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Articolo metodologico

Th17 Infiammazione Modello di orofaringea candidosi in topi immunodeficienti

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⸱

DOI:

10.3791/52538

⸱

18 febbraio 2015

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, School of Dental Medicine, Case Western Reserve University

In questo articolo

Sommario

Sebbene siano disponibili modelli di infezione da Candida per studiare la resistenza immunitaria dell'ospite, è assente un modello per studiare l'immunopatologia mediata dalle cellule T nel contesto dell'infezione da Candida. Qui descriviamo un metodo per stabilire l'immunopatologia Th17 associata all'infezione orale da Candida nei topi immunodeficienti.

Abstract

'La candidosi orofaringea (OPC) è causata non solo dalla mancanza di resistenza immunitaria dell'ospite, ma anche dall'assenza di un'appropriata regolazione dell'immunopatologia indotta dall'infezione. Sebbene le cellule Th17 siano implicate nella difesa antifungina, il loro ruolo nell'immunopatologia non è chiaro. Questo studio presenta un metodo per stabilire l'immunopatologia orale Th17 associata all'infezione orale da candida nei topi immunodeficienti. Il metodo si basa sulla ricostituzione di topi linfopenici con cellule Th17 coltivate in vitro, seguita da un'infezione orale con Candida albicans (C. albicans). I risultati mostrano che le cellule Th17 non trattenute provocano infiammazione e patologia ed è associata a diverse letture misurabili tra cui la perdita di peso, la produzione di citochine pro-infiammatorie, l'istopatologia della lingua e la mortalità, dimostrando che questo modello può essere prezioso nello studio dell'immunopatologia OPC. Il trasferimento adottivo di cellule regolatorie (Treg) controlla e riduce la risposta infiammatoria, dimostrando che questo modello può essere utilizzato per testare nuove strategie per contrastare l'infiammazione orale. Questo modello può essere applicabile anche nello studio dell'immunopatologia orale Th17 in generale nel contesto di altre malattie orali.

Introduzione

Le infezioni orali e l'infiammazione sono state correlate al cancro e alle malattie cardiovascolari e hanno un impatto drammatico sulla salute umana generale2,3. Le infezioni opportunistiche e l'infiammazione causate da C. albicans sono associate a immunodeficienze primarie (PID)4,5, disturbi infiammatori come la parodontite 6,7, la sindrome di Sjogren e la malattia delle ghiandole salivari8,9, nonché il carcinoma orale a cellule squamose 10-12. C. albicans è un fungo commensale dimorfico che colonizza la bocca del 60% degli esseri umani sani in modo asintomatico, ma è il patogeno fungino più comune che causa infezioni quando la difesa dell'ospite è indebolita13-15. Provoca infezioni e infiammazioni ricorrenti e croniche nei pazienti con AIDS e PID, e anche in altri individui immunocompromessi. Come commensale, il suo carico di colonizzazione è associato al cambiamento nella diversità del microbioma orale complessivo16. Come agente patogeno provoca diverse forme di candidosi orofaringea come la pseudomembranosa acuta, l'atrofica acuta, l'atrofica cronica, l'ipertrofica/iperplastica cronica e la cheilite angolare.

La protezione contro C. albicans è determinata non solo dalla resistenza immunitaria dell'ospite, ma anche dalla capacità di controllare in modo appropriato l'immunopatologia indotta dalla Candida. Sebbene i commensali come C. albicans contribuiscano alla modulazione e all'esacerbazione di altre condizioni infiammatorie orali, i meccanismi attraverso i quali si verifica la disbiosi durante le infezioni opportunistiche non sono chiari. Oltre al ruolo noto delle cellule Th17 adattative nella risposta alla memoria a C. albicans17, il loro ruolo nell'inizio e nella perpetuazione della patologia infiammatoria durante le infezioni croniche rimane poco chiaro. Inoltre, le malattie infiammatorie orali come la sindrome di Sjogren e la parodontite sono associate alla patologia mediata da Th17. È interessante notare che queste malattie sono anche fortemente associate a frequenti OPC. Tuttavia, le interazioni tra le cellule Th17, l'immunopatologia orale dell'OPC e altre malattie infiammatorie orali non sono studiate.

Sebbene siano disponibili modelli murini di infezione primaria e secondaria da candidosi orale, non è disponibile un modello murino per studiare l'infiammazione Th17 associata all'infezione da Candida, specialmente nel contesto dell'immunodeficienza. Questo studio presenta un metodo per stabilire l'infiammazione orale Th17 associata all'infezione orale da Candida nei topi. L'infezione da Candida nei topi è caratterizzata da lesioni fungine, infiammazione della lingua, diminuzione dell'assunzione di cibo, perdita di peso e, infine, uno stato moribondo. La patologia orale assomiglia alle lesioni da infezione candidale cronica, così come alla displasia epiteliale nei modelli murini di cancro orale12,18.

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Protocollo

NOTA: Gli esperimenti con i topi sono stati eseguiti in conformità al comitato benessere degli animali istituzionale (IACUC) le linee guida.

1. Ricostituzione della Rag-1 - / - I topi con cellule I n Vitro Colta Th17 (Tre giorni prima di infezione)

  1. Per stabilire le cellule Th17, cultura CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- cellule T naive (3 x 104) in U-bottom 96 pozzetti da soli, o co-coltura con 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs in presenza di solubile α-CD3 (1 mg / ml), α-CD28 (2 mg / ml) anticorpi e cellule presentanti l'antigene, in condizioni Th17 (polarizzati utilizzando IL-6 (25 ng / ml), β TGF- (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 mg / ml) e α -IL-4 (2 mg / ml)) per tre o quattro giorni.
    NOTA: le cellule T reg ingenuo e sono stati ordinati con la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) unad procedure di isolamento delle cellule magnetiche e coltivate come descritto in precedenza 19-22.
  2. Il giorno 4, dopo risospendere le cellule Th17 con la pipetta, raccogliendoli da culture, e li centrifugare in condizioni sterili.
    1. Prendete una piccola aliquota di queste cellule per esaminare la loro vitalità e per fenotipizzazione. Li Risospendere in 500 ml di RPMI media, aggiungere ioduro di propidio (200 ng / ml) e valutare immediatamente la loro redditività mediante citometria a flusso. Eseguire fenotipizzazione mediante citometria di flusso valutazione della produzione di IL-17A dopo restimolazione (vedere paragrafo 6.3).
  3. Centrifugare e lavare la parte più consistente delle cellule in PBS sterile a 480 xg per 6 minuti a 4 ° C in tutte le fasi se non diversamente specificato.
  4. Utilizzare queste cellule per il trasferimento adottivo in 6-8 settimane di età CD45.2 Rag1 - / - topi immunodeficienti.
    1. Risospendere le cellule a densità cellulare 1 x 10 7 cellule / ml usando freddo sterile PBS.
    2. Iniettare 100 ml di cellule di intrapiniezione eritoneal, con 25 aghi G su 1 ml siringhe tubercolina, tale che un mouse riceve 1 x 10 6 cellule. Alcuni topi riceveranno cellule Th17 o PBS solo, e altri topi riceveranno cellule Th17 che erano co-coltura con cellule Treg.
      NOTA: Eseguire tutte le operazioni in modo asettico.

2. Crescere C. albicans per infezione (un giorno prima infezione)

  1. Prima di inoculazione, disperdere cinque colonie della CAF2-1 C. albicans ceppo di laboratorio in 100 ml di sospensione sterile PBS, e aggiungere la sospensione al brodo sterile.
  2. Seminare 5 colonie di C. albicans in 50 ml della base di azoto di lievito (YNB senza amminoacidi) / Peptone / Destrosio brodo e incubare in un incubatore shaker a 30 ° C per 15-18 ore a 130 rpm.
  3. Monitorare il brodo per nuvolosità, dato che è un'indicazione per la crescita del fungo.

3. CandidaRaccolta e procedura di conteggio (Nel giorno di infezione)

  1. Raccogliere 10 ml di brodo di Candida in provette da 15 ml. Per volumi maggiori, raccogliere Candida in 50 ml provette.
  2. Centrifugare le blastospores a 1900 xg per 5 minuti a temperatura ambiente in tutte le fasi, se non diversamente specificato. Agglomerare le blastospores mediante centrifugazione, seguita dalla rimozione del supernatante.
  3. Se vi è più di un tubo, in comune i blastospores Candida da più tubi, aggiungendo PBS sterile al pellet e risospendere in 10 ml di PBS per il conteggio.
  4. Prendere 20 ml di blastospores in provette da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 20 ml di paraformaldeide 2X e incubare a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Contare le blastospores fissi utilizzando il emocitometro sotto il microscopio.
    NOTA: Paraformaldeide è cancerogeno. Aprire la soluzione diluita solo nella cappa.
  5. Nel frattempo, ripetere lavare i blastospores almeno due volte, per centrifugazione them in PBS, e pellet le blastospores. Tenere il pellet in 15 ml provette a RT, nella cappa ABSL1, pronto per l'infezione.
  6. Lascia un po 'sterile PBS a temperatura ambiente per risospendere le blastospores di infezione.
  7. Dopo conteggio, aggiungere PBS sterile al pellet Blastospora per regolare il numero di cellule di lievito Blastospora a 2 x10 8 del lievito cellule / ml. Questa è la sospensione Blastospora che verrà utilizzato per infettare i topi.
    NOTA: Eseguire tutte le operazioni in modo asettico.

4. Topi Infezione (3-5 giorni dopo il trasferimento Cell)

NOTA: La procedura di infezione di base viene eseguita come descritto in precedenza 19,23-25.

  1. Pesare il Rag-1 - / - topi che hanno ricevuto PBS o le cellule tre giorni prima.
  2. Calcolare la dose di agenti anestetici che utilizzano il loro peso corporeo. Anestetizzare topi somministrando ketamina / xilazina miscela (16,1 mg / ml e 1,6 mg / ml), con 25 aghi G su 1 ml siringhe tubercolina, da intriniezione aperitoneal.
    1. Somministrare 50 ml per 10 g di peso corporeo. (Cioè, 0,8 mg di ketamina e 0,08 mg di xilazina / 10 g di peso corporeo o 80 mg di ketamina e 8 mg di xilazina per kg di peso corporeo, rispettivamente). Osservare per la risposta pizzico punta ogni 15 minuti dopo l'anestesia.
      NOTA: Questo dosaggio indurrà 60-90 min di anestesia, che è sufficiente per la procedura di infezione.
    2. Applicare il lubrificante pomata oftalmica negli occhi dei topi per evitare le cornee si secchi. Come il lubrificante occhio potrebbe seccarsi, ripetere la lubrificazione oftalmica ogni 45 min.
  3. Iniettare 1 ml di soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) per via sottocutanea sul dorso adiacente alla zampa anteriore, per aiutare reidratazione dei topi durante l'anestesia.
  4. Ottenere un nuovo, gabbia pulita. Seguire la procedura di infezione un mouse alla volta, posizionando ciascun topo nella nuova gabbia volta infettati. Eseguire il / infezione farsa PBS prima, e poi passare alle gro infezione da Candidaups.
  5. Prendete il mouse anestetizzato e aprire la bocca per rivelare la base della lingua.
    1. Inserire una sfera di diametro 3 millimetri di cotone saturato con 50 ml di PBS o Blastospora sospensione, sublinguale nella cavità orale per 90 min. Capovolgere il mouse ogni 15 minuti parte anteriore e posteriore per evitare congestione polmonare, assicurando che i batuffoli di cotone non si muovono.
  6. Impostare un timer per ogni topo per garantire 90 min di Sham o Candida inoculazione nella cavità orale.
  7. Tenerli in una gabbia sotto la lampada di calore (4 metri di distanza), e ogni mouse su cuscinetti di gel di calore.
  8. Assicurarsi che la lingua è ritirata all'interno e lontano dai denti, per evitare i denti lacerano lingua.
  9. Alla fine di 90 min, rimuovere il batuffolo di cotone dalla bocca del mouse. Guarda per qualsiasi mouse che può recuperare da anestesia prima di 75 minuti. In tal caso, le anestetizzare nuovo con ketamina (40 mg / kg) soltanto.

5. Posta immissioe Monitoraggio (durante la 90 min Anesthesia)

  1. Usare tamponi di gel di calore durante la 90 min anestesia.
    1. Per mantenere la temperatura corporea e per prevenire il soffocamento, non permettere topi per recuperare il normale assestamento del mouse corn-cob.
  2. Dopo il recupero dall'anestesia, amministrare un ulteriore 1 ml di sterile 0,9% NaCl per via sottocutanea in due posizioni sul retro.
  3. Tieniti cinque PBS (sham) topo inoculato per gabbia. Solo 1-2 Casa topi infettati per gabbia.
  4. Compilare la scheda di procedura con le iniziali ogni giorno dopo la procedura di annotare i cambiamenti nel peso corporeo, governare le abitudini e la salute generale.

6. Valutare l'infiammazione

6.1) La perdita di peso

  1. Pesare i topi ogni giorno durante l'infezione, a partire dal giorno precedente procedura di infezione.
    NOTA: in genere, i topi immunodeficienti iniettati con le cellule Th17 e senza regs T soccombono 20-30% Di perdita di peso a causa di maggiore onere fungina 19 e aggravata infiammazione.

6.2) Istologia punteggio della lingua

  1. Sacrifica i topi da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale.
  2. Aprire le ganasce e sezionare fuori la lingua con le forbici e pinze. Utilizzare pinze smussato per tenere la lingua, e utilizzando le forbici protendono verso il retro della bocca di incidere all'estremità posteriore della lingua.
  3. Per ematossilina immunocitochimica e eosina (H & E) colorazione dei tessuti lingua, lavare i tessuti lingua con ghiaccio freddo PBS. Aggiungere 5 ml di formalina al 10% per 2-3 lingue e fissarli O / N in provette da 15 ml.
    1. Il giorno successivo, togliere formalina e immergere i tessuti in 5 ml di etanolo al 70% per evitare iper-fissazione. Send them out al servizio commerciale per continuare con paraffina, sezionamento e colorazione delle sezioni di paraffina.
      NOTA: istologia servizio commerciale viene utilizzato per eseguire questa procedura.
  4. Una volta che le diapositive sono tornati dal servizio istologia commerciale, di grado l'infiammazione osservando le sezioni di tessuto al microscopio ottico.
    1. Punteggio da 0 a 5, con 0 essendo senza infiammazione, e 5 è l'infiammazione più grave. Nota l'infiammazione utilizzando Tabella 1.

6.3) la produzione di citochine da parte delle cellule Th17

NOTA: L'eccessiva produzione di TNF-α è una delle letture per eccessiva immunopatologia. Quando i topi sono adoptively trasferiti con cellule Th17 solo, provoca immunopatologia associato eccessiva produzione di TNF-α nelle cellule Th17.

  1. Raccogliere una sospensione singola cellula da milza, linfonodi cervicali, linfonodi ascellari, e la lingua, usando i metodi descritti in precedenza 19,26.
  2. Restimolare le cellule con acetato di forbolo miristato (PMA) (50 ng / ml) e Ionomicina (500 ng / ml) per 4 ore con Brefeldina A (10 mg / ml) aggiunto nella last 2 hr. Lavare le cellule con PBS e fissare utilizzando un kit di fissaggio / permeabilizzazione commerciale secondo le istruzioni del produttore.
  3. Eseguire intra citochine cellulari colorazione utilizzando il fluorocromo coniugato anti-TNF-α, anti-IL-17A e anticorpi ROR-γt come descritto in precedenza 19.
  4. Brevemente, risospendere le cellule nel buffer permeabilizzazione 1X con il cocktail anti-TNF-α, anti-IL-17A e anticorpi ROR-γt, ciascun anticorpo a 2 - 3 g / ml concentrazione finale.
  5. Incubare le cellule per 1 ora a RT.
  6. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con tampone permeabilizzazione 1X.
  7. Risospendere il pellet cellulare in 500 ml di PBS con 0.5% albumina sierica bovina per citometria a flusso.

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Risultati

In questo modello, sia i topi -infected Candida e topi non infetti in Rag-1 - / - sfondo immunodeficienti sono state adoptively trasferiti con le cellule Th17 3-5 giorni prima l'infezione. Un totale di 10-12 topi sono stati utilizzati per gli esperimenti, con 2 topi in ciascun sham infettati gruppi, e 4-5 in ciascuno dei gruppi infetti Candida. Cellule naive sono stati ottenuti da congenici Thy1.1 o CD45.1 topi, in modo che le cellule Th17 iniettate sono stati monitorati in vivo...

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Discussione

Questo modello è basato su indurre orale C. infezione albicans dipendente infiammazione Th17. A causa della mancanza di T reg, l'infiammazione delle cellule Th17 indotta è sfrenato e porta a immunopatologia mal risolto. In vitro derivato cellule CD4 naive polarizzate come le cellule Th17 sono stati utilizzati per il trasferimento adottivo. 40 - 50% della coltura CD4 + cellule mostrano rilevabile espressione di IL-17A intorno al giorno 3 (cellule Th17), e quindi sono stati utiliz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo la dottoressa Helene Bernstein per averci fornito l'accesso al suo citometro a flusso. Ringraziamo anche la struttura di citometria a flusso CFAR per i servizi di citometria a flusso. Questo progetto è stato in parte supportato dai finanziamenti CTSC per l'utilizzo del core e dalla sovvenzione STERIS corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases a PP.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CAF-2Università di Pittsburgh (Sarah Gaffen)-Coltura Candida
U-fondo 96 piastre pozzetti Fisher055588Utilizzato per colture cellulari
a-CD3 eBiosciences16-0031-85Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17
a-CD28 eBiosciences16-0281-85Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17
m-IL-6Bio BasicRC232Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17
h-TGF-b R& D240-BPolarizzazione delle cellule alle condizioni Th17
a-IFN-g eBiosciences16-7311-85Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17
a-IL-4 eBiosciences16-7041-85Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17
α-IL17A ef660eBiosciences50-7177-82Utilizzato per la coltura cellulare - 1:50
α-TNFa-PE-Cy7eBiosciences25-7423-41Utilizzato per la coltura cellulare - 1:100
α-RORgt PE eBiosciences12-6981-82Utilizzato per colture cellulari - 1:50
YNB senza aminoacidi)/Peptone/Destrosio brodo di terreno Bio BaseS507. TAGLIAMediium per la crescita della candida
Incubatore Shaker New Brunswick ScientificInnova 4300Crescita di incubazione per candida
Provette da 15 mlBio BasicBT888-SYUtilizzato per la coltura cellulare e la crescita della candida
Provette da 50 mlBio BasicCT 788-YSUtilizzato per la coltura cellulare e la crescita della candida
Centrifuga da tavoloVWR International LLC82017-654Per la pellettatura della candida -900 g
Allegra CentrifugaBeckman Coulter392302Colture cellulari - 480 g
1,5 ml di provette eppendorfBio BasicBT620-NSPreparazione della concentrazione finale di candida
2x paraformaldeide Microscopiaelettronica Scienze15710Fissaggio della candida per il conteggio
EmocitometroVWR International LLC15170-172Conteggio delle cellule
PBS - Soluzione salina tamponata con fosfatoBio BasicPD8117Preparazione di tamponi
Ketamina/xilazina Case Western Reserve University - Animal ResourceCenter-Ottenutodal protocollo approvato ARC per l'anestesia
Unguento lubrificante oftalmico Unguento allergan-Eyeper animali per prevenire la secchezza
Soluzione salina (0,9% NaCl)G Biosciences786-561Somministrato agli animali per prevenire la disidratazione
batuffolo di cotone da 3 mm di diametro VWR International LLCBP7603Sfere da 3 mm per l'infezione da candida
Cuscinetti in gel termicoCase Western Reserve University - Animal ResourceCenter-peril mantenimento della temperatura corporea e un rapido recupero
Colorazione con ematossilina ed eosinaHistoserv - MD-Istologiatissutale
10% formalina Scienze della microscopia elettronicaJC1111 / MCIstologia tissutale
70% etanolo VWR International LLC97064-490Scopo di sterilizzazione
PMA - Forbolo 12-miristato 13-acetatoSigma-AldrichP1585-1MGRestimolazione delle cellule
IonomicinaLife Technologies124222 1mgRestimolazione delle cellule
Kit di permeabilizzazione di fissazioneeBiosciencesE16913-106Cellule di fissaggio per citometria a flusso
Siringhe per tubercolinaBD Biosciences309659Iniezione di topi
25 G x 3/8 aghiBD Biosciences309626Iniezione di topi
Rag1 -/- topiJackson laboratoriesCodice prodotto: 002216Topi riceventi
CD45.1 topi congeniciJackson laboratoriesCodice prodotto:002014 Cellule Th17 del donatore
CB17-SCID topiJackson laboratoriesCodice prodotto: 001303Topi riceventi Topi
Balb/c JacksonlaboratoriesCodice prodotto: 000651Cellule Th17 donatrici

Riferimenti

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Ristampe e permessi

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