Questo articolo descrive la tecnica utilizzata per eseguire la mappatura ottica a doppio canale in monostrati di cellule atriali HL-1 in coltura. Questo protocollo unico consente la visualizzazione simultanea dell'attività del calcio (Ca) e del voltaggio (Vm) nella stessa area per il rilevamento e l'analisi dettagliati delle proprietà elettrofisiologiche dei monostrati di coltura.
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Articolo metodologico
Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mappatura ottico ha dimostrato di essere una tecnica utile per rilevare l'attività elettrica cardiaca sia cuori intatta ex vivo e in monostrati miociti in coltura. Cellule HL-1 sono stati ampiamente utilizzati come un modello cellulare 2-dimensionale per studiare diversi aspetti della fisiologia cardiaca. Tuttavia, è stata una grande sfida per la mappa otticamente calcio (Ca) transienti e potenziali d'azione contemporaneamente dallo stesso campo visivo in una colta HL-1 monostrato cellulare atriale. Questo perché è necessario trattamento e la cura speciale per preparare le cellule sane che possono essere catturati elettricamente e otticamente mappate. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di lavoro ottimale per la doppia mappatura ottica del canale. In questo manoscritto, abbiamo descritto in dettaglio come eseguire l'esperimento di mappatura ottica doppio canale. Questo protocollo è uno strumento utile per migliorare la comprensione del potenziale d'azione propagazione e cinetica Ca in sviluppo aritmia.
Introduzione
Un calcio unico (Ca) e la tensione (V m) doppia mappatura ottica del canale tecnica 1-5 sta emergendo come uno strumento efficace per registrare simultaneamente i segnali V m e Ca sia cuori intatti e monostrati di cellule in coltura. Questa tecnica permette di ottenere informazioni potenti sul rapporto tra transienti di calcio e potenziali di azione per meglio comprendere i meccanismi elettrofisiologici sottostanti di aritmie cardiache.
Monostrati di cellule in coltura hanno dimostrato di essere un modello cellulare utile per studiare elettrofisiologia cardiaca e il meccanismo alla base di aritmie. 4,....
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Protocollo
1. Soluzione Preparazione
- Soluzione noradrenalina (NP)
- Sciogliere 40 mg di NP in 25 ml di 30 mM acido ascorbico (0,1475 g di acido ascorbico in 25 ml di Milli-Q (MQ) acqua depurata. Evitare l'esposizione alla luce diretta durante la preparazione della soluzione perché noradrenalina (NP) è sensibile alla luce.
- Filtrare la soluzione NP con un filtro a siringa da 0,22 micron. Aliquota della soluzione in 1 ml microtubi sterile e conservare a -20 ° C. Una volta congelato, NP è stabile per un mese.
- Integrata Lavare e Final Claycomb supporti
- Iniziare con 43,5 ml di Claycomb medio e integrare con 5 ml di siero bo....
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Risultati
Un confluenti monostrato colto presenta un ritmo intrinseco regolare come dimostrato in Movie 1. Abbiamo quindi effettuato V m / Ca doppia mappatura ottica del canale in una completamente confluenti HL-1 monostrato. Figura 1A mostra esempi di tracce di V m e segnali Ca da una registrazione singola battere. Mappe isocrone rappresentativi di propagazione uniforme V m e segnali Ca utilizzando il sistema duale mappatura ottica canale sono mostrate nelle
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Discussione
Questo articolo descrive gli aspetti chiave della mappatura ottica in una colta HL-1 atriale myocyte monostrato colorati con coloranti fluorescenti sensibili di calcio e di tensione. Esso comprende coltura un ottimo HL-1 monostrato cellulare, l'installazione delle apparecchiature di mappatura, mappando un monostrato colta, e l'analisi dei dati.
Per mappare con successo cellule in coltura, la chiave è quello di preparare un monostrato cellulare uniformemente distribuito. Quando la sem.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dott Claycomb per la fornitura di cellule HL-1 e protocollo dettagliato di manutenzione. Vorremmo anche ringraziare la signora Elena Carrillo e il Dr. Seth Robia per la loro assistenza con la generazione di film cellulare e Mr. Pete Caron per la sua assistenza con fare alcuni accessori per il nostro sistema duale mappatura ottica del canale.
Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 a XA), National Institutes of Health (HL113640 a XA), e Loyola University Development Fund Research (a XA).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Rhod2 polvere secca | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronico | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glucosio | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPE | Sigma | H3375 |
Riferimenti
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / e....
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Ristampe e permessi
