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Articolo metodologico

Generazione efficiente di reporter knockin specifici per il lignaggio neurale hiPSC utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e Cas9 Double Nickase

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DOI:

10.3791/52539

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28 maggio 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 4Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, 5Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, 6Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 7Biology Department, University of West Georgia

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Gli strumenti di editing del genoma come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) hanno notevolmente migliorato l'efficienza del targeting genico nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter hiPSC specifici per il lignaggio utilizzando la ricombinazione omologa assistita dal sistema CRISPR/Cas.

Abstract

Il targeting genico è un approccio fondamentale per caratterizzare le funzioni geniche nella moderna ricerca biomedica. Tuttavia, l'efficienza del targeting genico nelle cellule umane è stata bassa, il che impedisce la generazione di linee cellulari umane al ritmo desiderato. Gli ultimi due anni hanno assistito a una rapida progressione nel miglioramento dell'efficienza della manipolazione genetica da parte di strumenti di editing del genoma come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated). Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) specifiche per il lignaggio utilizzando la ricombinazione omologa assistita dal sistema CRISPR/Cas. Vengono descritte le procedure per ottenere i componenti necessari per la creazione di linee reporter di linea neurale utilizzando il sistema CRISPR/Cas, concentrandosi sulla costruzione di vettori di targeting e RNA guida singoli. Questo protocollo può essere esteso alla creazione di piattaforme e alla correzione delle mutazioni nelle hiPSC.

Introduzione

Il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated), insieme ad altri strumenti di editing del genoma, ha rivoluzionato la manipolazione del genoma umano negli ultimi anni1-7. I componenti principali del sistema CRISPR/Cas9 sono l'RNA a guida singola (sgRNA) e Cas9. Cas9 è un'endonucleasi del DNA di tipo II guidata da RNA. Ha due domini nucleasici, HNH e RuvC, che sono responsabili della formazione di rotture a doppio filamento di DNA (DSB) in una specifica regione genomica accanto a un motivo adiacente a protospaziatore (PAM)7-10. Un sgRNA ha una funzione combinata di quella di crRNA e tracrRNA, due molecole di RNA dell'immunità adattativa identificate nei batteri (come lo Streptococcus pyogenes) e negli archei per combattere l'invasione del DNA di fonti esogene9-11. Quando opportunamente progettato e co-introdotto nelle cellule di mammifero, l'sgRNA riconosce la sequenza PAM, si accoppia con il filamento complementare del DNA bersaglio e guida e transattiva Cas9 per scindere entrambi i filamenti di DNA immediatamente a monte di PAM7. Successivamente, si verificherà la ricombinazione diretta omologa (HDR, in presenza di un vettore di puntamento) o l'unione di estremità non omologa (NHEJ) per riparare i DSB. Transgeni come cDNA, cassette reporter o frammenti resistenti agli antibiotici possono essere integrati e possono essere create linee transgeniche o knockin.

Sebbene il sistema CRISPR/Cas9 sia altamente efficiente e relativamente specifico, sono state segnalate attività fuori bersaglio indesiderate12-15. Per ridurre al minimo gli eventi fuori bersaglio, sono stati ingegnerizzati anche i nickasi Cas9 (Cas9n)9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A o Cas9 H840A) è un enzima Cas9 con mutazioni in uno dei due domini nucleasici, che suscita un solo intaccamento in un filamento di DNA. Per ottenere la scissione in entrambi i filamenti, due sgRNA sono progettati per guidare una coppia di nickasi, che taglia separatamente i loci vicini dei due diversi filamenti di DNA. La strategia del "doppio nicking" richiede una progettazione più rigorosa rispetto alla piattaforma Cas9 convenzionale e offre sia un'elevata efficienza che un'elevata specificità per gli esperimenti di editing genetico.

Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) specifiche per il lignaggio utilizzando la ricombinazione omologa assistita dal sistema CRISPR/Cas. Vengono descritti i passaggi per ottenere i componenti necessari per la creazione di linee reporter di lineazione neurale utilizzando l'editing genomico mediato dal sistema CRISPR/Cas, con particolare attenzione alla costruzione di vettori di targeting e sgRNA. Questo protocollo è stato ripetuto con successo in diverse linee di hiPSC, comprese quelle derivate da individui sani e da pazienti con malattie del SNC. I geni presi di mira nel nostro laboratorio includono OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 e SOD1. L'efficienza di targeting della ricombinazione omologa mediata dal sistema CRISPR/Cas nelle hiPSC varia dal 20 al 40%, il che è coerente con i precedenti rapporti1,18,19. Rispetto a un'efficienza tipica dell'1-2% negli esperimenti convenzionali di targeting genico, l'efficienza di targeting è significativamente migliorata.

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Protocollo

1. Progettazione e costruzione vettoriale per i vettori di targeting

  1. Una volta determinato il marcatore specifico del lignaggio, individuare la sequenza genomica del gene e progettare i bracci di omologia di conseguenza. La lunghezza del braccio di omologia da 5' è di ~1 kb e del braccio di omologia da 3' è di ~1,5 kb (Figura 1).
  2. Etichettare la cassetta reporter in sequenza a valle della sequenza genomica subito prima del codone di stop, mediante subclonaggio, in modo che l'espressione endogena non venga alterata o interrotta. Collegare il reporter, o una o più cassette reporter doppie, con sequenze peptidiche 2A auto-scisse (F2A, E2A o T2A) 20,21 o con il sito di ingresso del ribosoma interno (IRES).
    Nota: i reporter possono includere proteine fluorescenti come GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, luciferasi o cassetta di resistenza agli antibiotici, una combinazione di proteina fluorescente e cassetta di resistenza agli antibiotici. Un esempio è mostrato nella Figura 1 per la costruzione di un vettore di targeting per il gene della ALDH1L1 umana, etichettato da EGFP e cassetta di resistenza alla neomicina.
  3. Aggiungere una cassetta di selezione positiva a valle del reporter. La selezione positiva è una cassetta floxata resistente agli antibiotici che verrà asportata dalle iPSC bersaglio dopo che i cloni positivi sono stati selezionati e isolati.
  4. Includere una cassetta di selezione negativa all'esterno del braccio di omologia 3'. Le cassette di selezione negativa più comuni sono la timidina chinasi, la TK e la tossina difterica A (DTA) 22.
  5. Ottenere un clone BAC umano contenente la sequenza del marcatore di lignaggio e verificare il clone mediante amplificazione PCR. Costruire il vettore di targeting in pKD46 contenente-DH5α utilizzando la ricombinazione per abbattere il sito di targeting 23. Applicare gateway multisito, strategie Golden gate23,24 quando necessario.

2. Progettazione e costruzione vettoriale di sgRNA per il sistema CRISPR/Cas9.

  1. Determina l'indicatore specifico di derivazione che verrà preso di mira per rendere il reporter. Copiare la sequenza di cDNA dal database NCBI. Vai alla ricerca BLAT umana per ottenere l'allineamento del DNA genomico.
  2. Fare clic sulla scheda "browser" per visualizzare l'assemblaggio del gene. Nella scheda "Visualizza", fai clic su "DNA" per ottenere la sequenza completa del DNA genomico in formato FASTA.
  3. Individuare il codone di stop all'interno della sequenza di DNA, dove verranno etichettati la sequenza 2A e la cassetta reporter.
  4. Cerca il motivo adiacente del protospaziatore (PAM, cioè NGG) all'interno della vinicità (~100 bp di area fiancheggiante) del codone di stop. Scansiona entrambi i filamenti per individuare la sequenza NGG appropriata. Considerare la specificità delle sequenze a monte per evitare potenziali eventi fuori bersaglio. Utilizza strumenti open source come BLAST e CasOT (vedi il passaggio 5 per i dettagli).
  5. Copiare la sequenza di 20 basi immediatamente a monte di NGG e incollarla nello strumento di web design ZiFit per progettare oligo con sporgenze compatibili con il vettore di espressione del gRNA umano (con promotore U6) MLM3636.
  6. Sintetizzare sia gli oligo diretti che quelli inversi 7.
  7. Per produrre sgRNA a doppio filamento, denaturare entrambi gli oligo a 70 °C per 15 minuti e raffreddare gradualmente a RT. Per una reazione di 50 μl, aggiungere rispettivamente 22,5 μl di oligo diretti e inversi (la concentrazione madre è 0,1 mM) e 5 μl di tampone di ricottura (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0).
  8. Mescolare e legare gli oligo ottenuti dallo step 2.7 con il vettore di espressione del gRNA umano digerito da BsmBI (con promotore U6) MLM3636. Per una reazione di 20 μl, aggiungere 1 μl di oligo della fase 2.7, 100 ng di MLM3636 e 1 μl (400 U) di ligasi T4. Incubare a RT O/N.
  9. Trasformare le cellule competenti DH5α con il prodotto di legatura mediante shock termico a 42°C per 30 sec. Far crescere i batteri in piastra LB agar Ampicillina (100 μg/ml) a 37°C O/N. Prelevare 3~5 colonie per il miniprep plasmidico secondo il protocollo del produttore. Sequenziare il DNA plasmidico per confermare utilizzando fornitori commerciali. Maxiprep il plasmide corretto secondo il protocollo del produttore.
  10. Valutare l'sgRNA mediante il test dell'endonucleasi T7 1 (T7E1) (vedere il passaggio 4 per i dettagli). Il trasfetto di hiPSC con il plasmide e l'sgRNA sarà espresso sotto il promotore U6 incorporato nella spina dorsale MLM3636 (vedere il passaggio 6 per i dettagli).

3. Progettazione e costruzione di sgRNA Cas9n Double Nickase

  1. Ottenere il vettore Cas9n D10A della doppia nickasi pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
  2. Progetta una coppia di oligo diretti e inversi per ogni locus di puntamento. Copia la sequenza di 20 basi immediatamente a monte di NGG come descritto nel passaggio 2 e incollala nello strumento di web design ZiFit
  3. Per ottenere oligo con sporgenze compatibili con pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A), rimuovere la prima e l'ultima base di oligo in avanti e in inversione che vengono mostrate dallo strumento di progettazione ZiFit.
  4. Sintetizzare oligo diretti e inversi7. Nomina questi oligo come f(n)-F, f(n)-R per i PAM su un lato del sito target, r(n)-F, r(n)-R per i PAM sull'altro lato del sito target. Di questi, n è il numero per designare diversi PAM, f e r minuscoli rappresentano la posizione dei PAM al filamento senso (f) o antisenso (r), F e R rappresentano oligo diretti e inversi.
    1. Testare più coppie (ad esempio, r5 e f2) utilizzando il test T7E1 (dettagliato nel passaggio 4) per identificare la coppia ottimizzata di sgRNA da utilizzare per Cas9n.
  5. Per produrre sgRNA a doppio filamento, denaturare entrambi gli oligo a 70 °C per 15 minuti e raffreddare gradualmente a RT. Per una reazione di 50 μl, aggiungere rispettivamente 22,5 μl di oligo diretti e inversi (la concentrazione madre è 0,1 mM) e 5 μl di tampone di ricottura (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0).
  6. Miscelare e legare gli oligo ottenuti dal passaggio 3.5 con pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) digerito con BbsI. Per una reazione di 20 μl, aggiungere 1 μl di sgRNA dal passaggio 3.5, 100 ng di Cas9n (D10A), 1 μl (400 U) di T4 ligasi. Incubare a RT O/N.
  7. Trasformare le cellule competenti DH5α con il prodotto di legatura mediante shock termico a 42 °C per 30 sec. Far crescere i batteri in piastra LB agar Ampicillina (100 μg/ml) a 37 °C O/N. Scegliere 3~5 colonie per il miniprep plasmidico secondo il protocollo del produttore. Sequenziare il DNA plasmidico per confermare utilizzando fornitori commerciali. Maxiprep il plasmide corretto secondo il protocollo del produttore.
  8. Valutare l'sgRNA mediante il dosaggio T7E1 (vedere il passaggio 4 per i dettagli). Il trasfetto di hiPSC con il plasmide e l'sgRNA sarà espresso sotto il promotore U6 incorporato nella dorsale Cas9n (D10A) (vedere il passaggio 6 per i dettagli).

4. Valutazione degli sgRNA mediante saggio T7 Endonucleasi1 (T7E1)

  1. Per una piastra a 24 pozzetti, piastra 2 x 105 celle da 293 piedi per pozzetto un giorno prima (giorno -1).
  2. Il giorno della trasfezione (giorno 0), co-trasfettare le cellule 293FT con il plasmide sgRNA e il vettore di espressione Cas9. Aggiungere 0,5 μg di vettore sgRNA, 0,5 μg di vettore di espressione Cas9 JDS246 (Cas9-003) e 1,5 μl di Lipofectamine 2000.
    1. Per il controllo negativo, aggiungere 0,5 μg di vettore di espressione GFP (ad esempio, GFP guidata dal promotore di CMV in una dorsale pcDNA3) invece dei vettori sgRNA.
  3. Dopo 72 ore (giorno 3), prelevare le cellule aggiungendo 100 μl di tampone di estrazione rapida del DNA e triturare vigorosamente.
  4. Incubare la miscela a 68 °C per 15 minuti, quindi a 95 °C per 8 minuti. Questo è il modello per i successivi esperimenti di PCR.
  5. Progettare primer PCR sia in avanti che in avanti per amplificare la sequenza che fiancheggia il PAM. Di solito il prodotto di PCR mirato è lungo circa 400-500 bp. Sintetizzare gli oligo7.
  6. Per una reazione PCR di 50 μl, aggiungere 1 μl di modello del passaggio 4.5, 0,5 μl di Herculase II, 0,5 μl di DMSO, 10 μl di tampone 5x, 0,5 μl di miscela dNTP e 1 μl di miscela di primer diretto e inverso.
  7. Utilizzare i seguenti parametri PCR: 98 °C per 2 min, 35 cicli di 98 °C per 20 sec, 59 °C per 20 sec, 72 °C per 1 min, con un'estensione finale a 72 °C per 5 min.
    Nota: i parametri PCR qui descritti producono prodotti specifici per diversi geni testati. Tuttavia, queste condizioni dipendono dai geni di interesse scelti dall'utente. Le PCR che utilizzano il DNA genomico come modello spesso richiedono un'ottimizzazione per garantire che non appaiano bande aggiuntive. Queste bande extra possono essere confuse con i prodotti di scissione dopo il test T7E1.
  8. Misurare la concentrazione di DNA dei prodotti PCR utilizzando uno spettrometro ad A260.
  9. Aggiungere 400 ng di prodotti PCR a 2 μl di tampone di digestione 2. Aggiungere ddH2O a un volume di reazione finale di 19 μl. Incubare in acqua bollente per 5 min. Lasciare riposare la reazione sulla panca e raffreddare naturalmente fino a RT (45-60 min).
  10. Aggiungere 1 μl (10 unità/μl) di T7E1, incubare a 37 °C per 15 min. Arrestare la reazione aggiungendo 2 μl di EDTA 0,25 M miscelato con 6x DNA Loading Dye.
  11. Sciogliere 2,5 g di polvere di agarosio in 100 ml di 1xTAE. Cuocere la miscela nel microonde e versare il gel su una scatola di gel. Quando si forma il gel, caricare l'intera reazione da 20 μl sul gel di agarosio al 2,5%. Far funzionare il gel a 100-150 V per 30 minuti.
  12. Ispezionare il gel sotto la luce UV (Figura 3). T7E1 taglia i siti non corrispondenti. Per gli sgRNA che hanno causato l'unione di estremità non omologhe, i prodotti della PCR mostreranno bande di migrazione rapida aggiuntive (di dimensioni più piccole) rispetto al controllo negativo (descritto nel passaggio 4.3).
  13. Stimare e classificare l'efficienza di taglio dell'sgRNA e la percentuale di inserimento e delezione (indel%) confrontando la densità di banda utilizzando il software Image J.
    1. Per ogni campione che scorre sul gel, designare le bande di gel come banda non tagliata, banda tagliata 1 e banda tagliata 2.
    2. Misurare la densità di ciascuna banda utilizzando ImageJ in base al manuale del software.
    3. Calcola ftaglio utilizzando la seguente formula: ftaglio = (banda di taglio 1 + banda di taglio 2) / (banda non tagliata + banda di taglio 1 + banda di taglio 2)
    4. Calcola Indel% utilizzando la seguente formula: Indel=1- √(taglio 1-f).

5. Previsione in silico di potenziali siti fuori bersaglio

Nota: I potenziali siti fuori bersaglio possono essere previsti utilizzando uno strumento open source online chiamato CasOT17, che è un programma basato su Perl.

  1. Per un sistema Windows, scaricare il programma CasOT e i file del database del genoma umano sul disco rigido locale.
  2. Preparare il file di destinazione dell'sgRNA progettato nel formato FASTA.
  3. Apri il file denominato "casot". Viene visualizzata una finestra di comando. Lascialo così com'è per ora.
  4. Apri il file denominato "opt-generator" per generare la stringa di opzione. Incolla il percorso e il nome del file di destinazione nella finestra di dialogo dell'opzione "-t" o "-target".
  5. Incolla il percorso del file di sequenza del genoma nella finestra di dialogo dell'opzione "-g" o "-genoma".
  6. Valori di input di –s o –seed (il valore predefinito è 2) e –n o -nonseed (il valore predefinito è 255). La stringa dell'opzione viene generata e apparirà nella casella nella parte superiore della pagina.
  7. Copiare la stringa dell'opzione e incollarla nella finestra di comando CasOT descritta nel passaggio 5.3.
    Nota: l'esecuzione del programma CasOT potrebbe richiedere 30-90 minuti a seconda delle opzioni e del computer utilizzato. Una volta completata, verrà generata una cartella denominata "--". Nella cartella verranno inclusi due file, un file ".stat" che descrive le statistiche e un file .csv (valori separati da virgole) contenente i risultati dettagliati della ricerca.
  8. Apri il file .csv con un programma per fogli di calcolo. Le seguenti informazioni sono fornite nel file per ogni sito fuori bersaglio: posizione cromosomica e genomica, sequenza del sito, tipo di mancata corrispondenza (Mm), numero totale di basi non corrispondenti e informazioni sull'esone relative al sito fuori bersaglio.
  9. Progettare primer PCR per i siti che hanno <2 mm nella sequenza seme o non seme
    10. .
  10. Eseguire la PCR per il clone hiPSC positivo selezionato utilizzando le seguenti condizioni: 98 °C per 2 min, 35 cicli di 98 °C per 20 sec, 59 °C per 20 sec, 72 °C per 1 min, con un'estensione finale a 72 °C per 5 min.
    Nota: i parametri PCR qui descritti producono prodotti specifici per diversi geni testati nel nostro laboratorio. Tuttavia, queste condizioni dipendono dai geni di interesse scelti dall'utente. Le PCR che utilizzano il DNA genomico come modello spesso richiedono un'ottimizzazione per garantire che non appaiano bande aggiuntive.
  11. Sequenziare i prodotti della PCR, allineare i risultati del sequenziamento con le sequenze previste e cercare le mutazioni. Se esistono mutazioni, vengono identificati gli eventi off-target.

6. Elettroporazione di hiPSC per creare reporter di lignaggio neurale

  1. HiPSC di coltura in terreno TeSR-E8 su piastre rivestite con Geltrex. Cambiare il terreno in MEF-CM (Mouse embryonic fibroblasts conditioned medium) due giorni prima dell'elettroporazione. Incubare in 2 ml di Accutase per 5 minuti e raccogliere le cellule.
  2. Elettroporare hiPSC con vettore di targeting linearizzato, vettore di espressione Cas9-003 e vettore sgRNA utilizzando le seguenti condizioni: 1 x 107 hiPSCs, co-transfettare 2,5 μg di sgRNA, 2,5 μg di Cas9 e 50 μg di vettore di targeting. Per la strategia a doppia nickasi, aggiungere 50 μg di vettore di targeting, 2,5 μg di ciascun sgRNA (con Cas9n co-espresso dal vettore).
  3. Selezionare i cloni con selezioni positive e negative come descritto24,25.
  4. Identificare i cloni positivi mediante analisi Southern blot o PCR genomica a lungo raggio24,25.

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Risultati

I vettori di targeting con tutti i componenti necessari, inclusi bracci di omologia, cassetta del reporter e cassette di selezione positiva e negativa, vengono costruiti (Figura 1). Sulla base del locus genomico endogeno, vengono progettati e costruiti multipli (da 2 a 3) sgRNA (se si utilizza il sistema Cas9) o coppie di sgRNA (se si utilizza la strategia della doppia nickasi Cas9n) all'interno dei vettori di espressione umana per gRNA MLM3636 o pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) (Figura 2...

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Discussione

Il targeting genico è uno strumento essenziale per caratterizzare le funzioni geniche. Tuttavia, l'efficienza relativamente bassa richiede un lavoro ad alta intensità di manodopera e dispendioso in termini di tempo. Recentemente lo sviluppo di strumenti di editing genomico come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) ha notevolmente migliorato l'efficienza del targeting. Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter di cellule staminali pluripotenti indo...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento di Neurochirurgia, dalla Memorial Hermann Foundation, dallo Staman Ogilvie Fund, dal Bentsen Stroke Center presso l'Università del Texas, dall'Health Science Center di Houston e dalla Mission Connect TIRR Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
pStart-KAddgene20346
pWS-TK6 Addgene20350
pKD3 Addgene45604
pKD46Il Centro di Stock Genetico Coli, CGSC7634
Sequenza PGK-neo-bpA Addgene13442
Cloni BAC umani di geni bersaglio
JDS246 (Cas9-003), streptococco pyogenes Cas9-3X ottimizzato per il codone dei mammiferi FlagAddgene43861
MLM3636, vettore di espressione del gRNA umano con promotore U6Addgene43860
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)Addgene42335
progettazione di sgRNA, ZiFithttp://zifit.partners.org/ZiFiT/
Off target prediction tool CasOThttp://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php
Perlhttp://www.perl.org/get.html
NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAThttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
sgRNA Sintesi di primerSigma
One shot Top10 Electrocomp E. Coli Cellule competentiLife TechnologiesC4040-50
AccuPrime Pfx SupperMixLife Technologies12344-040
Enzimi di restrizioneNEB e Life Technologies
Kit di recupero del DNA Zymoclean GelZymo ResearechD4007
tampone di estrazione rapida del DNA EpicentroQE0905T
Fusione di DNA polimerasiAgilent Technologies600675
tampone di digestione 2New England Biolab
6X DNA Loading DyeThermo ScientificR0611
TeSR-E8 Kit per il mantenimento hESC/hiPSCTecnologie delle cellule staminali05940
Agarosio ultrapuro Life Technologies16500-100
50xTAELife TechnologiesB49
Essential 8 medio Life TechnologiesA1517001
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesioLife TechnologiesA12856-01
D-MEM/F12 con Glutamax Life Technologies10565018
D-MEM con Glutamax Life Technologies10566040
Siero fetale bovino-ES qualificato per le cellule Life Technologies10439
Sostituzione del siero knockout Life Technologies10828010
2-mercaptoetanolo 1000X Life Technologies21985023
aminoacidi non essenziali Life Technologies11140050
Stempro Accutase Tecnologie di vitaA1110501
Dispase Life Technologies17105-041
Soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% Tecnologie di vita25200-056
Geltrex Tecnologie per la vita     12760-013
Inibitore ROCK Y-27632Milliporo    Reagente SMC4 SCM075
 BD354357
MEF resistente alla neomicinaMilliporePMEF-NL
MEF resistente all'igromicinaMilliporePMEF-HL
G418 (Geneticin)LifeTechnologies11811
Igromicina B Life Technologies10687010
FIAU (Fialuridina, 1-2-Deossi-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosil-5-iodouracil  Moravek Biochemicals e Radiochimici    Elettroporatore M251
: Gene Pulser Xcell Cuvetta per elettroporazione Bio-Rad
da 0,4 cm Bio-Rad165-2088
DIG-Kit iniziale per la marcatura e il rilevamento del DNA di prima qualità II Roche11585614910
Soluzione di denaturazione per l'ibridazione VWR82021-478
Kit di sintesi della sonda PCR DIG Roche11636090910
DIG Roche11585762001
CSPD Set
DIGTampone Roche11585762001
50X TAE Life Technologies24710030
Tampone blotting (25 mM Tris pH 7,4,  0,15 M NaCl,  0,1% Tween20)
Reticolante ultravioletto Hoefer Fisher Scientific03-500-308
Spermidina FisherAC13274-0010
Tris HCl 2M (pH 7,5)VWR    200064-506
Denville Scientific film bio blu 8x10 Fishernc9550782
Marcatore di peso molecolare del DNA II (marcato con DIGRoche11218590910
Amersham Blotting membrana Hybond-N+ Roche95038-400
Vassoio di asciugatura in vetro Pyrex Fisher15-242A
Kimberly-Clark Asciugamani di carta piegati a C Fisher06-666-32B
Carta Whatman 3MM (26X41)Fisher    05-713-336
Sacchetto di ibridazione Roche11666649001
Tubi di ibridazione Fisher13-247-300
Girarrosto forno di ibridazione Shake 'n' Stack FisherHBMSOV14110
https://bacpac.chori.orgSet di lavaggio Anti-Digossigenina (DIG-AP)Sistema di chemiluminescenza Roche 11093274910 di tamponi di lavaggio e blocco Roche 11755633001 )

Riferimenti

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