L'editing genetico mediato da TALEN presso il locus AAVS1 consente l'aggiunta di transgeni ad alta efficienza nelle iPSC umane. Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione delle iPSC per la somministrazione di TALEN e del vettore donatore, la trasfezione delle iPSC e la selezione e l'isolamento di cloni di iPSC per ottenere un'integrazione mirata di un gene GFP per generare linee reporter.
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Articolo metodologico
Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'aggiunta mirata di transgeni può fornire un'espressione genica persistente eludendo il silenziamento genico e la mutagenesi inserzionale causata dall'integrazione casuale mediata da vettori virali. Questo protocollo descrive una piattaforma universale ed efficiente per l'aggiunta mirata di transgeni nelle iPSC umane basata sull'utilizzo di TALEN open-source convalidati e di un donatore simile a una trappola genica per fornire transgeni in un locus di approdo sicuro. È importante sottolineare che l'editing genetico efficace è limitato dall'efficienza di consegna dei vettori di editing genetico. Pertanto, questo protocollo si concentra innanzitutto sulla preparazione di iPSC per la trasfezione per ottenere un'elevata efficienza di consegna nucleare. Quando le iPSC vengono dissociate in singole cellule utilizzando un reagente di dissociazione cellulare delicato e trasfettate utilizzando un programma ottimizzato, il >50% delle cellule può essere indotto ad assorbire i grandi vettori di editing genetico. Poiché il locus AAVS1 si trova nell'introne di un gene attivo (PPP1R12C), è stato utilizzato un gene resistente alla puromicina (PAC) legato all'accettore di splicing (SA) per selezionare iPSC mirate, escludendo le cellule di sola integrazione casuale e non trasfettate. Questa strategia aumenta notevolmente la possibilità di ottenere cloni mirati e può essere utilizzata anche in altri esperimenti di targeting genico attivo. Due settimane dopo la selezione della puromicina alla dose aggiustata per la linea iPSC specifica, i cloni sono pronti per essere prelevati mediante dissezione manuale di grandi colonie isolate in pezzi più piccoli che vengono trasferiti in terreno fresco in un pozzetto più piccolo per un'ulteriore espansione e screening genetico e funzionale. È possibile seguire questo protocollo per ottenere facilmente più linee di iPSC reporter GFP utili per l'imaging in vivo e in vitro e l'isolamento cellulare.
Introduzione
La possibilità di riprogrammare le cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte cellule simil-staminali embrionali (iPSCs) fu scoperto da Takahashi et al., Nel 2007 1. Fibroblasti dermici umani trasdotte con retrovirus che esprime quattro fattori di trascrizione (Il Yamanaka così soprannominato Fattori Oct3 / 4, Sox2, c-Myc e Klf4) hanno mostrato di essere molto simili alle cellule staminali embrionali umane (hESC) basati sulla morfologia, la proliferazione, l'espressione genica, e lo stato epigenetico; cruciale, iPSCs sono anche in grado di differenziarsi in cellule di tutti e tre i foglietti embrionali 1. Il p....
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Protocollo
1. Preparazione della matrice di membrana basale e rivestimento dei Plasticware
- Posizionare il congelato membrana basale matrice magazzino da -20 ° C su ghiaccio e scongelare una notte a 4 ° C.
- Dopo lo scongelamento, pipetta 2 mg aliquote di matrice membrana basale in tubi Eppendorf pre-refrigerati. Conservare questi a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Per preparare piatti matrice rivestite membrana basale, scongelare un'aliquota sul ghiaccio fino a quando l'ultimo pezzo di ghiaccio nei scompare provetta Eppendorf (di solito entro ~ 2 ore).
- Dopo lo scongelamento, aggiungere matrice membrana basale a 12 ml di freddo....
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Risultati
Una visualizzazione del protocollo è fornita in figura 2, con i periodi durante i quali iPSCs sono coltivate in mezzo diverso evidenziata da una verde per E8 o blu per NutriStem. E 'importante per trasfettare solo iPSCs di alta qualità; esaminare piatti della cultura in tutta la manutenzione ordinaria e verificare che le culture IPSC contengono colonie principalmente distinti recanti una morfologia ciottoli-simile (Figura 3A); cellule differenziate non dovrebbe occupare più del 10% .......
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Discussione
Le fasi più critiche per il successo generazione di AAVS1 esente mirati iPSCs umani sono: (1) efficiente di Talen e donatori plasmidi in iPSCs by trasfezione; (2) ottimizzare dissociazione di iPSCs nelle singole cellule prima trasfezione e placcatura densità dopo trasfezione; (3) ottimizzare dose ed il tempo di farmaco-selezione basata sulla crescita della linea COPSI; (4) dissezionare con cura e raccolta colonie mirate e trasferimento alla nuova piastra / bene. Rispetto ai metodi simili impiegati per la carta di Hockem.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dal Fondo Comune NIH e dal Programma di Ricerca Intramurale dell'Istituto Nazionale di Artrite, Muscoloscheletrico e Malattie della Pelle.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Matrice della membrana basale Matrigel con fattore di crescita ridotto (GFR), *Senza LDEV, 10 ml | Corning | 354230 | Conservare a -20 °C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Negozio a 4 °C. |
| Costar 6 Well Clear Piastre a pozzetti multipli trattate con TC | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Tecnologie | la media durata | A1517001 | Conservare il terreno basale a 4 °C. Conservare l'integratore a -20 °C. |
| Y-27632 dicloridrato | Tocris | 1254 | Conservare a temperatura ambiente. Una volta disciolto in H2O, conservare a -20 °C. |
| Cloruro di sodio | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100 mm Piatto di coltura trattato | TC Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR - Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Conservare in azoto liquido. |
| DMEM, glucosio alto, piruvato | Life Technologies | 11995-040 | Conservare a 4 °C. |
| Siero fetale bovino definito, origine statunitense | HyClone | SH30070.03 | Conservare a -20 °C. Scongelare a 4 ° C durante la notte e aliquota. Conservare le aliquote a -20 ° C fino al momento del bisogno. |
| di aminoacidi non essenziali MEM (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Conservare a 4 °C. |
| Unità centrale 4D-Nucleofector | Lonza | AAF-1001B | parte del sistema di elettroporazione |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | parte del sistema di elettroporazione |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | All'arrivo, rimuovere la soluzione di cella primaria e integrare e conservare a 4 °C. |
| StemPro Accutase Reagente per dissociazione cellulare | Life Technologies | A1110501 | conservare a -20 °C. Scongelare durante la notte a 4 °C; C e scaldare un'aliquota in un 37 ° C bagnomaria prima dell'uso. |
| NutriStem XF/FF Coltura Medium | Stemgent | 01-0005 | Conservare a -20 °C. Scongelare durante la notte a 4 ° C |
| AAVS1 TALENI (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 e 52638 | |
| [header] | |||
| AAVS1-CAG-EGFP Donatore di ricombinazione omologa | Addgene | 22212 | |
| Puromicina dicloridrato | Life Technologies | A11138-03 | Conservare a -20 °C. Preparare aliquote di lavoro di 1 mg/ml in ddH2O. |
| Pipette Pasteur monouso in vetro borosilicato | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (refrigerate), 120 V 60 Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 volte 750 ml Rotore a secchio oscillante | Thermo Scientific | 75003607 | |
| soluzione di tripano blu, 0,4% | Life Technologies | 15250-061 |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotec....
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Ristampe e permessi
