Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'infiammazione del colon nei topi mediante trasferimento adottivo di cellule T singeniche CD4⁺CD45RBⁱⁿ riceventi carenti di cellule T e B. Le caratteristiche cliniche e istopatologiche imitano le malattie infiammatorie intestinali umane. Questo metodo consente lo studio dell'inizio dell'infiammazione del colon e della progressione della malattia.

Abstract

Ci sono molti modelli animali differenti disponibili per lo studio della patogenesi delle malattie infiammatorie croniche intestinali umane (IBD), ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi. Descriviamo qui un modello di colite sperimentale che è iniziata da trasferimento adottivo di cellule della milza ^alta T CD4 ⁺ CD45RB singenici in T e cellule B topi riceventi deficienti. La popolazione di cellule T CD4 ^{+ alta} CD45RB che consiste in gran parte di cellule effettrici naïve è in grado di indurre infiammazione intestinale cronica, molto simili aspetti chiave di IBD umana. Questo metodo può essere manipolato per studiare gli aspetti di insorgenza della malattia e la progressione. Inoltre può essere utilizzata per studiare la funzione di innata, adattabile e popolazioni regolamentazione cellule immunitarie, e il ruolo delle esposizioni ambientali, cioè, il microbiota, infiammazione intestinale. In questo articolo si illustra il metodo per indurre la colite con un protocollo passo-passo. Questo incLudes un video dimostrativo di aspetti tecnici chiave necessari per sviluppare con successo questo modello murino di colite sperimentale per scopi di ricerca.

Introduzione

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) Il morbo di Crohn e la colite ulcerosa derivano da un'interazione complessa e non completamente definita tra le risposte immunitarie dell'ospite, la suscettibilità genetica, i fattori ambientali e il contenuto luminale enterico¹. Recenti studi di associazione sull'intero genoma riportano associazioni tra i geni regolatori delle cellule immunitarie e la suscettibilità all'IBD^2,3. In questi studi sono rappresentati sia i geni intrinseci delle cellule immunitarie innate che quelli adattativi, indicando un ruolo centrale per queste popolazioni cellulari nella patogenesi delle IBD.

Protocollo

NOTA: Assicurarsi che tutti i protocolli animali sono approvati dal e nel rispetto Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) regolamenti e guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Topo donatore può essere maschio o femmina, ma topi riceventi devono essere di sesso maschile. Se i destinatari femmina devono essere utilizzati, i topi donatori devono essere femmina ^5. Mantenere le colonie con regolare, biancheria da letto non sterili e acqua non acidificato, in quanto potrebbero avere un impatto del microbiota intestinale, e, quindi, il fenotipo colite dei topi ^5,6. <....

Risultati

Circa 10 x 10 ⁶ CD4 ⁺ CD45RB cellule ^{di alta} T da 10 milza di adulti C57BL / 6 topi donatori sono affidabile isolati. Questo numero varia a seconda dell'età e la tensione del mouse donatore e la competenza del ricercatore. Quando 4 x 10 ⁵ C57BL / 6 celle ^{ad alta} T CD4 ⁺ CD45RB vengono trasferiti in C57BL / 6 Rag1 ^{- / -} topi riceventi, i segni clinici della malattia emergono intorno settimana 5 post-sazietà o prima, se i topi sono g.......

Discussione

Qui si descrive un protocollo step-by-step indurre infiammazione del colon nei topi mediante trasferimento adottivo di cellule CD4 ⁺ T ⁺ CD45RB in topi immunodeficienti. Abbiamo usato milza C57BL / 6 donatori e Rag1 singenico ^{- / -} topi riceventi, anche se altri ceppi (ad esempio, BALB / c, 129S6 / SvEv, non-obesi diabetici (NOD)) Modelli e genetici di immunodeficienza (ad esempio, SCID, Rag2 ^{- / -)} può essere utilizzato anche ^{4,14-16.<.......}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente/	Apparecchiatura Azienda	Numero di catalogo	Commenti/Descrizione
10x PBS	Gibco	14200075
12 mm x 75 mm tubo a fondo tondo	Falcon	352052
15 ml conico	Corning	430790
26 G x 3/8 Ago	BD Biosciences	305110
50 ml conico	Corning
70 μ m Filtro cellulare	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
β-mercaptoetanolo	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
Terreno			RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0,0004% β-ME
FACS tubo + filtro	BD Falcon	352235
vetrini per microscopio	Fisherbrand	12550A3
FBS inattivato a caldo	Gemini	100-106
Tampone			1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Tampone			0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA
per l'arricchimento dei linfociti T CD4 di topo
IgG2a-PE	BD Pharminogen	di
IgG2b-FITC di topo	eBioscience	11-4732
Pipetta Pasteur	Fisherbrand	13-678-20D
	Corning Cellgro	30-002-CI
[header]
Petri Dish Fisherbrand		875713
Etanolo puro 200 Proof	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
Siringa	BD Biosciences	309597
Trypan blue	Corning Cellgro	25-900-CI
Mezzi			RPMI-1640, 1% penna/streptococco, 0,0004% β-ME

430828 completo di marcatura di lisi Set MoFlo XDP Beckman Coulter - DM BD Biosciences 558131 topo 553457 Soluzione di penicillina-streptomicina, 100X di lavaggio