Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Sommario

Viene presentata una strategia per analizzare quantitativamente i dati istologici nel midollo osseo. La microscopia confocale di cellule marcate in fluorescenza in sezioni di tessuto produce immagini bidimensionali, che vengono analizzate automaticamente. Le analisi di co-localizzazione di diversi tipi di cellule vengono confrontate con i dati provenienti da immagini simulate, fornendo informazioni quantitative sulle interazioni cellulari.

Abstract

Microscopia confocale è il metodo di scelta per l'analisi della localizzazione di molteplici tipi di cellule all'interno dei tessuti complessi come il midollo osseo. Tuttavia, l'analisi e la quantificazione di localizzazione cellulare è difficile, come in molti casi si basa sul conteggio manuale, portando così il rischio di introdurre una polarizzazione rater-dipendente e riducendo l'affidabilità interrater. Inoltre, è spesso difficile giudicare se la co-localizzazione tra due celle risultati di posizionamento casuale, soprattutto quando tipi cellulari differiscono fortemente la frequenza del loro verificarsi. Qui, viene introdotto un metodo per la quantificazione obiettiva cellulari co-localizzazione nel midollo osseo. Il protocollo descrive la preparazione del campione utilizzato per ottenere sezioni istologiche di intere murini ossa lunghe, compreso il midollo osseo, così come il protocollo di colorazione e l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione. Un flusso di lavoro di analisi che va dal riconoscimento di ematopoietiche e non-hemattipi di cellule opoietic in 2 dimensioni immagini midollo (2D) ossa alla quantificazione dei contatti diretti tra queste cellule è presentato. Questo include anche un'analisi quartiere, per ottenere informazioni sul microambiente cellulare che circonda un certo tipo di cellula. Per valutare se la co-localizzazione di due tipi di cellule è il semplice risultato del posizionamento cella casuale o riflette associazioni preferenziali tra le cellule, uno strumento di simulazione che è adatto per testare questa ipotesi nel caso di ematopoietiche e cellule stromali, è utilizzato. Questo approccio non è limitato al midollo osseo, e può essere estesa ad altri tessuti per consentire riproducibili, analisi quantitativa dei dati istologici.

Introduzione

A causa di recenti sviluppi tecnologici rapidi microscopio, tra cui imaging ottico, l'analisi di cellule nel contesto di tutto il tessuto è diventato sempre più accessibile per immunologi. La caratterizzazione di singole cellule in sospensione rappresenta un metodo prezioso e indispensabile per comprendere la funzione cellulare e molecolare. Tuttavia, l'analisi delle cellule all'interno del loro (micro) ambiente -anatomical è essenziale per la comprensione delle interazioni tra i vari tipi di cellule che collaborano in processi complessi come lo sviluppo delle risposte immunitarie.

Mentre è relativamente facile per microscopis....

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati statali appropriate per il benessere degli animali (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino) e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le disposizioni vigenti (licenza esperimento animale G0194 / 11).

1. Generazione di topi fluorescente Midollo Osseo chimerici

NOTA: La generazione di midollo osseo fluorescente topi chimerici per visualizzare le cellule stromali del midollo osseo viene eseguita come descritto prima delle ^9.

1. Inizia il trattamento di Del-Cre x topi ROSA-tdRFP (topi che esprimono la proteina....

Risultati

Taglio criosezioni di osso undecalcified con il metodo del nastro Kawamoto permette l'osso intero da tagliare come sezione intatta, con midollo osseo della regione endosseo ancora attaccato all'osso mineralizzato, sia nella diafisi nonché nelle zone epifisarie con la loro alta densità trabecolare ossea (Figura 1). Colorazione nucleare delle sezioni rivela che anche se piccole crepe nel preparato non possono essere completamente evitati, la struttura delle sinusoidi e arterie e la rete reticolare.......

Discussione

Nonostante i progressi in moderni metodi di imaging ottico, l'analisi dei dati istologica è ancora spesso ostacolato dalla mancanza di strumenti di quantificazione ei modi, o da analisi parziali che si concentrano su una piccola area di interesse. L'approccio sinergico qui presentato combina analisi dell'immagine che copre l'intera regione di midollo osseo, la segmentazione automatica e rilevamento di oggetti di diversi tipi di cellule ematopoietiche e stromali, analisi co-localizzazione, ed infine uno s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Neomicina	Sigma	N6386 SIGMA	Sale triidrato di neomicina solfato, codice di pericolo UE: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contiene: 50.000 I.E. palmitato di retinile, 5.000 I.E. colocalciferolo, 30 mg acetato di tocoferile, 100 mg acido ascorbico, 1 mg acido sorbico, 200 mg olio di ricino poliossi 35, 0,5 mg galato di propile
Tampone di trasferimento (100 ml PBS, 1 ml HEPES 1 M, 50 U/ml penicillina/streptomicina)	Sigma	P4333, H3375
Emicarattere 4-idrossi-3-nitrofenilacetil coniugato alla gamma globulina di pollo
Gamma globulina di pollo (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
Soluzione di paraformaldeide al 20% (grado EM)	Science Services	15713	Codici di pericolo UE: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
Saccarosio D(+)	Carl Roth	4621.1
Ghiaccio secco
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	Codici di pericolo UE: GHS02, GHS07
Esano	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	Codici di pericolo UE: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Stampi criogenici Tissue-Tek (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Mezzo di inclusione SCEM di Kawamoto	Section-Lab, JP
Kit di preparazione per criosezioni di Kawamoto	Section-Lab, JP
Cryofilm di Kawamoto tipo 2C(9)	Section-Lab, JP
Lama per microtomo MX35 premier plus, profilo basso	Thermo Scientific	3052835	L x L: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), spessore: 0,25 mm (0,01")
Anticorpo policlonale coniugato con biotina, anti-RFP da coniglio	Rockland	600-406-379
Streptavidina Alexa Fluor 555	Life Technologies	S-32355
Anticorpo anti-MBP da ratto	J. e N. Lee		disponibile da: J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, USA, clone MT-14.7
Secondario anti-ratto da capra coniugato con Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Anticorpo anti-B220 da ratto - Alexa Fluor 594			prodotto e coniugato in sede (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 da Life Technologies
Anticorpo anti-catena leggera l1 da topo - FITC			prodotto e coniugato in sede (DRFZ), clone LS136
Anticorpo anti-catena leggera k da ratto - FITC			prodotto e coniugato in sede (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo cloridrato)	Sigma	D9542 SIGMA
Mezzo di montaggio fluorescente	DAKO	S3023
Coprioggetti (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)	Carl Roth	H875.2
Vetrini Superfrost (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Microscopio confocale a scansione laser			dotato di linee laser a 405, 488, 561, 594, 633 nm e obiettivo ad aria con NA 20X/0,8. Abbiamo utilizzato un Zeiss LSM710 e il software Zen 2010 Versione 6.0.
Strumenti automatizzati di analisi delle immagini per il midollo osseo	Wimasis, Monaco		Lo strumento per il contatto cellulare e lo strumento per la vicinanza cellulare saranno messi a disposizione da Wimasis su richiesta.
Runtime VC2012	Microsoft		download gratuito
Strumento di simulazione per il posizionamento casuale delle cellule			disponibile da noi, su richiesta
Software di analisi delle immagini con funzioni di segmentazione			Abbiamo utilizzato Volocity (Perkin Elmer) per misurare le distribuzioni dimensionali delle cellule ematopoietiche nel midollo osseo (Figura 5). Alternative sono Definiens Image Analysis (Definiens) o Cell Profiler (download gratuito)
Software di analisi delle immagini Fiji			download gratuito. Fiji è stato utilizzato da valutatori esperti per il conteggio manuale delle cellule (Figura 3).