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Le strutture cripto-villi intestinali, denominate organoidi, possono essere mantenute in coltura sostenuta tridimensionalmente se integrate con i fattori di crescita appropriati. Poiché gli organoidi sono molto simili al tessuto originale in termini di differenziazione delle cellule staminali omeostatiche, polarità cellulare e presenza di tutti i tipi di cellule terminalmente differenziate note all'epitelio intestinale adulto, essi costituiscono una risorsa essenziale nella ricerca sperimentale sull'epitelio. La possibilità di esprimere transgeni o RNA interferenti utilizzando vettori lentivirali o retrovirali in organoidi ha aumentato le opportunità per l'analisi funzionale dell'epitelio intestinale e delle cellule staminali intestinali, superando i tradizionali transgenici di topo in termini di velocità e costi. Nell'attuale protocollo video mostriamo come utilizzare la trasduzione di organoidi intestinali tenue con vettori lentivirali, illustrata dall'uso di transgeni inducibili dalla doxicilina o di RNA a forcina corta inducibile da IPTG per la sovraespressione o il knockdown genico. Inoltre, considerando che la coltura di organoidi produce una conta cellulare minima che può anche essere ridotta da un trattamento sperimentale, spieghiamo come trattare gli organoidi per l'analisi a valle finalizzata a RT-PCR quantitativa, RNA-microarray e immunoistochimica. Le tecniche che consentono l'espressione transgenica e il knock down genico negli organoidi intestinali contribuiscono al potenziale di ricerca di queste strutture epiteliali intestinali, stabilendo la coltura di organoidi come un nuovo standard nelle colture cellulari.