Articolo metodologico

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

DOI:

10.3791/52531

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20 aprile 2015

 ,  ,  ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gasteroenterology and Hepatology, Academical Medical Center

In questo articolo

Sommario

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In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Abstract

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Le strutture cripto-villi intestinali, denominate organoidi, possono essere mantenute in coltura sostenuta tridimensionalmente se integrate con i fattori di crescita appropriati. Poiché gli organoidi sono molto simili al tessuto originale in termini di differenziazione delle cellule staminali omeostatiche, polarità cellulare e presenza di tutti i tipi di cellule terminalmente differenziate note all'epitelio intestinale adulto, essi costituiscono una risorsa essenziale nella ricerca sperimentale sull'epitelio. La possibilità di esprimere transgeni o RNA interferenti utilizzando vettori lentivirali o retrovirali in organoidi ha aumentato le opportunità per l'analisi funzionale dell'epitelio intestinale e delle cellule staminali intestinali, superando i tradizionali transgenici di topo in termini di velocità e costi. Nell'attuale protocollo video mostriamo come utilizzare la trasduzione di organoidi intestinali tenue con vettori lentivirali, illustrata dall'uso di transgeni inducibili dalla doxicilina o di RNA a forcina corta inducibile da IPTG per la sovraespressione o il knockdown genico. Inoltre, considerando che la coltura di organoidi produce una conta cellulare minima che può anche essere ridotta da un trattamento sperimentale, spieghiamo come trattare gli organoidi per l'analisi a valle finalizzata a RT-PCR quantitativa, RNA-microarray e immunoistochimica. Le tecniche che consentono l'espressione transgenica e il knock down genico negli organoidi intestinali contribuiscono al potenziale di ricerca di queste strutture epiteliali intestinali, stabilendo la coltura di organoidi come un nuovo standard nelle colture cellulari.

Introduzione

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L'epitelio intestinale è uno dei tessuti corporei più rapida proliferazione, che ha causato di attrarre grande interesse dalla ricerca sulle cellule tumorali e staminali. Nel 2009 una tecnica è stata pubblicata per generare culture durevoli di piccole cripte intestinali in matrigel, conservando una struttura dimensionale 3 1. Tali strutture, denominate organoidi intestinali, possono essere coltivate utilizzando tecniche standard, con circostante medio integrato con una serie di fattori di crescita definiti, compreso il BMP-segnalazione inibitore pathway zucca (Nog), il Wnt-via di segnalazione enhancer rspondin 1 (Rspo1) e fattore di crescita epidermico....

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Protocollo

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1. Preparazione di polietilenimmina (PEI) come Transfection Reagent

  1. Disciogliere circa 150 mg di PEI in 100 ml di H 2 O.
  2. Regolare soluzione a pH 7.4 con l'aggiunta di HCl fino soluzione diventa chiara e mescolare fino a completa dissoluzione. Questo può richiedere tra 10 e 60 min e aggiungere acqua ad una concentrazione finale di 1 mg / ml.
  3. Quando chiaro, filtrare la soluzione PEI attraverso sterile filtro da 0,22 micron e conservare in un -80 ° C freezer in aliquote di 5 ml.

2. Produzione di particelle lentivirali

Giorno 1:

  1. HEK293T cellule Spalato....

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Risultati

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Organoide trasduzione lentivirali

La tecnica di trasduzione organoide utilizzando particelle lentivirali dipende corretta gestione dei organoidi prima e durante la trasduzione. Organoidi (Figura 3A) sono state coltivate e furono interrotto in cripte singoli (Figura 3B). Come riportato in precedenza, queste singole cripte, quando coltivate in presenza dell'inibitore GSK3 Chir99021 divennero cripte cistiche 9 (Figura 3C). S.......

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Discussione

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Il protocollo video corrente descrive trasduzione lentivirale di organoidi da epitelio intestinale primaria e l'analisi a valle di queste organoidi utilizzando tecniche RNA quantitative e immunoistochimica.

Trasduzione lentivirali è spesso eseguita in cellule aderenti o galleggianti in piastre di coltura. Poiché la struttura tridimensionale di organoidi li rende difficile da penetrare da particelle virali, sono utilizzati diversi metodi per aumentare l'efficacia. Pretrattamento di or.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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J. Heijmans è supportato da uno stipendio della Fondazione olandese per il cancro (KFW). G.R. van den Brink è supportato da finanziamenti del Consiglio Europeo della Ricerca nell'ambito del Settimo Programma Quadro della Comunità Europea (FP7/2007-2013)/Accordo di sovvenzione del Consiglio Europeo della Ricerca numero 241344 e da una sovvenzione VIDI dell'Organizzazione Olandese per la Ricerca Scientifica (GvdB).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Polietilene imminaPolysciences23966-2
DMEM mediumLonzaBE12-614F
Siero fetale di vitelloLonzaDE14-801F
Penicillina-streptomicinaInvitrogen15140-122
GlutamminaInvitrogen25030-024
matrigelBDBD 356231
Advanced DMEM-F12Gibco12634-010
N2Invitrogen17502-048
B27Invitrogen17504-044
N-acetil cisteinaSigmaA9165-1G
mouse EgfInvitrogenPMG8045
Hepes 1 MInvitrogen15630-056
glutamax 100xInvitrogen35050-038
Chir 99021Axon1386
Y27632 SigmaY0503-5MG
polibreneSigma107689
nicotinamideSigmaN0636
TripsinaLonzaBE02-007E
puromicinaSigmaP 7255
Rneasy mini kitQiagen74106
β-mercaptoetanoloMerck8,057,400,250
Ovation Pico WTA systemNuGen3300-12
paraformaldeideSigma252549-1L
fiala di vetro conica 12  mm x 75  mm 5  mlVWRLSUKM12
Eosina giallastraVWR1,159,350,025

Riferimenti

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  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A.

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Ristampe e permessi

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Tag

Coltura di organoidiproduzione di particelle viralitrasduzione di organoidiinclusione in paraffinaanalisi immunoistochimicaRT PCR quantitativamicroarray di RNAalterazione genetica

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