubo da centrifuga di 14 ml. Strato inferiore: 4 ml del 30% iodixanolo. Secondo strato di fondo: 1 ml di 20% iodixanolo. Terzo livello di fondo: 5 ml di 12% iodixanolo. Strato superiore: testicolo cellule in 2 ml di 1x MMR. Sovrapponete le pendenze molto delicatamente con una pipetta 1 ml (sovrapporre lentamente per non disturbare la fase in basso).
      NOTA: Solo uno strato di 30% iodixanolo dovrebbe funzionare anche per isolare soltanto sperma.
    13. Spin nel rotore SW40 utilizzando un'ultracentrifuga a 10.000 xga 4 ° C per 15 min (decelerazione senza break).
    14. Rimuovere delicatamente il tubo dal ultracentrifuga. Conferma un'interfaccia tra ogni strato del gradiente e il pellet in basso.
    15. Raccogliere la frazione di sperma dal pellet.
    16. Risospendere il pel spermaentrare 1x MMR per lavando iodixanolo. Spin a 800 xg a 4 ° C per 20 min.
      NOTA: Se un lotto di spermatozoi rimangono ancora in sospeso dopo lo spin, re-spin il surnatante a 3.220 xg a 4 ° C per 20 minuti e piscina lo sperma pellet.
    17. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet di spermatozoi in 1 ml di 1x Preparazione Buffer Nucleare (NPB; 250 mM saccarosio, 0,5 spermidina mM tricloridrato, 0,2 Spermine mM tetraidrocloruro, 1 mM EDTA, 15 mM HEPES, pH 7.7) 13. Poi, il trasferimento a un tubo Eppendorf.
    18. Aggiungere 50 ml di 10 mg / ml soluzione Digitonin a 1x NPB (Risospendere Digitonin polvere in DMSO a 50 mg / ml e congelare aliquote a -80 ° C. Prima dell'uso, diluire il 50 mg / ml un'aliquota di 10 mg / ml di 1x NPB. Non utilizzati 10 mg / ml Digitonin possono essere congelati e conservati a -20 ° C e riutilizzato) a 1 ml della soluzione di spermatozoi.
    19. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    20. Controllare un tasso di permeabilizzazione da colorazione DAPI (0,3 mg / ml DAPI come finaconcentrazione l). Se meno del 95% delle cellule sono permeabilizzate, incubare un poco più lungo.
      NOTA: A volte se troppi spermatozoi vengono incubate contemporaneamente (specialmente quando spermatozoi vengono raccolti da più testicoli), è difficile permeabilize, nel qual caso può essere necessario aggiungere una piccola quantità supplementare di Digitonin; ad esempio se il 20% di spermatozoi non sono permeabilizzate, viene aggiunto un ulteriore 20 microlitri di Digitonin.
    21. Arrestare permeabilizzazione aggiungendo 10% BSA a una concentrazione finale del 3%.
    22. Spin le cellule a 4 ° C.
      NOTA: Prova minimo della velocità di centrifugazione possibile partendo da 100 xg per 5 min. Se non è sufficiente, aumentare la velocità e / o di tempo.
    23. Lavare le cellule con 0,3% BSA in 1x NPB e centrifugare alla stessa velocità come passo 4.1.22. Nel frattempo, preparare la memoria temporanea Sperm (SSB, 2 ml di 2x NPB, 120 ml di 10% BSA, 1,2 ml autoclave glicerolo, 680 ml ​​di H 2 O).
    24. Aggiungere 500 ml di SSB agli spermatozoipellet. Pipette più volte su e giù per sospendere nuovamente con una punta tagliata in modo da non danneggiare le cellule.
    25. Lasciare equilibrare notte a 4 ° C.
    26. Pipettare le cellule su e giù più volte con una punta di taglio.
    27. Diluire un paio di volte in 10 microlitri 1x MMR o in 1x PBS per contare le cellule utilizzando emocitometro.
    28. Congelare come aliquote a 30.000 spermatozoi / ml (o superiore) direttamente a -80 ° C e conservare a -80 ° C in un singolo uso aliquote.
  2. ICSI di ovociti in vitro maturato
    NOTA: Tutti i processi che coinvolgono ovociti dovrebbe essere fatto a 16-18 ° C.
    1. Preparare una pipetta di vetro per il trasferimento di ovociti maturati.
      NOTA: La pipetta di vetro deve essere sufficientemente ampia per accogliere ovociti senza stringere.
    2. Sedici ore dopo lo spostamento ovociti al mezzo-progesterone contenente, trasferimento maturata ovociti in una piastra di agarosio rivestita sei centimetri riempito con MBS + PS per il lavaggio.
      NOTA: È importante sottolineare che, movociti atured devono essere trattati con estrema attenzione. Trattamento rude degli ovociti può indurre attivazione spontanea prima dell'iniezione di sperma.
    3. Contare ovociti maturati confermando la comparsa di macchie bianche, che implica la ripartizione vescicola germinale (Figura 2). Se il tasso di maturazione è inferiore a 80%, è improbabile per ottenere il numero sufficiente di sopravvivere embrioni per ulteriori analisi.
      NOTA: cellule del follicolo rimanenti sono pelati dopo la maturazione degli ovociti (Figura 2).
    4. Trasferimento ovociti da MBS lavaggio per un nuovo sei centimetri piatto agarosio rivestite pieno di medio iniezione (Preparare 500 ml: 30 g di Ficoll (6%), 20 ml di 10x MMR e 500 ml di 1,000x PS stock).
    5. Incubare per almeno 30 minuti prima di iniziare ICSI.
    6. Impostare il microinjector come descritto nei passaggi 2,2-2,4.
      NOTA: La dimensione punta dell'ago di iniezione viene mantenuta il più piccolo possibile seguendo la procedura descritta nel passaggio 2.6. Il diametrodell'ago è 20-40 micron. Per smussare la punta dell'ago come descritto al punto 2.4 potrebbe consentire iniezione efficiente.
    7. Fetch l'aliquota di spermatozoi e diluire la sospensione di spermatozoi in sperma tampone di diluizione (SDB; 250 mM saccarosio, KCl 75 mm, spermidina 0,5 mm 0,2 Spermine mM, 200 micron HEPES pH 7.5).
      NOTA: diluizione può essere variato a seconda delle dimensioni di un ago e così via. Diluire 120 volte di 30.000 spermatozoi / ml magazzino come un tentativo iniziale e regolare ulteriormente se necessario.
    8. Mettere una piccola striscia di Parafilm sul palco di un microscopio da dissezione. Mescolare soluzione microiniezione pipettando e dispensare qualche goccia ml di soluzione di sperma.
    9. Aspirare la sospensione sperma diluito l'ago, iniettare 4,6 nl in 10 gocce successive contengono 0,3 mg / ml DAPI su un vetrino da microscopio, e contare rapidamente il numero di spermatozoi consegnato per iniezione su un microscopio a fluorescenza.
      NOTA: Obiettivo 1-2 spermatozoi per iniezione. Se necessario, diluire la soluzione per l'iniezione di spermatozoi piùe controllare il numero di spermatozoi per iniezione di nuovo fino a raggiungere una concentrazione desiderata.
    10. Espellere la soluzione per l'iniezione di prova e riempire una nuova soluzione per l'iniezione di spermatozoi con una adeguata concentrazione.
    11. Iniettare 4.6 nl di soluzione di spermatozoi a 100 ovociti maturati.
      NOTA: È importante iniettare continuamente la soluzione. Prima determinare il tempo necessario per l'espulsione 4,6 nl (normalmente 1-2 sec). Ripetere la seguente processo; iniettare in un ovocita, attendere alcuni secondi, rimuovere un ago e mock-iniezione in soluzione di iniezione, attendere alcuni secondi, iniettare in un ovocita. Questa iniezione continua impedisce anche il blocco della punta dell'ago. In alternativa, il metodo che utilizza una pompa 13 può essere utilizzato.
    12. Dopo circa 100 iniezioni, espellere la soluzione sperma rimanente e ri-riempire la soluzione spermatozoi (utilizzare la stessa soluzione di sperma, ma pipetta su e giù prima erogazione).
      NOTA: Se l'ago non aspira bene soluzione sperma, ha tagliato la punta della necessitàle. Se questo non migliora la situazione, preparare un nuovo ago.
    13. Ripetere il processo di iniezione fino a quando tutti gli ovociti vengono iniettati.
      NOTA: se la qualità degli ovociti è buona e l'iniezione è successo, la contrazione di ovociti iniettati è visto entro 20 minuti del tempo di iniezione.
    14. Spostare i piatti iniettato a 16 ° C o 18   ° C incubatore.
    15. 4-5 ore dopo l'iniezione, verificare il tasso di scissione degli embrioni ICSI.
      NOTA: solchi Decolleté di questi embrioni non possono essere così chiara come quelle di normali embrioni fecondati. Alcuni embrioni mostrano anche divisioni anormali, che potrebbero essere causati da iniezioni multiple di spermatozoi.
    16. Trasferimento spaccati embrioni compresi embrioni anormalmente clivati ​​a mezzo di incubazione (Preparare 500 ml: 20 g di Ficoll (4%), 5 ml di 10x MMR e 500 ml di 1,000x PS stock).
    17. Incubare gli embrioni sia a 16   ° C durante la notte o 18 ° C incubatore.
    18. La mattina dopo, il trasferimento Embryos a 0.1x MMR e contare sopravvivere embrioni.
    19. In media, circa il 10% degli ovociti spermatozoi-iniezione in grado di sviluppare la fase di nuoto girino (Figura 3A).

Risultati

Lo sviluppo embrionale di embrioni ICSI con ovociti in vitro maturazione è stata esaminata (Figura 3A). Tassi maturazione degli ovociti GV alla fase MII sono variabili e dipende in gran parte la qualità degli ovociti. In buone esperimenti, quasi il 100% degli ovociti GV rispondere alle progesterone e mostrano segni di maturazione degli ovociti, diventando infine le uova in fase MII. Tutti ovociti maturati sono stati sottoposti a ICSI e circa il 25% di uova iniettate spaccati (Figura 3A, n = 13 per il controllo scrambled ovociti oligo-iniettato e n = 7 per non ovociti oligo-iniezione). Circa il 60% o 80% degli embrioni spaccati, prodotti a partire da ovociti oligo-iniettato controllo o ovocita non per iniezione, rispettivamente, hanno raggiunto la fase blastula / gastrula. Tra gli embrioni blastula / gastrula, circa la metà degli embrioni in campioni oligo-iniettato erano di buona qualità (quasi segni di scissione anormale e apoptosi), mentre l'82% degli embrioni blastula / gastrula erano di buona qualità in ncampioni on-iniettati (Figura 3A). Infine, il 41% e l'11% degli embrioni spaccati in campioni oligo-iniettato raggiunsero la risposta muscolare e le fasi di nuoto girino, rispettivamente, mentre il 60% e il 29% degli embrioni spaccati in campioni non iniettato fatto (Figura 3A). Questi embrioni ICSI sono la miscela di embrioni normali e patologici (Figura 3B). Alcuni di loro subiscono metamorfosi e si sviluppano a maturare rane 8. Questi risultati suggeriscono che l'iniezione di oligonucleotidi antisenso in ovociti GV, seguiti da IVM e ICSI, permette efficiente sviluppo embrionale precoce. Anche se l'iniezione di oligonucleotidi antisenso si diminuisce lo sviluppo embrionale, siamo ancora in grado di ottenere un numero sufficiente di embrioni per molti scopi sperimentali come il controllo i tassi di sviluppo, RT-PCR, Western Blot e così via.

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Fico ure 1: Esempi tipici di Xenopus laevis ovociti di buona qualità o di cattiva qualità per esperimenti di maturazione in vitro. (A) Un esempio di ovociti di qualità cattiva. Ad esempio, gli ovociti mostrano pigmentazione frammentarie non vengono utilizzate per gli esperimenti successivi. Ogni Xenopus laevis ovocita è di circa 1,2-1,4 mm di diametro. (B) Un ovocita parzialmente defolliculated. La metà destra del ovocita è coperta da cellule follicolari, che possono essere distinti dalla presenza di vasi sanguigni. Una freccia indica una zona priva di cellule del follicolo e in cui l'ago di iniezione viene iniettato. (C) Un esempio di ovociti di buona qualità, che sono altrettanto dimensioni e mostrano emisferi animali uniformemente pigmentate con netto contrasto tra l'emisfero animale e l'emisfero vegetale.

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Figura 2:. Xenopus laevis ovociti prima e dopo la maturazione degli ovociti dopo la maturazione, macchie bianche chiare appaiono nella parte superiore degli emisferi animali e cellule follicolari sono staccata. Ogni Xenopus laevis ovocita è di circa 1 mm di diametro.

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Figura 3: Sviluppo di embrioni ICSI, prodotti da ovociti in vitro maturato. (A) Sviluppo di ICSI embrioni per ogni fase è riassunta. Gli oociti sono stati iniettati con controllo strapazzate oligonucleotidi antisenso (iniezione oligo di controllo) o senza iniezione (non iniezione), seguiti da IVM e ICSI. Il corrispondente numero di embrioni in ciascuna fase è indicata sopra le barre. Media ± SEM è mostrato. N = 4-13 esperimenti indipendenti / diverso females. (B) Esempi di sopravvivere embrioni ICSI. Questi embrioni tailbud fase sono stati prodotti in un esperimento, in cui circa 200 ovociti sono stati usati come materiale di partenza.

Discussione

Abbiamo qui i dettagli di un nuovo metodo per esaurire i fattori materni o iperespressione fattori esogeni prima della fecondazione. Questo sistema richiede due microiniezioni, ma salta la chirurgia di rane, utilizzato nel metodo di trasferimento ospitante 7,17. E 'ottimale per rimuovere il passo chirurgia rana in termini di cura degli animali. Inoltre, non dobbiamo prendere in considerazione per la qualità delle rane femminili accoglienza per gli esperimenti di trasferimento, il che significa che possiamo sbarazzarci di un fattore biologico che influenza il successo degli esperimenti. Pertanto in questo sistema la qualità degli ovociti ottenuti da rane PMSG-innescato è un importante fattore biologico che è fondamentale per gli esperimenti di successo. La qualità degli ovociti può essere giudicato dopo la raccolta di ovaio o dopo defolliculation. Se qualsiasi anomalia si osserva in queste fasi, è ottimale per raccogliere un'altra ovaio da una nuova rana. Un altro punto in cui è possibile controllare la qualità degli ovociti è dopo la maturazione degli ovociti. Se meno di 80% di progesteronee-trattati ovociti mostrano segni di maturazione, non si può essere in grado di ottenere il numero sufficiente di embrioni per ulteriori analisi. L'uso di defolliculation enzimatica anziché defolliculation manuale è anche un altro vantaggio di questo sistema per ridurre il lavoro necessario per defolliculation. Tuttavia, è ancora possibile che defolliculation manuale può dare uno sviluppo migliore del trattamento enzimatico.

Come mostrato in Figura 3, quasi il 10% del maturato in vitro ovociti può raggiungere la fase di nuoto girino. Questi dati sono raccolti da 13 esperimenti indipendenti, compresi quelli riportati in 8 e nuovi esperimenti di iniezione. Metodo di trasferimento Host bisogno 75-150 ovociti in ogni trattamento per ottenere dati significativi dal 30-60% degli ovociti trasferiti può raggiungere la fase neurula 17. Il nostro metodo di solito inizia con 200-300 ovociti in ciascun gruppo sperimentale dal momento che circa il 40-60% degli embrioni spaccati può raggiungere ilfase risposta muscolare. Questi dati suggeriscono che entrambi i metodi supportano una velocità di sviluppo ragionevole. Finora abbiamo ottenuto 10 rane vive di controllo mRNA-iniezione e controllo antisenso ovociti oligo-iniettato con questa tecnica, che indica che questo approccio supporta lo sviluppo attraverso la metamorfosi.

Il nostro metodo di manipolazione ovocita-ICSI offre l'opportunità di verificare il ruolo dei fattori materni durante molto precoce dello sviluppo embrionale, subito dopo la fecondazione. Inoltre, la sovraespressione di fattori che modificano la cromatina prima della fecondazione può rendere possibile rimodellare la cromatina materna prima della fecondazione per comprendere gli stati cromatina materni necessari per lo sviluppo. Questa strategia può anche lavorare bene con gli attuali sistemi di editing gene come la trascrizione attivatore-like effettrici nucleasi (TALEN) 18,19 e CRISPR / CAS9 20,21 dal momento che questi può essere espresso anche prima della fecondazione. Pertanto, il nostro nuovo approccio ha un Potential da utilizzare per molte applicazioni in futuro.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati ai membri del laboratorio Gurdon per l'utile discussione. K.M. è un ricercatore presso il Wolfson College ed è supportato dalla Herchel Smith Postdoctoral Fellowship e dalla Great Britain Sasakawa Foundation. Il laboratorio Gurdon è sostenuto da sovvenzioni del Wellcome Trust (RG69899) e MRC a J.B.G.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Gonadotropina sierica di cavalla incinta (PMSG) MSD Animal HealthVm 01708/4309PMSG-Intervet 5000iu polvere e solvente per soluzione iniettabile
Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato sale (MS222)SigmaA5040Per anestesia
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001Per la defollicolazione degli ovociti. Negozio a -20  °C.
Drummond NanojectDrummond Scientific Company3-000-205/206Per microiniezione
capillare in vetro Laboratori Alpha7" Drummond #3-000-203-G / XLper
estrattore per micropipette per microiniezione Strumento SUTTERModello D-97Per microiniezione
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500Per in vitro maturazione e
provetta da centrifuga ultra-trasparente ICSI da 14 ml Beckman Coulter Regno Unito Ltd344060Per la purificazione dello sperma
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)SigmaD1556Per la purificazione dello sperma
DigitoninSigmaD141Reagente per permeabilizzazione cellulare
Agitatore Hybaid HB-SHK-1Per la defollicolazione degli ovociti
Microscopio da dissezione (Stereomicroscopio zoom)ZEISSSemi SV6Per la raccolta degli ovociti e la microiniezione
50 μ filtro per porim CellTrics04-0042-2317Per purificazione dello sperma
UltracentrifugaBeckman CoulterOptima L-100XPPer la purificazione dello sperma
Provetta da centrifuga da 50 mlCellstar Greiner Bio-One227261 o 210261Reazione di raccolta e defollicolazione degli ovociti
Provetta da centrifuga da 15 mlFALCON352097Per la purificazione dello sperma
Petri da 90 mm piatto Thermo Scientific101VR20/C
Piatto per colture cellulari di facile presa, 60  x  Piattoper353004
facile presa, 35  x  15 mmFALCON351008
colture cellulari FALCON da 15 mm di

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