Un metodo per la selezione di aptameri-struttura di commutazione Applicato ad una colorimetrico oro nanoparticelle Assay

Summary

Viene fornito un protocollo per selezionare aptameri a commutazione di struttura per bersagli di piccole molecole basati su un metodo di selezione di biglie magnetiche di rigore sintonizzabile. Gli aptameri selezionati con proprietà di commutazione della struttura sono utili per i saggi che richiedono un cambiamento conformazionale per segnalare la presenza di un bersaglio, come il saggio di nanoparticelle d'oro descritto.

Abstract

Piccole molecole fornire obiettivi ricche per le applicazioni di biosensori a causa delle loro implicazioni fisiologiche come biomarcatori di vari aspetti della salute umana e di prestazioni. Aptameri acidi nucleici sono stati sempre applicati come elementi di riconoscimento su piattaforme biosensori, ma selezionando aptameri verso piccoli bersagli molecolari richiede considerazioni di progettazione particolari. Questo lavoro descrive la modifica e passaggi critici di un metodo per scegliere, aptameri struttura di commutazione a piccoli bersagli molecolari. Binding sequenze da una libreria di DNA ibridato a complementari sonde di cattura del DNA su sfere magnetiche sono separate da nonbinders attraverso un cambiamento di destinazione indotta in conformazione. Questo metodo è vantaggioso perché le sequenze di legame alla matrice di supporto (sfere) non saranno ulteriormente amplificati, e non richiede l'immobilizzazione della molecola bersaglio. Tuttavia, la temperatura di fusione della sonda di cattura e la biblioteca è mantenuto pari o leggermente superiore RT, tale che sequenze tcappello dehybridize basato sulla termodinamica sarà presente anche nella soluzione surnatante. Questo limita efficacemente l'efficienza di partizionamento (capacità di destinazione separato sequenze nonbinders vincolante), e quindi molti turni di selezione sarà necessario per rimuovere le sequenze di fondo. Il metodo riportato differisce dalle precedenti selezioni aptamer struttura di commutazione grazie alla realizzazione di fasi di selezione negativa, monitoraggio arricchimento semplificata, e l'estensione della durata della sonda cattura seguente selezione di arricchimento per fornire una maggiore severità. Gli aptameri struttura commutazione selezionati sono vantaggiosi in una piattaforma saggio dell'oro nanoparticelle che segnala la presenza di una molecola bersaglio di cambiamento conformazionale del aptamer. Il saggio oro nanoparticelle è stato applicato perché fornisce una semplice rapida lettura, colorimetrico che è utile in un ambiente clinico o distribuito. Considerazioni sulla progettazione e ottimizzazione sono presentati per il saggio come proof-of-principle il lavoro in tampone per fornire una base per l'ulteriore ampliamento del lavoro verso piccolo biosensing molecole nei fluidi fisiologici.

Introduction

Piccole molecole sono da tempo riconosciuti come giocare un ruolo fondamentale in diversi processi biologici quali la tossicità fisiologica o la nutrizione, segnalazione cellulare, e trattamenti come farmaci per la malattia ^1. Diverse piccole molecole sono state anche suggerito come biomarkers indicativi delle condizioni fisiologiche, tra cui lo stress ^2,3, affaticamento ^4, e la malattia ^5. Ad esempio, i livelli di cortisolo elevati correlano con lo stress che può determinare le prestazioni fisiologiche diminuita e altre condizioni di salute ^6-8. Allo stesso modo, le variazioni nei rapporti di certi peptidi nella saliva sono predittivi di fatica, dove manifestazioni fisiologiche includono la mancanza di concentrazione, tempi di reazione alterata, e ridotta funzione cognitiva ^4. Pertanto, lo sviluppo di biosensori specifici bersaglio di monitorare i livelli di piccole molecole può fornire un prezioso metrica per valutare le capacità di salute e di performance di individual.

Storicamente, piccola molecola di rilevamento è stato eseguito con tecniche di separazione alta intensità di lavoro o da anticorpi riconoscimento basato ^6,7. Più recentemente, aptameri di acido nucleico ^9,10 sono emersi come elementi di riconoscimento che possiedono diversi vantaggi rispetto anticorpi in applicazioni specifiche. Con la loro capacità di legare un target di dimensioni variabili da ioni metallici da ¹¹ a ¹² i tessuti, aptameri sono stati ampiamente applicati come elementi di riconoscimento in piattaforme biosensori ^13,14. Rispetto agli anticorpi, aptameri sono sintetizzati chimicamente, ed è quindi semplice introdurre modificazioni chimiche riproducibili per l'immobilizzazione di superficie o di reporting. Aptameri possono essere selezionati con alta specificità bersaglio alle condizioni desiderate modificando le condizioni di selezione utilizzati, mentre gli anticorpi sono limitati a condizioni fisiologiche ^15,16. Inoltre, aptameri sono capaci di maggiore densità ligando causa thEIR più piccole dimensioni, con conseguente incremento di destinazione segnalazione efficienza su una piattaforma biosensore, e la maggiore stabilità di aptameri consente un uso ripetuto e stoccaggio sensore a lungo termine ^16.

Aptameri sono generati utilizzando una procedura nota come SELEX, in cui una libreria iniziale di sequenze è evoluto da 10 ¹³ -10 ¹⁵ molecole uniche per una piscina finale arricchito contenente diversi (10 -10 ^{1 2)} sequenze con un potenziale di impegnare la molecola bersaglio. La piscina finale arricchito viene quindi sequenziato, e le costanti di dissociazione (K _d) sono ottenuti da saggi di legame delle più alte sequenze numeriche copia con la molecola bersaglio. Evoluzione della piscina per una popolazione arricchita finale viene monitorato monitorando la percentuale di legame del bersaglio in ogni turno piscina, fino ad ottenere l'arricchimento massima. Questo avviene per un certo numero di giri evolutive, in cui le sequenze di legame sono divisi da nonbinders e amplcato utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR). La capacità di isolare efficacemente e trattenere leganti è uno dei principali determinanti della efficienza della selezione e impatta direttamente le caratteristiche dei aptameri selezionati ^15. La fase di partizionamento SELEX è più difficile per le piccole molecole dal momento che non possiedono la dimensione o la varietà di gruppi funzionali che aiutano il processo di ripartizione di proteine ​​target ^1,15. Per esempio, molte piattaforme proteina partizionamento affidano dimensioni o separazione di carica-based, tuttavia le proprietà legate DNA-piccole molecole complessi bersaglio non sono generalmente significativamente diversa da quella di sequenze non vincolante, con conseguente partizionamento inefficace ^1. Metodi di partizionamento SELEX alternativi possono comportare l'immobilizzazione o l'etichettatura del target, che potenzialmente alterano le caratteristiche di legame di una piccola molecola. Di conseguenza, la progettazione di una procedura di selezione per generare aptameri per piccola molecola target requires speciale considerazione.

Una varietà di modifiche sono state applicate alla metodologia originale SELEX per migliorare l'efficienza del procedimento di partizionamento, migliorare l'affinità o specificità delle sequenze in piscina finale, o renderlo più suscettibile di diverse applicazioni ^15,16. Una modifica SELEX grado di selezionare per piccole molecole è stato progettato per generare aptameri struttura di commutazione, o aptameri che subiscono un cambiamento conformazionale su interazione con la molecola bersaglio ^17,18. In un esempio di questo metodo, la libreria è ibridato ad un corto pezzo di DNA complementare nonbinding (cDNA) immobilizzato su sfere magnetiche ^17. Su obiettivo vincolante, il cambiamento conformazionale di sequenze di legame permette loro di dehybridize dal cDNA, rilasciandoli nella soluzione surnatante, mentre i nonbinders rimanendo ibridate al cDNA / perle sono magneticamente partizionati e scartati. Questo metodo è advantageous per piccole molecole, perché non richiede l'immobilizzazione o l'etichettatura della molecola bersaglio per realizzare la separazione.

Aptameri che sono capaci di struttura-switching possiedono una caratteristica importante per qualsiasi piattaforma potenziale biosensore che richiede un cambiamento nella struttura aptamero per rilevare la presenza di una molecola bersaglio. Specificamente, aptameri possono essere combinati con nanoparticelle di oro (AuNPs) per creare saggi che funzionano basato sul principio della struttura di commutazione per produrre una risposta colorimetrico in presenza di molecole bersaglio dopo sfida sale ^19,20. In un saggio AUNP, il aptamer DNA a singolo filamento (ssDNA) adsorbe inizialmente alla superficie AUNP e protegge da sfida sale. La presenza del bersaglio induce un cambiamento conformazionale nella aptamer che espone la superficie AUNP, causando una variazione di colore rosso-to-blue seguente aggiunta sale. AUNP test hanno anche dimostrato di amplificare il segnale, dove micromolar affinità aptamers in grado di rilevare target a livelli ordini di grandezza inferiore alla costante di dissociazione (K _d) ^21. Questa funzione è particolarmente interessante per i piccoli bersagli molecolari, dove le affinità di solito va da basso a concentrazioni micromolari millimolari ^1,15. In generale, l'analisi è anche veloce e relativamente semplice da eseguire, favorendo un ulteriore studio di saggi aptamer-AUNP come piattaforme di rilevazione biosensore.

L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo universale per la selezione di aptameri struttura-passaggio a piccole molecole per le applicazioni che utilizzano il cortisolo biosensori marcatore dello stress come una molecola rappresentante. Uno schema di rilevamento biosensore AUNP è di interesse per la sua semplicità di funzionamento e la lettura colorimetrica, ma aptameri struttura di commutazione sono applicabili alle uscite piattaforma sensing alternative, come elettrochimica ²² o ²³ fluorescenza che forniscono anche il rilevamento tramite un cambiamento aptamer conformation su obiettivo vincolante. Rispetto ai metodi precedenti, più passaggi di selezione negativi sono stati incorporati nel design ^17,18, e un sistema di rilevamento di arricchimento a base UV semplice è stato implementato (Figura 1). Questo protocollo è in contrasto con il sistema di rilevamento radiolegante arricchimento utilizzato nei metodi precedenti ^17. Il metodo proposto anche incorporato un aumento della lunghezza delle sonde di cattura cDNA utilizzati nella selezione per aumentare l'efficienza di separazione e efficacemente sintonizzare la rigorosità della selezione dopo arricchimento massima è stata osservata ^24. La stringenza piombo sintonizzata una percentuale totale inferiore del DNA eluito dalla destinazione nella piscina finale, ma ha determinato numero di copie più elevati di una sequenza che delimitano con maggiore affinità rispetto al più alto numero di sequenza di copia da una prima fase. La sequenza più alto numero di copie dalla piscina finale è stato applicato ad un saggio AUNP per illustrare che la sequenza è suscettibile di una piattaformache richiede un cambiamento strutturale per indicare obiettivo vincolante. Questo test tampone mostra che la risposta del dosaggio AUNP può essere modificato cambiando la densità del DNA applicato alla superficie, e serve come prova di principio lavoro dedicare futuri sforzi di ricerca verso lo sviluppo di piccole molecole basate aptamer-biosensori in AUNP fluidi fisiologici.

Protocol

1. Biblioteca e Primer Progettazione e sintesi

1. Progettare la biblioteca iniziale e primer (questo argomento è stato ampiamente rivisto in precedenti pubblicazioni) ^25,26.
   1. Sintetizzare le seguenti sequenze di questo studio utilizzando la chimica fosforamidite serie:
      Biblioteca: GAATGGATCCACATCCATGG-N ₄₀ -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
      Primer Forward: GGAATGGATCCACATCCATGG
      Primer Reverse: biotina-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA
   2. Progettare le sonde di cattura cDNA essere complementare alla regione 5'della libreria. Scegliere la lunghezza iniziale mediante analisi di software temperatura di fusione linea per fornire una temperatura di fusione leggermente superiore RT, con ogni successivo base di fornire un aumento della temperatura di fusione.
      mer Capture Probe: CCATTCC-biotina
      mer Capture Probe: TCCATTCC-biotina
      mer Capture Probe: ATCCATTCC-biotina
2. Purificare la libreria mediante HPLC standard. Dissalazione è sufficiente per i primer e sonde di cattura. Ricostituire oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi alla concentrazione desiderata e conservare a -20 ° C per un massimo di diversi mesi.

2. Buffer, Biblioteca, e la preparazione dei campioni

1. Preparare 500 ml di tampone in Millipore o acqua priva di nucleasi grado con concentrazioni di 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl _2, pH 7.4. Filtrare il buffer attraverso una membrana 0,2 micron sterile; stoccaggio disponibile in condizioni ambiente per mesi.
   1. In alternativa, utilizzare altri tamponi come PBS (tampone fosfato salino), HEPES (4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic), etc.
2. Impostare due thermomixers; impostare uno a 95 ° C e mantenere l'altra in condizioni ambiente (~ 20 ° C in questo lavoro). Preparare un secchio di ghiaccio.
3. Calore / scatto raffreddare la biblioteca DNA inserendo 100 ml biblioteca (~ 2,5 nmol per 10 ¹⁵ -10 ¹⁶ sequenze) nella Thermomixer impostare unt 95 ° C per 5 min. Posizionare il tubo sul ghiaccio mentre le sfere magnetiche sono preparati (sezioni 3,1-3,6). Determinare la concentrazione effettiva della libreria di DNA mediante assorbimento UV a λ = 260 nm e applicando il fattore di conversione appropriato per la libreria.
4. Preparare le soluzioni di destinazione azionari in un adeguato supporto per la solubilità di destinazione.
   1. Preparare 100 titoli analiti mM in DMSO. Queste scorte sono vitali per circa 1 mese se conservati in condizioni ambiente, ma obiettivi diversi dimostreranno diversi profili di degradazione.

3. Preparazione di biglie magnetiche e rotonda iniziale di selezione

1. Vortex 6.7 x 10 ⁸ perle / ml sfere magnetiche rivestite di streptavidina e togliere 400 ml di una nuova provetta. Posizionare il tubo sul magnete per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
2. Lavare le perle con l'aggiunta di 400 ml di Binding Buffer, vortex, e aspirare il surnatante dopo aver piazzatoil tubo sul magnete per separare le perline. Ripetere questa operazione tre volte.
3. Immobilizzare la sonda di cattura delle sfere magnetiche risospendendo le perline in 400 microlitri di buffer di legame con 50 micron (finale) sonda di cattura e incubando per 10 minuti con agitazione sulla Thermomixer in condizioni ambiente.
4. Lavare le perline tre volte con 400 ml di buffer di legame ripetendo le operazioni di lavaggio descritte nella sezione 3.2 per rimuovere la sonda cattura gratuito.
5. Risospendere le sfere in 400 ml di tampone vincolante. Rimuovere 100 microlitri della soluzione di tallone per le fasi successive, e mantenere i rimanenti 300 ml a 4 ° C da utilizzare per ulteriori turni di selezione per un massimo di tre settimane.
6. Lavare le perle due volte con 200 ml di tampone vincolante come descritto nella sezione 3.2.
7. Aggiungere 100 ml di scatto raffreddati DNA dalla sezione 2.3 ai talloni lavati e incubare per 30 minuti con agitazione con il Thermomixer in condizioni ambiente.
   NOTA: Le concentrazioni di DNA nei primi giri sono superiore a quello dei successivi cicli per minimizzare la perdita di sequenza in turni precedenti dove teoricamente presenti sequenze uniche.
8. Quantificare il DNA nel surnatante mediante assorbimento UV come nella sezione 2.3 e sottrarre questo dall'importo iniziale aggiunto nella sezione 3.7 per valutare la quantità di DNA legato alle perle.
   1. Lavare le perline con 200 tampone seguito da due lavaggi supplementari con 200 microlitri tampone con agitazione vincolante per un thermomixer per 5 min a condizioni ambientali vincolanti microlitri.
9. Risospendere le sfere in 200 ml di 100 mM di destinazione diluiti in tampone di legame, e ruotare sul thermomixer per 30 minuti in condizioni ambiente. Preparare le soluzioni di lavoro fresco all'inizio di ogni giorno prima selezione perché il bersaglio e di controllo sono stati osservati per aggregare dalla soluzione acquosa nel tempo. Conservare il surnatante che contiene la sequenza bersaglio eluitis per ulteriori studi.
10. Eseguire la selezione negativa dopo il completamento di 1-2 cicli aggiungendo 200 ml di 1 mM progesterone alle perle preparate nella sezione 3.8.1. Agitare delicatamente per 30 min in thermomixer in condizioni ambiente.
11. Utilizzare il supporto magnetico per catturare le sfere e scartare il surnatante, lavare le perle due volte in 200 ml di tampone prima di cortisolo Inoltre vincolante come nella sezione 3.9.

4. Monitoraggio Enrichment, PCR, e Generation DNA a singolo filamento

1. Aggiungere la soluzione supernatante in una cassetta di dialisi per monitorare selezione arricchimento. La dialisi è necessario rimuovere cortisolo dal DNA eluito perché cortisolo è presente in concentrazioni molto più elevate rispetto al DNA, e ha anche un picco di assorbimento UV che si sovrappone UV DNA λ _max = standard di 260 nm.
   1. Eseguire questo passaggio ogni giro (round 2, 4, 6, e 8), nei primi turni di selezione. Questo attenua campione loss quando potenzialmente qualche numero di copie di ogni sequenza sono presenti (diversità più alto). Per risultati più rapidi, metodi alternativi come la dimensione colonne di esclusione possono essere utilizzati come bene.
2. Dializzare cassette con il campione in freschi 250 ml di tampone di legame per 2 ore in condizioni ambiente per due volte. Sostituire tampone e incubare a 4 ° CO / N.
3. Analizzare piscina dializzato mediante spettroscopia UV per determinare la percentuale di DNA eluito dal target (confrontare i risultati di sezione 3.8).
4. Preparare un gel di agarosio al 3% con 1% w / v etidio bromuro. In questo lavoro, preparare un gel da 1,5 g di agarosio, 50 ml di tampone TAE (Tris 40 mM acetato, 1 mM EDTA, pH = 8,0), e 10 ml di bromuro di etidio.
5. Cycle-ottimizzare la piscina dializzata eseguendo una piccola scala PCR (5 x 50 aliquote microlitri) con ~ 5-15 cicli. Per i componenti di PCR, utilizzare 1x tampone PCR reazione (tutte le concentrazioni finali), 200 micron dNTP, il 10% del volume di reazione del modello di DNA, 500 Nm ciascuno di primer e 2.5U polimerasi (2,5 U / ml magazzino).
   1. Esegui PCR utilizzando condizioni ottimizzato a 95 ° C per 2 min, seguiti da cicli ripetuti di 95 ° C (30 sec), 55 ° C (30 sec), e 72 ° C (1 minuto), poi a 72 ° C (10 min) estensione finale e tenere a 4 ° C.
   2. Impiegare una scala standard di 25 bp per il confronto e visualizzare su un imager gel. Selezionare il numero di cicli che produce la banda più alta intensità al marcatore dimensione corretta senza by-prodotti indesiderati.
   3. Analizzare i risultati dell'ottimizzazione del ciclo combinando 10 ml di ogni ciclo di PCR con 2 ml di 6x blu / arancio loading dye, e caricando in 5 pozzetti separati su gel di agarosio al 3% preparati nel passo 4.4 (125 V per 45 minuti).
6. Eseguire un grande PCR scala utilizzando le condizioni ed il numero di ciclo appropriata determinate al punto 4.5. Tipicamente 6-8 ml di reazioni PCR sono stati necessari per ottenere il 1-2,5 nmol utilizzato per ogni turno in questa selezione. Utilizzare tubi 8-strip per semplificarela gestione dei numerosi tubi necessari per Aliquota questo volume per l'amplificazione PCR.
7. Preparare un gel 3%, come descritto nel paragrafo 4.4, e convalidare che la band prodotto di PCR appare nella posizione corretta seguendo i passi delle sezioni 4.5.2-4.5.3.
8. Convertire l'intero prodotto a doppio filamento di DNA dalla sezione 4.7 a DNA a singolo filamento da procedere nel modo seguente:
   1. Aggiungere 300 ml di perline rivestite di streptavidina (non magnetica) per una piccola colonna bloccato da fritte. Lavare le perline con 5 ml Binding Buffer allegando una siringa luer-lock e applicando una leggera pressione al pistone. Rimuovere la siringa dalla colonna e rimuovere lo stantuffo dalla siringa off-line dopo l'aggiunta di ciascun materiale così le sfere non sono disturbati da stantuffo aspirazione.
   2. Aggiungere il prodotto PCR e passare attraverso la colonna con una leggera pressione sullo stantuffo. Utilizzare diverse colonne tale che non più di 1-1,2 ml di prodotto PCR viene aggiunto a ogni colonna. Eliminare il fl finaleow attraverso poiché il DNA sarà trattenuto sulla colonna dalla frazione biotina sul filamento anti-senso.
   3. Lavare la colonna con 5 tampone vincolanti ml.
   4. Dehybridize il DNA aggiungendo 0,5 ml di 0,2 M NaOH. Conservare l'eluato in quanto contiene il singolo filamento di DNA senso.
9. Desalt il ssDNA in 0,2 M NaOH aggiungendo i 0,5 ml a una colonna dissalazione preparato da un lavaggio con acqua priva di nucleasi. Eliminare l'iniziale 0,5 ml di liquidi, quindi aggiungere acqua priva di 1 ml di nucleasi e raccogliere questo campione dissalato ssDNA. Sarà richiesto l'utilizzo di più colonne dissalazione per ogni 0,5 ml porzione.
   1. Determinare la concentrazione di DNA eluito per assorbimento UV a λ = 260 nm.
   2. Vacuum asciugare il campione e ricostituire in un volume adeguato di tampone di legame. Se non c'era abbastanza DNA ottenuto per la prossima tornata di selezione, ripetere sezioni 4.6-4.9.2.

5. turni successivi di selezione e Sequencing

1. Regolare la severità delle condizioni di selezione in funzione dei risultati del monitoraggio arricchimento (sezione 4.1). In generale, rendere le condizioni più severe in turni di selezione successivi al fine di selezionare la più alta affinità legante dalla piscina.
   NOTA: Questo potrebbe comportare una combinazione di aumentare la concentrazione di DNA, aumentando il numero, tempo o volume delle fasi di lavaggio, diminuendo la concentrazione target, aumentando la concentrazione del composto negativa selezione, o una varietà di altri metodi ^27.
   1. Applicare controlli adeguati, se del caso al fine di garantire la specificità delle sequenze per la molecola bersaglio. In questo lavoro, applicare una molecola selezione negativa (progesterone) al sistema (Tabella 1) che inizia al turno 3 e crescente concentrazione durante la selezione. A partire dal turno 11, pre-incubare la piscina DNA per 30 minuti con 10-20 mM progesterone prima di immobilizzazione delle perle (prima sezione 3.7).
   2. Aumentare la lunghezza della sonda di cattura dopo arricchimento massima viene osservata.
2. Preparare la piscina finale (circolare 15) e altre piscine che rappresenta al massimo arricchito (intorno 13) e minimamente arricchiti (turno 6) condizioni per il sequenziamento di amplificazione PCR con primer compatibili e ad alta fedeltà polimerasi.
   1. Impostare un volume di 50 microlitri di reazione con concentrazioni finali di 1x (tampone di reazione), 200 micron (ogni dNTP), 400 Nm (ciascuna di primer), 0,5 ml di piscina DNA, e 0,5 ml di polimerasi. Ciclo ottimizzare per ogni turno utilizzando la procedura di cui al punto 4.5 utilizzando le stesse condizioni di PCR, con l'eccezione di un 7 min presa a 72 ° C per l'estensione finale.
   2. Invia 50 ml di piscine preparati ad un impianto di sequenziamento in tubi microcentrifuga con tappi accuratamente sigillati con pellicola non adesivo. Porre i tubi in un tubo da 15 ml imballato con pluriball e navi O / N con impacchi di ghiaccio per l'impianto di sequenziamento.
3. Determinare il numero di copie di ogni sequenza di valutare l'arricchimento della piscina sequenziata (s).
   1. Usa il codice-scrittura / smistamento passaggi (Vedi File Codice supplementare) per i dati di sequenziamento di nuova generazione in formato FASTA per determinare i numeri di frequenza / copia di ogni sequenza ripetuta nei dati per tutte le piscine forniti dalla struttura sequenziamento:
4. Analizzare la specificità e affinità delle più alte sequenze del numero di copie. Il tipo di interazione (proteine ​​o piccole molecole), proprietà strutturali del aptamer su vincolante, e l'affinità previsto sarà dettare quale metodo è appropriato. Questo argomento è rivisto in modo più dettagliato in una serie di riferimenti ^1,28-30.

6. AUNP Sintesi e rilevamento

1. Sintetizzare le AuNPs utilizzando il metodo di riduzione citrato ^21. Mescolare 98 ml di acqua Millipore con 2 ml di 50 mM HAuCl ₄ e portare ad ebollizione.
2. Aggiungere 10 ml di sodio citrato 38,8 mM comeAppena inizia reflusso. Colore cambia in un colore rosso dopo alcuni minuti. Continuare a mescolare la soluzione per 20 minuti con il calore.
3. Lasciare che la soluzione AUNP raffreddare a RT poi filtrare attraverso una membrana 0,2 micron poliestere. Conservare tutte le sospensioni AUNP in un flacone color ambra scuro.
4. Calcolare la concentrazione AUNP per assorbimento UV, utilizzando il coefficiente di estinzione di 2,4 x 10 ⁸ L mol ^-1 cm ^{-1 31.} La concentrazione era di 10 nm di questo lavoro, con una dimensione di 17 ± 0,6 nm determinato dalla luce dinamica dispersione ^21.
5. Incubare la DNA con 10 nM AUNP per 1 ora in condizioni ambiente protetto da un foglio di alluminio. Variare il volume di AUNP per fornire una soluzione sufficiente per consentire a tutti i test desiderati da eseguire (~ 1-2 ml). Caricamento densità di 73, (molecole di DNA per AUNP) 120, e 200 D / NP sono stati esaminati in questo lavoro, e il volume e le concentrazioni variano di conseguenza.
6. Diluire il DNA / soluzione AUNP 1: 1 utilizzando HEPES tampone (HEPES 20 mM, MgCl 2 ₂ mM, pH = 7,4). Lasciare il composto equilibrare a RT coperto da un foglio di alluminio.
   NOTA: Il tempo necessario per questa fase dovrà essere ottimizzato dal ricercatore. In questo lavoro, i tempi che vanno da alcuni minuti a O / N sono stati studiati.
7. Preparare analiti (cortisolo, acido colico, 2-metossinaftalene) soluzioni madre a 100 mM in DMSO e coprire con un foglio di alluminio. Rendere soluzioni fresche iniziali prima di ogni esperimento mediante diluizione dello stock di 100 mM in una diluizione 1/3 del tampone di legame cortisolo (sezione 2.1). Diluire ulteriormente la soluzione iniziale con il tampone di legame 1/3 tale che viene aggiunto un volume costante (10 ml) del target per generare un intervallo di concentrazioni.
8. Ottimizzare la concentrazione di sale richiesta aggiungendo 80 ml di soluzione di DNA / AUNP con 10 ml di tampone di legame 1/3 (denominato "bianco").
   1. Incubare per 20 minuti a RT poi aggiungere diversi volumi di NaCl solution. Guardare per il volume di sale che induce un cambiamento appena percettibile visivamente verso un colore blu dopo l'aggiunta del sale (13-40 ml di 1 M NaCl utilizzato in questo lavoro). Questo fornisce un buon punto di partenza, ma potrebbe essere necessario ulteriore aggiustamento a seguito dei risultati dove sono oltre bersaglio.
9. Combinare 80 microlitri della soluzione di DNA / AUNP con 10 ml di soluzione di destinazione e incubare per 20 minuti a RT. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti e pipetta multicanale di analizzare più concentrazioni target contemporaneamente, sempre incluso un vuoto (sezione 6.8).
   1. Aggiungere il volume appropriato di soluzione di NaCl (13 ml di 1 M NaCl è stato applicato in questo lavoro) e analizzare immediatamente l'assorbanza a 650 e 530 nm con un lettore di piastre.
10. Tracciare i risultati come il rapporto tra valori di assorbanza (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ in funzione della concentrazione di destinazione normalizzata rispetto alla misura vuoto.

Results

La severità delle condizioni è stato inizialmente tenuto basso per mantenere raccoglitori presenti in basso numero di copie nei primi diversi round. Il primo turno, in particolare, ha implementato la severità più basso per conservare leganti in genere presentate come sequenze uniche, dimostrato dall'alta cortisolo e concentrazioni di DNA, e la mancanza di passi selezione negativa. Il successo di questa selezione aptamero è dimostrato dall'evoluzione delle piscine da una bassa percentuale eluito dalla destinazione (turno 2) ad una frazione eluita alto dal target che rimane relativamente costante a 12-13 giri (Tabella 1). Questo altopiano del DNA eluito dal target è tradizionalmente un endpoint nella selezione ("arricchimento"). Tuttavia, questo metodo ha sollevato ulteriormente la rigorosità della selezione dopo arricchimento aumentando la lunghezza della sonda di cattura cDNA (Figura 1). Allungamento questa sonda aumenta la forza dell'ibridazione tra CdnA e la piscina, aumentando la temperatura di fusione _(Tm) del complesso e richiede una più forte interazione tra target e sequenza per rilasciare le sequenze di legame in soluzione. Il primo giro di selezione attuato un'interazione cDNA più debole a causa di uno meno base G all'estremità 5'della libreria. Ciò è in linea con le condizioni di stringenza generalmente inferiori al primo turno, e non ci si aspetta un impatto significativo la selezione diversa, consentendo più potenziali leganti e sequenze di sfondo (dehybridize base di termodinamica) per passare alla successiva fase di selezione. Queste sequenze di fondo sono stati ridotti al minimo, come la selezione continua verso l'arricchimento mediante l'attuazione di condizioni di stringenza più elevati in successive fasi di selezione. Quando il cDNA è stato allungato da una 7-mer a 8-mer al turno 14, la percentuale di DNA eluito dal target è ridotta dal 15,3% al 11,1% per T _m aumentato da 19,2 ° C a 26,7 ° C. Il cDNA wulteriormente prorogato al 9-mer in turno 15 con una T _m di 31.3 ° C, lasciando cadere il totale eluito al 3,3%.

Ulteriori informazioni su arricchimento può essere ottenuta tramite sequenziamento diverse piscine, sia esempi arricchito e non arricchito, al fine di monitorare la progressione delle piscine di ogni turno. Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è emersa come un potente metodo per il sequenziamento di selezione, soprattutto perché la sequenza più alta legge (numero totale di sequenze riportato) sono ottenuti rispetto al sequenziamento Sanger. Questi sequenza superiore legge presentare una maggiore copertura del numero totale di sequenze in piscina, fornendo un quadro più completo della diversità delle sequenze. NGS rimuove anche il bias clonazione ^32, e consente il sequenziamento di piscine multiple in un unico lotto con l'aggiunta di codici a barre ^24,33. NGS è stato utilizzato per analizzare la progressione di arricchimento da tre vasche separate in questa selezione del campione (Figura 2). Piscineda rotondo 6 (lieve arricchimento rispetto al turno 2 da% eluita), rotondo 13 (più alto arricchimento), e rotondo 15 (massimo rigore) sono stati scelti come punti rappresentativi della selezione. I numeri di copie di ciascuna sequenza unica sono stati tracciati come percentuale del numero totale di sequenza legge per ogni pool. La classifica top (più alto numero di copie) di sequenza costituiva solo lo 0,1% di tutte le sequenze in turno 6 (33.435 sequenze totali, 22.463 sequenze uniche). Come la piscina diventa massimamente arricchito in giro 13, i primi classificati di sequenza aumenta al comprendono 15,4% di tutta la piscina (17.681 sequenze totali, 2987 sequenze uniche), 150x superiore a quello del turno 6 nonostante solo un ~ 5x aumento di arricchimento osservati da UV . Rotonda 15 (28.919 sequenza totale legge, 2.980 sequenze uniche) saltato al 44,9% di tutte le sequenze rappresentate dalla sequenza classifica top singola anche se il monitoraggio arricchimento UV mostrato che l'importo eluito dal bersaglio era ~ 5x inferiore a quella del tondo 13 ( Tabella 1

15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

Precedenti studi hanno esaminato il legame di queste due sequenze termoforesi microscala e dialisi all'equilibrio ^24. I risultati hanno mostrato significativi cortisolo vincolante per la sequenza di 15-1 (K _d = 6,9 ± 2,8 micron dalla dialisi all'equilibrio; 16.177; 0,6 micron di termoforesi microscala), mentre il minimo di legame è stata osservata tra il cortisolo e la sequenza 15-3. Questo dimostra che la maggiore lunghezza della sonda di cattura al turno 15 aiutato nel fornire condizioni stringenza più elevati per analizzare la maggiore affinità legante. Inoltre, né sequenza dimostrato osservabile legame alla molecola selezione negativa, progesterone, mostrando che l'aggiunta delle fasi di selezione negativi è vantaggioso per la procedura.

Il fatto che una maggiore affinità legante emerso seguente arricchimento massima (determinata con il metodo tradizionale di analizzare la percentuale di DNA eluito dalla destinazione) dopo condizioni stringenza elevati sono stati applicati in cicli di selezione convalida il metodo per estendere la lunghezza della cattura cDNA sonda post-arricchimento. Questo risultato dimostra che copiano il numero da un pool sequenziato e affinità per il target possono essere associati solo a determinate condizioni ^24,34, in concontrasto con un rapporto preliminare che implica una correlazione diretta ^35. Si evidenzia anche il vantaggio del monitoraggio arricchimento da NGS, piuttosto che esclusivamente dalla strategia eluito% comune nella maggior parte delle selezioni, che può variare naturalmente da un turno all'altro, come vengono applicate condizioni di stringenza più elevati. Tuttavia,% eluito è utile per il monitoraggio di arricchimento quando le condizioni analoghe vengono applicati in diversi round. Ad esempio, arrotonda 6-10 tutti coinvolti condizioni simili, con nessun cambiamento significativo nel processo di arricchimento (Tabella 1). Quando questo viene osservato su più turni, le condizioni sono probabilmente troppo severe per promuovere l'arricchimento, e il ricercatore dovrebbe diminuire rigore nel prossimo turno. Per esempio, la concentrazione di cortisolo è stata aumentata da 35 mM a 100 mM in turni 11-13, e l'eluizione% aumentato dal 2,5% al ​​10 round al 14,5% al ​​turno 12. Pertanto,% eluito può servire come guida per regolare la stringenza nel corso di una selezione quando similar condizioni sono confrontati di giro in giro, e possono fornire informazioni complementari a NGS per la determinazione di un endpoint selezione.

Sequenza 15-1 è stato applicato ad un saggio AUNP per determinare se una sequenza selezionata in modo da produrre un aptamero struttura commutazione funzionerebbe in un metodo che si basa su un cambiamento strutturale seguente vincolante per produrre una risposta di destinazione. Precedenti studi iniziali hanno dimostrato che il saggio AUNP con 15-1 ha risposto alle sollecitazioni biomarker cortisolo, ma altri non due marcatori di stress, adrenalina e noradrenalina, o acido colico, un marker di malattia epatica strutturalmente simile al cortisolo ^24. La risposta è stata osservata nel normale gamma di cortisolo libero riportato nel siero umano (~ 150-600 nM) ^6, che la convalida aptamer selezionato per un cambiamento strutturale dopo legame cortisolo produce una risposta nel test AUNP. In questo lavoro attuale, caratterizzazione del sistema è stato preso un passo avanti regolandola copertura (densità) del 15-1 sulla superficie AUNP. Utilizzando lo stesso insieme di condizioni, la copertura DNA è stata aumentata da 73 D / NP (molecole di DNA / AUNP), 120 D / NP e 200 D / NP (Figura 3). Acido colico prodotto una risposta minima, con l'eccezione di 10 pM a 200 D / NP. La risposta del saggio diminuita come la copertura è stata aumentata così come i limiti di rilevamento (LOD). Il LOD era 29,5 nM per 73 D / NP, 145,2 nM per 120 D / NP, e 27,3 micron per 200 D / NP. Questo risultato concorda con il lavoro di Smith et al., Che ha illustrato che la risposta di un test AUNP utilizzando la aptamer cocaina è diminuito quando la copertura aptamer è stato aumentato da 60 D / NP 300 D / NP ^36. Ciò implica che il campo di rilevamento per il target di interesse può essere regolata in base ottimizzare la copertura della superficie DNA nel saggio AUNP. Questo potrebbe essere utile quando si confrontano, ad esempio, la gamma di cortisolo libero nel siero umano (~ 150-600 nM) rispetto saliva umana (~ 5-25 nM) ^{6,37. Mentre fluidi fisiologici sono molto più complessi di questo saggio buffer, i risultati forniscono un'estensione sul lavoro prova di principio dimostrare che le condizioni AUNP possono essere regolate a seconda dell'applicazione, e che ulteriori lavori per ampliare il mezzo di fluidi biologici sarebbe di interesse per la comunità biosensore.}

Figura 1. Panoramica del metodo di selezione della struttura di commutazione. Una piccola sonda cattura cDNA biotinilato è immobilizzato su sfere magnetiche rivestite di streptavidina. Il cDNA è complementare alla regione 5'della biblioteca, ibridando biblioteca ai talloni. Quando viene aggiunto destinazione, un cambiamento conformazionale è indotto a rilasciare sequenze vincolanti dal tallone, permettendo partizionamento facilitato applicando un magnete. Il supernatante viene mantenuto per monitorare arricchimento (% DNA eluito dalla the target) da UV dopo dialisi il bersaglio dal DNA. Questo passo è necessario solo se la molecola bersaglio assorbe nello stesso intervallo UV come DNA. Le sequenze vengono poi amplificati PCR e preparato per il turno successivo di selezione. Mentre la selezione progredisce, selezione negativa è applicata, in cui le sequenze eluiti dalla molecola selezione negativa vengono scartati, e le perline con potenziali leganti bersaglio vengono quindi incubati con bersaglio. La lunghezza della sonda cDNA viene aumentata seguente arricchimento massima (% eluita) per aumentare la severità della selezione. Questo dato è stato ristampato con il permesso di ^24. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Round	[Cortisolo] (micron)	[Progesterone] (micron)	DNA Bound (pmol)	% Eluite da Target	cDNA Lunghezza
1	100	0	357,57	N / A	7-mer
2	50	0	145,49	1.4	7-mer
3	50	1	188,74	N / A	7-mer
4	50	5	336,4	2.3	7-mer
5	35	5	88.05	N / A	7-mer
6	35	10	303,89	3.1	7-mer
7	35	10	255,01	N / A	7-mer
8	35	10	236,81	2.1	7-mer
9	35	10	318.95	2.6	7-mer
10	35	10	297,18	2.5	7-mer
11	100	10	147,61	N / A	7-mer
12	100	10	154,36	14.5	7-mer
13	100	10	150.39	15.3	7-mer
14	75	20	247,71	11.1	8-mer
15	50	40	409,63	3.3	9-mer

Tabella 1. progressione di selezione e di arricchimento da% eluizione ²⁴ < strong>. N / A (non applicabile) è segnalato per turni in cui il monitoraggio arricchimento dialisi / UV non è stata eseguita nei primi turni di selezione per ridurre la perdita di sequenze di numeri bassi di copia. Questo tavolo è stato ristampato con il permesso di ^24.

Figura 2. Selezione arricchimento determinato dal sequenziamento di prossima generazione (A) Round 6.; (B) Rotondo 13; (C) Rotonde 15. Sequenze sono stati classificati in base al numero di esemplari. Il più alto numero di copie di sequenza aumentato da costituire una bassa percentuale di tutta la piscina sequenziato a turno 6 (0,1%) per una percentuale elevata in tutto 15 (44,9%), mentre la piscina è stata arricchita per l'associazione di cortisolo sequenze. Questo dato è stato ristampato con il permesso di ^24.et = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. AUNP risposta dosaggio varia da aptamer 15-1 copertura. La densità della aptamer incubato con il AuNPs è stata aumentata da 73 D / NP (triangolo rosso), 120 D / NP (quadrato verde) e 200 D / NP ( cerchio blu). Risposte di cortisolo sono colori audaci, risposta acido colico è in colori chiari. La risposta test è migliorata per il cortisolo a densità più basse, riducendo così il LOD e la gamma il target può essere rilevato all'interno. Le condizioni con la più alta risposta del cortisolo (73 D / NP) sono stati caratterizzati ulteriormente nel range lineare per fornire più punti entro il normale range atteso di cortisolo libero riportato nel siero umano (~ 150-500 nM) e saliva (5-25 nM ) ^6,37. La risposta minima di acido colico applicando le stesse condizioni 73 D / NP ha essereen dettagliato nel precedente lavoro ^24. Tutti i grafici rappresentano la media ± SEM per misurazioni due o tre esemplari.

. Figura 4. Rappresentante dei risultati di ottimizzazione del ciclo di PCR da sinistra a destra i pozzi rappresentano: 4 cicli, 6 cicli, 8 cicli, 10 cicli, 12 cicli, negativo (nessun modello DNA), 25 bp normali ladder DNA. Le condizioni ottimali si osservano a 8 cicli, dove la band singolo prodotto è ad alta intensità senza oltre-amplificazione prodotti presenti in cicli superiori.

Figura 5. AUNP ottimizzazione del tempo di incubazione del test. Il tempo di incubazione del passo AUNP / DNA a 73 D / NP è stata ridotta da O / N (Figura 3) per 30 min, e il incu destinazionebation stata immediatamente seguita da sale di addizione anziché dopo 20 min (Figura 3). (A) Una risposta si osserva per cortisolo (diamanti blu), ma non per l'acido colico (cerchi verdi) o 2MNP (2-metossinaftalene; quadrati rossi). Tutti i grafici rappresentano la media ± SEM per misurazioni due o tre esemplari. (B) Da sinistra a destra: in bianco, 10 micron cortisolo, 10 micron acido colico, 10 micron 2MNP. Cambiamento visivo può essere osservata ad occhio nudo per il cortisolo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il fatto che piccole molecole sono di interesse biologico, ma rappresentano solo il 19% di tutti gli aptameri segnalati rende metodi progettati per la selezione di aptameri che sono applicabili a piccole molecole di grande importanza. SELEX di piccole molecole particolarmente importante in quanto meno gruppi funzionali, motivi strutturali, e superficie sono disponibili per l'interazione con le sequenze rispetto alle proteine ^​​1, ed è stato stimato che meno del 30% di tutte le selezioni per bersagli tentativi hanno prodotto un aptamero ^38. Pertanto, si deve essere estremamente consapevoli di disegno sperimentale ed esecuzione in modo da selezionare successo un aptamero per una piccola molecola target.

Il metodo di selezione aptamer descritto in questo lavoro è vantaggiosa perché è applicabile a piccole molecole, senza richiedere alcuna modifica chimica che può alterare le loro proprietà di legame. È anche eluizione base, il che significa che, poiché tegli DNA, piuttosto che l'obiettivo, è inizialmente destinata quindi eluiti dalle sfere magnetiche dal target, DNA interagendo con la matrice tallone non sarà amplificato per la prossima tornata di selezione perché leganti alla molecola di interesse vengono rilasciati nel buffer surnatante e leganti matrice non specifici resta vincolato. Viceversa, è necessario un metodo di selezione negativa contro la matrice per metodi che immobilizzano il bersaglio al supporto solido ogni turno perché DNA che interagisce con la matrice viene amplificato in aggiunta ai leganti bersaglio ^1. Il metodo attuale è stato progettato come una T _m strategia selezione limitata. Ciò significa che il T _m della piscina / ibridazione cDNA era tenuto vicino a RT. Morse utilizzata una strategia simile, ma applicata una sonda cDNA 6-mer con T _m <10 ° C con condizioni di selezione a 4 ° C ^17. La nostra applicazione era di dosaggio biosensing eseguita a RT, quindi la lunghezza del cDNA è stata regolata secondoly. Ciò mantiene il rigore della selezione abbastanza basso, in modo che i potenziali leganti non si perdono perché l'interazione vincolante destinazione si verifica in un luogo remoto che non induce un cambiamento conformazionale in grado di interrompere vincolanti cDNA. Tuttavia, l'efficienza partizionamento del metodo proposto è bassa perché alcune sequenze saranno dehybridize basata esclusivamente sulla termodinamica. Al contrario, Nutiu et al. Applicato un cDNA 15-mer, e sono stati solo in grado di individuare aptameri per due dei quattro obiettivi, probabilmente perché il T _m del 15-mer era troppo elevata per consentire un rilascio da una piccola molecola bersaglio ^18. Pertanto, mentre la strategia di selezione corrente richiede molti giri per rimuovere le sequenze di fondo, controllando il rigore della selezione e riducendo al minimo la perdita di potenziali leganti la probabilità di successo saranno aumentati.

Molti ricercatori nuovi alla selezione aptamer non sono a conoscenza di aspetti importanti legati alla PCR dipotenziali leganti. Ottimizzazione del ciclo (paragrafo 4.5) è necessario perché over-amplificazione di librerie di DNA produce indesiderati sottoprodotti (tipicamente grandi dimensioni) ad alti numeri di cicli, e il prodotto desiderato può scomparire completamente con un eccesso di soli 5 ​​cicli ^39. Nel caso di un eccesso di amplificazione, i prodotti di PCR non rappresentano più quelle sequenze eluiti dal bersaglio, e le possibilità di successo di selezione sono notevolmente diminuiti. Figura 4 illustra un esempio di ottimizzazione del ciclo di turno 5 in questo lavoro. Il ciclo più bassa produce una banda minima di prodotto, la band aumenti importo tramite 8 cicli; a 10 cicli band comincia una transizione verso una maggiore dimensione over-amplificazione del prodotto, ed è quasi interamente composto prodotto over-amplificato in 12 cicli. Un altro dettaglio che molti ricercatori inesperti in SELEX può trascurare è che l'intera piscina deve essere amplificato in larga scala amplificazione PCR (paragrafo 4.6) in abetest rotonda per mitigare la perdita di leganti. Il numero di sequenze uniche possibili da oligonucleotidi è 4 ^N, dove 4 rappresenta le quattro basi di acidi nucleici, e N è il numero di basi nella regione casuale della libreria. Per questo lavoro, N = 40, risultando in uno spazio sequenze di 1,2 x 10 ²⁴ possibili sequenze uniche. Il 2.5 nmol di libreria utilizzata nel primo turno di selezione corrisponde a ~ 10 ¹⁵ molecole, il che significa che ogni copia del DNA è probabile rappresentato nel pool iniziale come una sequenza unica. Pertanto, l'intero volume del DNA eluito dalle perle della destinazione deve essere amplificato di conservare una copia di ogni potenziale legante per la prossima tornata di selezione. Una volta che si è verificato questa amplificazione iniziale, più copie sono disponibili per la selezione nei seguenti turni in cui una soluzione omogenea viene assunto per il campionamento.

La concentrazione di destinazione dovrebbe essere attentamente considerata in ogni round. Nutiu et al. Usoconcentrazione del target da 1 mM in tutto il processo di selezione, e selezionato un aptamero ATP con K _d = 600 micron ^18. Sia il lavoro attuale e la ricerca di Morse ¹⁷ iniziato con 100 pM di destinazione, diminuendo nel corso della selezione, e portato in aptameri con affinità basse micromolari. Esattamente quale round il rigore deve essere aumentato (concentrazione di riferimento inferiore) dipende da quando si osserva l'arricchimento. Un altro passo importante è quello di applicare adeguate misure di selezione negativi così aptameri dimostrano la specificità della molecola bersaglio. Quali sono utilizzati controlli è subordinata l'applicazione prevista del aptamer selezionato. Ad esempio, aptamer 15-1 è stato progettato per funzionare come un elemento di riconoscimento in un saggio biosensori per il cortisolo, così progesterone è stato utilizzato come una molecola selezione negativa perché è un precursore metabolico di cortisolo che si trova nei fluidi fisiologici ^40. L'aptamero ATP selezionata dal Nutiu et al. </ Em> non ha incluso un passo selezione negativa, e interagisce con le molecole strutturalmente simili, tra cui ADP, AMP, adenosina, e dATP ^18.

Una nota finale da considerare è che il saggio AUNP spesso richiede una notevole ottimizzazione per ogni coppia aptamer / target. Cercando il volume di sale che induce un cambiamento appena percettibile visivamente verso un colore blu dopo aggiunta sale è un buon punto di partenza, ma la regolazione del punto di partenza potrebbe essere necessaria per osservare una risposta. Abbiamo anche trovato che il saggio produce risposte drasticamente diverse a seconda concentrazione del tampone (buffer selezione può richiedere diluizione poiché la concentrazione di sale di buffer è spesso causa di aggregazione) e la composizione, grado di copertura DNA (figura 3), la preparazione del campione (alcuni organica solventi utilizzati per sciogliere il bersaglio può provocare un fondo elevato che maschera bersaglio risposta), la temperatura, il tipo di sale e di concentrazione, e incubaTempo zione (sia DNA con AUNP e DNA / AUNP con target). In condizioni pienamente ottimizzati, i risultati sono in genere osservati con un tempo imposto di incubazione <5 min, dimostrando il beneficio di una rapida risposta obiettivo della piattaforma biosensori AUNP. Per esempio, nella Figura 5, il tempo di incubazione del aptamer / AUNP passo è stato ridotto da O / N (Figura 3) per 30 min, e il sale è stato aggiunto immediatamente (<10 sec) dopo aggiunta bersaglio piuttosto che 20 minuti più tardi (Figura 3 ) ad una densità di carico di 73 D / NP. Ciò ha aumentato la risposta cortisolo a ~ 82% superiore al vuoto (Figura 5A) ad una concentrazione 10 mM bersaglio contro ~ 40% in base alle condizioni precedenti (Figura 3). Questa risposta può distinguere a occhio nudo (Figura 5B). Si noti che il campo lineare di rilevamento cortisolo è diverso in base alle condizioni precedenti, suggerendo che tali condizioni possono essere ottimizzate per una desideratacampo di rilevamento. Acido colico e 2-metossinaftalene (2MNP) controlli non producono una risposta significativa (Figure 5A-B). I ricercatori devono essere consapevoli del fatto che la riduzione di questi tempi di incubazione può facilitare una maggiore risposta di analiti con superficie AUNP, che possono contribuire al segnale complessivo maggiore (target) o di sfondo (molecole non bersaglio). Pertanto, un'attenta progettazione AUNP test e le prestazioni di caratterizzazione è necessaria per ogni coppia aptamer / target.

Questa procedura descrive un protocollo per la selezione piccole aptameri molecola strutturalmente commutazione che funzionano in una piattaforma biosensing quali il test AUNP descritto, che richiedono un cambiamento conformazionale del DNA per rilevare la presenza del bersaglio. Tuttavia, questo metodo potrebbe essere applicato ad altri sistemi come il biosensore elettrochimico o fluorescenza che funzionano sulla stessa premessa per qualsiasi destinazione dimensioni. La potenza del protocollo può essere ulteriormente sviluppato sperimentalmentediversi approcci. Innanzitutto, la selezione stessa può essere potenzialmente migliorata studiando metodi di ottimizzazione quali la determinazione della T _m ideale dell'ibridazione / libreria di cDNA che fornisce un'interazione abbastanza debole per interagire con una piccola molecola bersaglio, ma abbastanza forte per ridurre la quantità sfondo sequenze dehybridized esclusivamente dalla termodinamica. Ciò condensare il numero di cicli necessari per la selezione, risparmiando tempo in lavoro e ridurre il consumo di reagente. Ulteriori indagini modifiche alla selezione sarebbero per determinare le concentrazioni più favorevoli di perline e DNA in modo che una popolazione eterogenea di sequenze è esposto al bersaglio, specialmente nel giro iniziale. Il successo di questi esperimenti proof-of-principio di fornire una base di investire ulteriori risorse verso l'ottimizzazione e adattamento del tampone AUNP ai fluidi fisiologici. Vi è una legittima esigenza di un rapido, piattaforma biosensing robusto che può function come strumento diagnostico dello stato fisiologico di un individuo, e l'ulteriore sviluppo del test AUNP nel siero umano, sudore o saliva avrebbe incontrato una tale lacuna corrente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads M280 Streptavidin	Invitrogen	112.06D	Compatibile con DynaMag-2
Magnete DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Compatibile con Dynabeads M280 Streptavidina
Streptavidina Sefarosio ad alte prestazioni	GE Healthcare	17-5113-01	Questo è un prodotto streptavidina ad alta densità per la preparazione di ssDNA
Idrocortisone	Sigma	H4001	≥ 98%
Progesterone	Sigma	P0130	≥ 99%
Acido Colico	Sigma	C1129	≥ 98%
NanoDrop ND-1000	NanoDrop	ND-1000	Sostituito dal modello ND-2000
Tris Base	Promega	H5135	≥ 99,9%
Cloruro di sodio	Sigma	S9888	≥ 99,5%
Cloruro di magnesio esaidrato	Fluka	63068	≥ 98%
500 ml Sistema di filtraggio	Corning	430769	0,22 &; m membrana in acetato di cellulosa
Libreria di DNA	Operon	Custom	HPLC purificato
Tutte le altre	DNA IDT	Custom	Capture — desalinizzato; Aptameri —
Termomiscelatore HPLC	Eppendorf	R	Qualsiasi modello con  controllo della temperatura e della velocità di miscelazione funzionerà
PfuUltra II Fusion HotStart DNA polimerasi, 400 rxn	Agilent	600674	Taq polimerasi può essere utilizzato anche
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade	Agilent	200415	Altre marche lavoreranno qui
10x tampone DNA polimerasi Pfu clonato	Agilent	200532	Questo tampone è stato ottimizzato per la polimerasi PfuUltra II
GeneAmp PCR System	Applied Biosystems	9700	Qualsiasi modello che consenta al ricercatore di aprire il coperchio per l'ottimizzazione del ciclo funzionerà
Agarose-LE	Ambion	AM9040	≥ 99,9%
Bromuro di etidio	Sigma	E-1510	Tossicità acuta, inalazione; sospetto cancerogeno
Colonne di sintesi vuote, 1 &; m Expedite Style	Glen Research	20-0021-01	Questo modello è ideale grazie al raccordo Luer-Lok per l'accoppiamento con la siringa
Filtri di ricambio Expedite	Glen Research	20-0021-0F	1 & micro; m size
Illustra NAP-25 Colonne	GE Healthcare	17-0852-01	Qualsiasi marca con colonna di filtrazione su gel di resina di grado DNA funzionerà
Slide-A-Lyzer Cassetta per dialisi	ThermoFisher Scientific	66205	2k MWCO ha usato
cloruro d'oro (III) idrato	Sigma	254169	la purezza del 99,999% è importante
Citrato di sodio diidrato		SAFC W302600	Abbiamo scoperto che il composto prodotto da diversi produttori influisce notevolmente sui saggi AuNP
SpectraMax	Molecular Devices	I risultati M5	sono stati simili al sistema Bio-TEK
Synergy	Bio-TEK	HT	I risultati sono stati simili al sistema Molecular Devices
HEPES Buffer	Amresco	J848	Qualsiasi marca che produce un prodotto sterilizzato funzionerà
250 ml Sistema di filtri	Corning	430767	0,22 e micro; m membrana in acetato di cellulosa
Spettrofotometro UV	Varian	Cary 300	Altri marchi lavoreranno qui
Siringa da 5 ml	Becton-Dickinson	309646	Questo modello è ideale per via del raccordo Luer-Lok da accoppiare con la colonna Expedite
ThermoEC Minicell Primo	ThermoFisher Scientific	EC320	Compatibile con l'alimentatore
	Fisher Scientific	FB300	Compatibile con ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418	Infiammabile
liquido 2-Metossinaftalene	Sigma	148245	99%
Piastra di saggio	Corning	3370	96 pozzetti Fondo piatto, sterile