Articolo metodologico

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica

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DOI:

10.3791/52552

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20 febbraio 2015

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Pathogen Biology, Royal Veterinary College, London, 2BIOPHARM, Research Institute of Biopharmacy and Veterinary Drugs

In questo articolo

Sommario

La diagnosi di infezione da Eimeria nei polli rimane impegnativa. Gli approcci guidati dalla morfologia dei parassiti e dalla patologia dell'ospite sono comunemente inconcludenti, mentre gli approcci molecolari basati sulla PCR si sono dimostrati impegnativi in termini di costi e competenze. Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) come diagnostica molecolare semplice per l'infezione di Eimerian.

Abstract

I parassiti della specie Eimeria, protozoi che causano la malattia enterica coccidiosi, rappresentano una seria minaccia per la produzione e il benessere dei polli. In assenza di un controllo efficace, la coccidiosi clinica può essere devastante. La resistenza ai chemioprofilattici frequentemente utilizzati per controllare l'Eimeria è comune e l'infezione subclinica è diffusa, influenzando i rapporti di conversione alimentare e la suscettibilità ad altri agenti patogeni come il Clostridium perfringens. Nonostante la disponibilità di strumenti basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), la diagnosi dell'infezione da Eimeria si basa ancora quasi interamente su approcci tradizionali come il punteggio delle lesioni e la morfologia delle oocisti, ma nessuno dei due è semplice. I limiti degli strumenti molecolari esistenti includono la necessità di attrezzature specializzate e le difficoltà di accesso al DNA come modello. In risposta, sono stati sviluppati un semplice protocollo di preparazione del DNA sul campo e un pannello di saggi di amplificazione isotermica mediata da loop specie-specifici (LAMP) per le sette Eimeria note per infettare il pollo. Ora forniamo un protocollo dettagliato che descrive la preparazione del DNA genomico dal tessuto intestinale raccolto post-mortem, seguito dall'impostazione e dalla lettura dei saggi LAMP. La LAMP specie-specifica di Eimeria può essere utilizzata per monitorare la presenza di parassiti, valutare l'efficacia della strategia anticoccidiale di un allevamento e per diagnosticare infezioni subcliniche o malattie cliniche di particolare valore quando non è disponibile una sorveglianza esperta.

Introduzione

La produzione globale di pollo è aumentato di dieci volte nel corso degli ultimi 50 anni con il mondo in via di sviluppo che ospita quasi quattro volte l'espansione testimoniata nel mondo sviluppato (www.faostat.org) . Come la rilevanza della produzione di pollo per la sicurezza alimentare mondiale è cresciuta così ha anche il profilo di agenti patogeni che possono causare malattie gravi nei polli. Un primo esempio sono le Eimeria, protozoi parassiti onnipresenti che possono causare la malattia enterica coccidiosi 1. Ovunque i polli sono allevati uno o più Eimeria è probabilmente comune 2-4. Nel mondo sviluppato Eimeria sono controllate principalmente da chemioprofilassi, utilizzando programmi di trasporto o di rotazione per ridurre al minimo l'impatto della resistenza 5. I vaccini vivi sono utilizzati anche in sistemi in cui il valore Bird è sufficiente a giustificare il costo (ad esempio, riproduttori, strati e alcuni polli da carne 5). Come Result di queste misure coccidiosi clinica è spesso ben controllato, anche se l'infezione subclinica è comune 5. Nel vaccinazione mondo in via di sviluppo è rara e l'applicazione di droga spesso meno bene informato. Di conseguenza coccidiosis sub-clinica e clinica è più comune ed esercita un impatto economico significativo 3.

La diagnosi di infezione eimerian ha sempre utilizzato lesione segnando post mortem, anche se il sistema di punteggio più usato anche gli autori hanno commentato che per alcune specie "sembra dubbio che tale procedura dovrebbe essere tentata in qualsiasi ma moderatamente gravi infezioni" 6. Prove supplementari possono essere raccolte attraverso il rilevamento microscopico dello stadio di oocisti lifecycle resistente ambientale in campioni di feci o del disordine, anche se la sovrapposizione morfologia può confondere tutti, ma l'esperto 6,7. Alternative molecolari con reazione a catena della polimerasi (PCR), amplificatio casualen di PCR DNA polimorfico (RAPD-PCR) e tecnologie di PCR quantitativa sono stati disponibili per un massimo di 20 anni 8-10, ma fino ad oggi non sono riusciti a diventare popolare. Spesa relativa e la necessità di apparecchiature di laboratorio specializzato o di trasformazione hanno limitato la loro adozione, nonostante la natura spesso soggettiva e tecnicamente impegnativo del pathology- vecchio e basato microscopia avvicina 10,11. Tali limiti possono essere esagerati in molte delle regioni più povere del mondo, come il Sud-est asiatico, dove l'impatto della coccidiosi sulla povertà può essere proporzionalmente maggiore 12. In risposta vi è una chiara domanda di nuove semplice e sensibile, ma redditizio, Eimeria specie-specifici saggi diagnostici.

Loop-mediata amplificazione isotermica (LAMP) è un facile da preparare DNA polimerasi tecnica-driven che è in grado di amplificare grandi quantità di DNA. Ancora più importante, LAMP utilizza un polymera DNA Bstse invece della DNA polimerasi Taq comunemente usato in PCR, che facilita l'amplificazione del DNA in una singola temperatura costante, senza la necessità di cicli termici 13,14. LAMP può essere suscettibile di applicazione anche in laboratorio più rudimentale o nel campo. Caratterizzato da resistenza rispetto a molti inibitori della PCR, elevata sensibilità e specificità, saggi LAMP sono stati sviluppati per una vasta gamma di agenti patogeni, tra cui virus della malattia infettiva della borsa, Clostridium perfringens e Cryptosporidium 15-17. In risposta alla domanda di nuovi strumenti diagnostici di costo-efficacia Eimeria specie specifiche di un gruppo di saggi LAMP specifiche per ciascuno dei sette Eimeria che infettano i polli è stato sviluppato 18. Le domande per i nuovi test comprendono il monitoraggio dei parassiti occorrenza, di particolare valore dato l'associazione di specie come Eimeria maxima o Eimeria necatrix con scarsa pe economicarformance 3,4. Altre applicazioni includono valutare l'efficacia della strategia anticoccidial di una fattoria, diagnosi di infezione subclinica o malattia clinica e valutazione del rischio rappresentato da Eimeria ad una fattoria.

Protocollo

1. Modello Preparazione

NOTA: Ogni modello di DNA genomico sospettato di contenere DNA derivato da una delle sette specie Eimeria che infettano i polli può essere utilizzato come modello per base LAMP-Eimeria identificazione della specie. Campioni di tessuto intestinale per l'analisi diagnostica di campo devono essere raccolti durante la routine di post-mortem come descritto qui.

  1. Scegliere la sezione (o sezioni) dell'intestino da testare. Vedi Tabella 1 per una guida per la selezione dei siti di campionamento e le Eimeria più probabilità di essere presenti 18 e la Figura 1 per la gamma di distribuzione e localizzazione dei siti di campionamento specie-specifico.
    NOTA: Questo è di fondamentale importanza in quanto Eimeria sono notevolmente sito host specifico. Ogni specie che infetta i polli è definito dalla Regione intestinale che esso si rivolge 19. La decisione può essere influenzata da una precedente esperienza della fattoria, l'interesse per uno o more specifici Eimeria o altri indicatori diagnostici 6.
  2. Accise 5 cm o lunghezze della sezione intestinale (s) selezionati per testare Eimeria usando forbici sterili o un bisturi. Facoltativamente, conservare i campioni per analisi successive in un fissativo come ad esempio in RNAlater 18 o 95% di etanolo.
    NOTA: Se la memorizzazione in etanolo, il campione deve essere lavata accuratamente in acido tris-etilendiamminotetraacetico sterile (TE) tampone prima dell'uso.
  3. Tagliare il campione aperto longitudinalmente, rimuovere contenuti più intestinale (se presente) e raschiare le cellule dallo strato mucoso libero utilizzando il bordo di una sterile microscopio vetrino o una lama forbice etanolo / fiamma sterilizzato. Facoltativamente un campione riunito includere cellule da tutti e quattro i siti intestinali specie-specifici in un singolo tubo.
  4. Mettete il materiale raschiato in una sterile da 1,5 ml con tappo a vite provetta contenente 100 microlitri di buffer TE sterile di cui 10% (w / v) Chelex 100 resina.
  5. Agitare ogni campione vigorosamente per 1 min. Assicurarsi che il tappo a vite sia ben chiuso e poi incubare in un bagno di acqua bollente per 10 minuti.
  6. Dopo ebollizione permettono ciascun campione raffreddare a temperatura ambiente per 1-2 min.
  7. Centrifugare ogni campione utilizzando una microcentrifuga a velocità superiore (ad esempio, ~ 10.000 xg) per 1 min.
  8. Raccogliere 2 ml di surnatante risultante di essere modello di ogni saggio LAMP da intraprendere. Facoltativamente, piscina più siti intestinale in un unico tubo di fornire un saggio multi-site.

2. Eimeria LAMP Primer Preparazione (Pre-test)

  1. Preparare Eimeria LAMP scorte di primer adeguati per 100 test:
    1. Ricostituire ogni liofilizzata Eimeria LAMP fondo con l'aggiunta di acqua di grado molecolare ad una concentrazione di 100 micron (come specificato dal costruttore). Se non è specificato, calcolare il volume di grado molecolare acqua necessaria using i pesi molecolari e fisici di ciascun primer.
    2. Dispensare 60 ml di acqua grado molecolare in una provetta da 0,5 ml flip-top separato per ciascuna specie Eimeria da dosare.
    3. Aggiungere primer FIP, BIP, F3, B3, LF e LB specifico per il bersaglio Eimeria specie a dell'acqua usando i volumi indicati nella Tabella 2, creando una serie di sette specie-specifiche miscele di primer.
    4. Brevemente vortice mescolare la soluzione di primer, poi impulso microcentrifuga e congelare fino al momento.
  2. Preparare una Mastermix reazione LAMP per ogni specie Eimeria per essere analizzati. Moltiplicare i volumi indicati nella Tabella 3 per il numero di campioni e aggiungere tre per un controllo positivo, controllo negativo e pipettaggio ricambio. Pipettare in un 0,5 o 1,5 ml flip-top provetta.

3. Eimeria LAMP Assay

  1. DNA polimerasi Bst / LAMP Pipettare 23 ml Eimeria specifiche delle specie Mastermix in 0.5 ml provetta.
  2. Aggiungere template DNA 2 microlitri (preparata al punto 1), per un volume finale di reazione di 25 microlitri.
  3. Aggiungere 2 ml Eimeria specie-specifiche DNA genomico ad una reazione (controllo positivo). Aggiungere acqua grado molecolare 2 microlitri di reazione (controllo negativo).
    NOTA: Se specie-specifico DNA genomico non è disponibile una precedente LAMP positivo o prodotto PCR standard possono essere utilizzati al posto.
  4. Incubare a bagnomaria o un blocco di calore a 62 ° C per 30 min. Facoltativamente, de-attivare la DNA polimerasi Bst mediante riscaldamento a 80 ° C per 10 min se la reazione non sta per essere letto immediatamente.

4. LAMP Assay Read-out

  1. Al termine dell'incubazione valutare il colore di ogni reazione occhio sotto luce interna. I risultati negativi sembrano rosa al viola di colore, risultati positivi appaiono cielo blu 20.
  2. Facoltativamente, confermare il risultato del test LAMP in un laboratory mescolando 5 ml prodotto di reazione LAMP con 1 ml tampone di gel DNA carico per elettroforesi su gel di agarosio utilizzando un gel di agarosio 2% in 1 x Tris / borato / EDTA (TBE) buffer pre-macchiati con una macchia di acido nucleico (5 ml per 50 ml di agarosio). Aggiungere 5 ml di una scala 1Kb dimensione DNA molecolare alla corsia 1 del gel per consentire il calcolo dimensione del frammento.

Risultati

Convalida Assay

Durante la convalida ogni Eimeria specie-specifico test LAMP è stata testata utilizzando un pannello di campioni puri di DNA che rappresentano tutte le sette specie Eimeria che infettano il pollo, così come il pollo DNA genomico come controllo host. Elettroforesi su gel di agarosio è stato utilizzato per risolvere ogni test e ha dimostrato la specificità specie assoluto senza padrone cross-reattività 18. Poi, una volte dieci serie di diluizione in serie preparata utilizzando purificato tenella Eimeria genomico del DNA ha rivelato un limite di sensibilità del test tra uno e dieci copie del genoma del 18. Nessun limite massimo è stato determinato con risultati positivi ottenuti fino ad includere la più alta concentrazione (100.000 copie di genoma) 18.

Applicazione con campioni di campo

I campioni raccolti per il test Eimeria sono suscettibili di essere derivati ​​da polli trovati morti, abbattuti come conseguenza di poor salute o abbattuti per la sorveglianza sanitaria sentinella, che indica un campione probabilmente tra uno e tre anni quando parte di una routine. Test tre uccelli raccolti da un allevamento di polli da carne degli Stati Uniti come parte di un programma di sorveglianza ha prodotto tre serie di campioni intestinali. Applicazione delle specie-specifiche analisi LAMP mirato, privilegiando i siti intestinali preferiti per ciascuna specie Eimeria (Tabella 1), ha permesso l'identificazione visiva di infezione eimerian in tutti gli uccelli testato con Blu di idrossinaftolo come indicatore (Figura 2A). Il colore ottenuto con una reazione negativa LAMP utilizzando Blu di idrossinaftolo può variare dal viola al rosa, ma è sempre distinto dal blu raggiunti da un risultato positivo. Conferma mediante elettroforesi su gel di agarosio fornito risultati comparabili (Figura 2B). Durante l'applicazione campo l'utente può scegliere di applicare l'intero schermo contro tutte le sette specie, o indirizzare solo quelle specie prioritarie comeimportante o conosciuto da circolando in azienda o la zona circostante.

Il fallimento degli approcci basati sulla PCR per affermata come la diagnostica per il verificarsi di Eimeria sottolinea l'esigenza di semplicità in qualsiasi nuovo test. Mentre la lampada offre la preparazione semplice e di trasformazione di PCR, l'obbligo di testare più siti intestinali per volatile rimane scoraggiante. Produzione di un singolo campione di DNA pool per uccello, che possono poi essere sottoposta a uno o più saggi LAMP, è probabile che sia più attraente. Elaborando un campione riunito per uccello, rappresentando materiale raccolto da ciascuno dei siti intestinali specifici descritti nella Tabella 1 e aggregati prima della preparazione del DNA, per le prove con tutti e sette saggi LAMP disponibile lo stesso risultato di quando ogni sito intestinale è stata trattata separatamente (Figura 2 rispetto alla figura 3).

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Figura 1. intestinali punti di campionamento per la rilevazione LAMP di Eimeria parassiti specie che infettano i polli. Le regioni intestinali interessati dal ciascuna specie Eimeria è evidenziato dalle linee colorate, con i siti preferiti di campionamento indicato dal numero tra le linee nere tratteggiate (E. acervulina: giallo / 1, E. Brunetti: rosa / 2, E. maxima: blu / 3, E. mitis: arancio / 4, E. necatrix: rosso / 5, E. praecox: verde / 6 e E. tenella: grigio / 7). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. La diagnosi di infezione LAMP eimerian from tre polli commerciali. Le reazioni LAMP risolte utilizzando (A) Blu di idrossinaftolo, dove un cielo blu reazione è stata positiva e una viola di reazione rosa è stata negativa, e elettroforesi su gel (B) agarosio. I siti intestinali campione sono state come indicato nella Tabella 1 per ogni specie di parassiti. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox e T = E. tenella. Corsia 1 conteneva la scala GeneRuler 1Kb DNA. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. La diagnosi di infezione eimerian LAMP utilizzando campioni provenienti da tre polli commerciali separate. REAC LAMPle risolto utilizzando blu hydroxynaphthol, dove un cielo blu reazione è stata positiva e viola alla reazione rosa è stata negativa. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox e T = E. tenella. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Sito di esempio Eimeria test specie (più probabile)
Duodeno (D) E. acervulina, E. praecox
Digiuno / ileo * (J / I) E. maxima, E. necatrix
Caeca (C) E. necatrix, E. tenella
Ileo terminale (TI) E. Brunetti, E. mitis
Campione aggregato (P) E. acervulina, E. Brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E. tenella

Tabella 1. intestinale selezione specifica regione di candidato Eimeria saggi specie. La scelta della regione da campionare varia per ogni specie Eimeria come illustrato in Figura 1. Campioni aggregati includono materiale raccolto da tutti i quattro siti specifici che sono stati poi combinati per la preparazione del DNA.

Primer * Concentrazione della (micron) Volume (ml)
Acqua - 60
Forward interno Primer (FIP) 100 40
Indietro interno Primer (BIP) 100 40
Forward Outer Primer (F3) 100 10
Backward Outer Primer (B3) 100 10
Loop Forward (LF) 100 20
Loop Backward (LB) 100 20
Totale 200

Tabella 2. Preparazione di un premiscelato LAMP primer. I componenti e le proporzioni necessari per preparare un premiscelato primer per LAMP. I volumi indicati sono per 100 reazioni LAMP. * Identità Primer come mostrato nei Materiali e Barkway et al (2011) 18.

Archivio conc n Reazione finale conc n Volume per reazione (ml)
DDW - - 10.1
Buffer THERMOPOL 10 x 1 x 2.5
MgSO4 100 MM 2 mm 0.5
Mix Primer * Tabella 2 2.5
dNTP 25 MM 400 uM 0.4
Betaina 5 M 1 M 5
Blu di idrossinaftolo 3 mM 120 micron 1
DNA polimerasi Bst 8.000 U / ml 8 U 1
Totale 23

Tabella 3. Preparazione di un LAMMastermix reazione P. * Eimeria specie-specifico.

Discussione

I saggi LAMP specie-specifici di Eimeria descritti in questo articolo offrono un nuovo kit di strumenti diagnostici a supporto di un controllo efficace dei coccidi e della malattia coccidiosi. Gli esiti dell'infezione da eimerian possono includere gravi perdite economiche, nonché una grave compromissione del benessere degli uccelli e una maggiore suscettibilità alla colonizzazione da parte di patogeni zoonotici21. Le opportunità di monitorare gli allevamenti per la presenza di alcune o tutte le specie di Eimeria possono fornire un allarme precoce di un guasto nell'efficacia del controllo anticoccidiale. I principali vantaggi di LAMP includono una robusta specificità del bersaglio, derivante dalla necessità di sei diversi bersagli di sequenza di DNA, nonché un'elevata sensibilità, potenziata dall'inclusione di primer ad ansa13, sebbene la natura qualitativa, non quantitativa, di LAMP possa essere considerata una limitazione. Attualmente non è possibile discriminare la fuga di parassiti a basso livello dalla chemioprofilassi di routine o la replicazione del vaccino vivo dalla replicazione eimeriana incontrollata. Ciononostante, la facilità tecnica del protocollo e della lettura definitiva offre un notevole miglioramento rispetto agli approcci specialistici esistenti e spesso soggettivi guidati dalla patologia e dalla morfologia6,7. Ogni test può essere completato al costo di ~£ 0,75 per campione, indipendentemente dalle spese di manodopera e installazione dell'attrezzatura. Pertanto, i saggi LAMP sono anche più convenienti rispetto ad altri diagnostici molecolari come la PCR, poiché richiedono un'incubazione isotermica senza bisogno di attrezzature specialistiche.

Per molti anni l'accesso al DNA genomico di Eimeria come modello ha limitato lo sviluppo e l'applicazione della diagnostica molecolare sul campo. L'oocisti è la fase più facilmente accessibile del ciclo di vita eimeriano, ma l'estrazione di routine del DNA richiede strutture di laboratorio22. Altre fasi del ciclo di vita intestinale più labili richiedono la purificazione prima della preparazione del DNA per prevenire l'inibizione della PCR e la conseguente perdita di sensibilità23,24. La capacità di estrarre DNA eimeriano di qualità adatta per la LAMP utilizzando apparecchiature non più specializzate di una microcentrifuga e di un bagno d'acqua, integrate dall'adsorbimento di inibitori con resina chelex, promuove ora un uso più ampio della biologia molecolare nella diagnostica eimeriana. Curiosamente, il rilevamento di DNA di Eimeria misurabile con PCR quantitativa nel tessuto intestinale 20 giorni dopo l'inizio dell'infezione parassitaria, 11 giorni dopo l'ultima uscita di oocisti rilevabile, solleva l'ipotesi che la LAMP possa essere utilizzata per rilevare l'esposizione risolta al parassita e l'infezione in corso, anche dopo che eventuali lesioni visibili potrebbero essere state risolte25.

Il costo relativamente basso e i bassi requisiti tecnici della diagnostica LAMP Eimeria possono promuovere la loro applicazione nei paesi in via di sviluppo, dove altri approcci più consolidati potrebbero non essere disponibili o appropriati. Affinché ciò sia applicabile, ogni test deve essere in grado di rilevare tutti i ceppi che possono circolare all'interno di ciascuna regione. Sebbene la comprensione della diversità genetica prevalente tra le specie di Eimeria sia limitata26, l'uso di sequenze target precedentemente convalidate per l'uso nella PCR quantitativa con ceppi provenienti da Africa, Asia, Europa e Sud America fornisce alcune prove di conservazione, a sostegno dell'utilità di questi saggi LAMP in tutto il mondo10.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Il lavoro svolto in questo studio è stato sostenuto in parte dal Royal Veterinary College attraverso il fondo per i progetti di ricerca studenteschi, nonché dal Consiglio di ricerca per le biotecnologie e le scienze biologiche e dal Dipartimento per lo sviluppo internazionale (numero di sovvenzione BB/H009337/2). A questo manoscritto è stato assegnato il PPB_00795 di riferimento dalla RVC.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RNAlaterAmbionAM7024
EtanoloVWR Chemicals20821.321Attenzione, altamente infiammabile
100 x Tris-EDTA (TE) concentrato tamponeSigma-AldrichT9285
Chelex 100 resinaBio-Rad142-1253
Acqua di grado molecolareInvitrogen10977035
E. acervulina F3Sigma-AldrichVC00021*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC
E. acervulina B3Sigma-AldrichVC00021*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG
E. acervulina FIPSigma-AldrichVC00021*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT
E. acervulina BIPSigma-AldrichVC00021*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG
E. acervulina LBSigma-AldrichVC00021*TAAGGTTACACCCGTGGAGG
E. acervulina LFSigma-AldrichVC00021*GCCATGCACAAAGCGACTT
E. brunetti F3Sigma-AldrichVC00021*GGCCATCAAGTTCCATGAGC
E. brunetti B3Sigma-AldrichVC00021*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT
E. brunetti FIPSigma-AldrichVC00021* GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT
E. brunetti BIPSigma-AldrichVC00021*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC
E. brunetti LBSigma-AldrichVC00021*GAAACGCTCGAACATGGC
E. brunetti LFSigma-AldrichVC00021*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT
E. maxima F3Sigma-AldrichVC00021* ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT
E. maxima B3Sigma-AldrichVC00021*CCTTCCTCCCTTTTTTGAAAACTG
E. maxima FIPSigma-AldrichVC00021*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA
AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG
E. maxima BIPSigma-AldrichVC00021*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA
E. maxima LBSigma-AldrichVC00021* CAAGCCTACGCGGACATC
E. maxima LFSigma-AldrichVC00021*TTATGCAGCTGGGTCAACG
E. mitis F3Sigma-AldrichVC00021*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG
E. mitis B3Sigma-AldrichVC00021*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA
E. mitis FIPSigma-AldrichVC00021*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT
AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT
E. mitis BIPSigma-AldrichVC00021*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA
GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG
E. mitis LBSigma-AldrichVC00021*TCCATGCATCCCCTTGTT
E. mitis LFSigma-AldrichVC00021*CGTGGGCACAGATTGATTC
E. necatrix F3Sigma-AldrichVC00021*TGGCTTTCCCGCGTACC
E. necatrix B3Sigma-AldrichVC00021*CGGCCCAACACAAAGACTG
E. necatrix FIPSigma-AldrichVC00021*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA
CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA
E. necatrix BIPSigma-AldrichVC00021*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC
E. necatrix LBSigma-AldrichVC00021*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT
E. necatrix LFSigma-AldrichVC00021*GAACAGCCGGAGCCTCTC
E. praecox F3Sigma-AldrichVC00021*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT
E. praecox B3Sigma-AldrichVC00021*GCGCACGAATCTGAATCACAC
E. praecox FIPSigma-AldrichVC00021*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT
A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG
E. praecox BIPSigma-AldrichVC00021*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT
E. praecox LBSigma-AldrichVC00021*GAATAGCATTGCCAGGTGG
E. praecox LFSigma-AldrichVC00021*GTCCACTGTCATTAATATTGC
TGC
E. tenella F3Sigma-AldrichVC00021*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG
E. tenella B3Sigma-AldrichVC00021* GCTGAGTCCATACGTACTTCCT
E. tenella FIPSigma-AldrichVC00021*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC
AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT
E. tenella BIPSigma-AldrichVC00021*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA
GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT
E. tenella LBSigma-AldrichVC00021*CGCATGTGCAGTTGAAGACA
E. tenella LFSigma-AldrichVC00021*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA
TTAACAAG
10 x tampone di reazione ThermoPolNew England BiolabsB9004S
MgSO4Sigma-AldrichM7506
dNTPsPromegaU1330
Soluzione di betaina (5 M)Sigma-AldrichB0300
Bst polimerasiNew England BiolabsM0275S
Blu idrossinaptoloSigma-Aldrich33936Disciolto in acqua di grado molecolare.
Agarosio ultrapuroInvitrogen16500-500
10 tampone Tris/Borato/EDTA (TBE)InvitrogenAM9863
Colorante di caricamento del DNA blu/arancione (x6)PromegaG1881
GeneRuler 1Kb Scala del DNAThermo ScientificSM0313
SafeView colorazione per acido nucleicoNBS BiologicalsNBS-SV

Riferimenti

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