Il mouse filo arteria femorale modello di lesione di restenosi è tecnicamente impegnativo. In questo protocollo vi mostriamo i principali dettagli tecnici essenziali per eseguire con successo danno filo da indurre neointima coerente per gli studi di restenosi.
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Articolo metodologico
Un modello murino di restenosi arteriosa: aspetti tecnici del femore Wire Injury
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie cardiovascolari causate da aterosclerosi è la principale causa di morte nel mondo sviluppato. Restringimento del lume del vaso, a causa dello sviluppo della placca aterosclerotica o la rottura delle placche stabiliti, interrompe il normale flusso di sangue che porta a varie patologie, come l'infarto del miocardio e ictus. Nella clinica procedure endovascolari, come l'angioplastica sono comunemente eseguiti per riaprire il lume. Tuttavia, questi trattamenti inevitabilmente danneggiano la parete del serbatoio, nonché l'endotelio vascolare, innescando una risposta guarigione eccessivo e lo sviluppo di una targa neointimale che si estende nel lume causando restenosi nave (ri-restringimento). Restenosi resta una delle principali cause di fallimento di trattamenti endovascolari per l'aterosclerosi. Così, modelli animali preclinici di restenosi sono di vitale importanza per lo studio dei meccanismi fisiopatologici e traslazionale approcci per interventi vascolari. Tra diversi experime murinomodelli ntale, lesioni filo arteria femorale è ampiamente accettata come il più adatto per gli studi di restenosi post-angioplastica perché assomiglia da vicino la procedura di angioplastica che danneggia sia endotelio e parete del serbatoio. Tuttavia, molti ricercatori hanno difficoltà utilizzando questo modello grazie al suo elevato grado di difficoltà tecnica. Ciò è dovuto soprattutto un filo metallico deve essere inserito nell'arteria femorale, che è circa tre volte più sottile il filo, per generare lesioni sufficiente ad indurre neointima prominente. Qui, descriviamo i dettagli chirurgici essenziali per superare efficacemente le maggiori difficoltà tecniche di questo modello. Seguendo le procedure presentate, eseguendo il pregiudizio del mouse filo femorale diventa più facile. Una volta familiarizzato, l'intera procedura può essere completata entro 20 min.
Introduzione
Nell'era dell'applicazione estesa dei trattamenti endovascolari per varie malattie cardiovascolari, la restenosi dopo angioplastica è uno dei principali problemi per i pazienti sottoposti a tali trattamenti. Il danno all'endotelio vascolare al momento dell'angioplastica, di concerto con lo sfondo aterosclerotico, induce un'eccessiva proliferazione delle cellule muscolari lisce nello strato mediale, con conseguente iperplasia neointimale. 1,2 Un modello animale vitale che ricapitola l'iperplasia neointimale post-angioplastica è, quindi, importante non solo per lo studio dei meccanismi della malattia, ma anche per lo sviluppo di terapie efficaci per il trattamento di questa patologia.
I topi rappresentano un eccellente animale modello per ricapitolare l'iperplasia neointimale per i seguenti motivi: i background genetici dei topi sperimentali sono ben stabiliti; è disponibile un'ampia varietà di ceppi geneticamente modificati; 2 Ottenere compagni di cucciolata dello stesso background è facile; E il costo degli animali è relativamente basso. Il modello di legatura arteriosa e il modello di lesione del filo sono i due modelli murini più comuni di iperplasia neointimale indotta meccanicamente. Il modello di legatura arteriosa è facile da creare, ma fisiologicamente dissimile dalla procedura di angioplastica vera e propria. Il modello di lesione del filo imita da vicino le procedure di angioplastica reali, ma è tecnicamente difficile a causa delle piccole dimensioni delle arterie di topo. 2,3 Sata et al. hanno descritto per la prima volta un metodo di lesione del filo per le arterie femorali di topo basato sulla struttura anatomica del sistema vascolare e sull'uso di un filo flessibile di dimensioni adeguate. Utilizzando questa tecnica, sono riusciti a indurre in modo riproducibile l'iperplasia neointimale in vari ceppi di topi. 4
Sebbene la lesione del filo femorale sia un modello ben consolidato, alcuni degli aspetti tecnici della tecnica sono molto impegnativi rispetto ad altri modelli come la legatura. 5 Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere in dettaglio le procedure del nostro modello di lesione del filo del topo, che è una versione modificata del metodo originale di Sata. Abbiamo apportato due modifiche principali: 1) Looping solo delle arterie e 2) Nessun uso di lidocaina.
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Protocollo
NOTA: Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono conformi alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academies Press, 8 ° edizione, 2011), e dei protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università del Wisconsin. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in anestesia isoflurano (attraverso inalazione, portata 2 ml / min), e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. Gli animali sono stati sacrificati in una camera progressivamente riempita con CO 2.
1. L'induzione di anestesia generale e incisione cutanea
- Utilizzare maschio C57BL / 6 topi con un'età di 12-16 settimane e peso di 23-28 g. Anestetizzare l'animale da isoflurano attraverso un apparato anestesia a circuito chiuso. Verificare il corretto anestesia pizzicando la sua punta. Applicare un po 'lacrime artificiali pomata sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Posizionare il mouse in posizione supina con dell'arto posteriore sinistro leggermente addotto e il ginocchio sl congiuntaightly flesso. Radersi i capelli intorno alla regione coscia sinistra e disinfettare la pelle con clorexidina, applicato tre volte utilizzando cotone sterile applicatori con punta. Utilizzare una perlina sterilizzatrice calda per mantenere gli strumenti sterilizzati durante l'intervento chirurgico.
- Posizionare un drappo garza sterile sulla gamba sinistra. Effettuare una retta 1,5 centimetri, incisione cutanea longitudinale sulla coscia mediale sinistro dal ginocchio all'inguine (Figura 1A).
2. L'esposizione di dall'arteria femorale e Filiali
NOTA: La figura 1B mostra l'anatomia vascolare lordo nella coscia superiore. L'arteria femorale superficiale (SFA) può essere osservato attraverso un microscopio da dissezione quando l'incisione cutanea è correttamente effettuata lungo la linea mediana della coscia mediale.
- Aprire la sottile fascia sovrastante la SFA con le pinzette sottili e poi avvolgere il SFA con 9-0 nylon sutura.
NOTA: In questo processo, il nervo femorale è facilmente messo comeide, ma la vena femorale adiacente richiede molta attenzione perché la sua parete è così sottile che fora e sanguina facilmente. La tecnica chiave è quello di concentrarsi sulla arteria stessa; finché la dissezione avviene vicino all'arteria, danni accidentali vena è evitabile. - Una volta che la SFA è in loop, tenere la sutura con una pinza di zanzare e tirarla leggermente verso il basso. Questa manovra rende ulteriormente dissezione più facile, ma per evitare di danneggiare l'arteria non tirare troppo forza.
- Continuare dissezione dell'arteria prossimale per esporre e ciclo l'arteria femorale comune (CFA) con 9-0 nylon sutura.
NOTA: In genere, looping il CFA in un punto distale all'arteria epigastrico (Figura 1B) è sufficiente per l'inserimento del filo. Tenere il ciclo di sutura CFA con pinze zanzara nello stesso modo. - Tirare l'anello di sutura CFA verso l'alto e il ciclo di sutura SFA verso il basso per scoprire la biforcazione di SFA e profonda arteria femorale (DFA). Il DFAE, la principale filiale del TUF,va verso il muscolo della coscia (Figura 1B).
NOTA: Il filo verrà inserito dal DFA tardi. - Loop la DFA con cautela perché la vena adiacente è aggrovigliato sotto l'arteria. In caso di sanguinamento dalla vena, un 30- a 60 sec compressione semplice con una garza di solito è sufficiente a produrre l'emostasi.
- Una volta che il DFAE è in loop con 9-0 sutura in nylon, assicurarsi che tutti e tre i cicli di sutura sono al loro corrette posizioni (Figura 2A).
- Procedere con la dissezione del DFA distalmente per legare l'arteria in un punto più lontano possibile dalla biforcazione. Tagliare sutura in più, ma lasciare una certa lunghezza in modo che le due estremità possono essere tenuti con una pinza di zanzara, che stabilizzano il DFAE rende l'inserimento filo più facile.
3. Creazione Wire Injury
- Inserire Wire via DFA
- Scolare le suture CFA, SFA, e DFA di stabilire un emostatico temporanea.
- Fai un piccolo foro nel DFA con microscissors. Inserire le punte delle microtweezers curvi per dilatare il foro abbastanza grande per un filo di diametro 0,015 pollici (Figura 2B mostra la differenza di dimensioni tra l'arteria e il filo).
- Prima di fare un buco nel DFA, allentare il cappio di sutura CFA e delicatamente bloccare / spremere il DFA più volte con microtweezers sordo-punta. Questa manovra si espande il diametro delle arterie notevolmente per facilitare l'inserimento del filo. Inumidire accuratamente il filo con PBS è anche importante per un inserimento scorrevole.
- Quando si effettua un foro nel DFA, non tagliare la parete arteriosa, ma fare un piccolo morso a forma di V e pizzicare la patta con microtweezers taglienti a punta per la manipolazione.
- Inserire il filo attraverso il foro adeguato, dilatato in DFA. Avanzare con delicatezza il filo verso l'arteria iliaca mentre allentando l'anello di sutura intorno al CFA. 5-8 mm è sufficiente a coprire tutta la lunghezza CFA in molti casi (Figura 2C ). Non inserire il filo con forza come una perforazione arteriosa solito si traduce in perdita del mouse. Accorciando il filo a circa 15 mm di lunghezza aiuta con movimentazione.
- Lasciare filo all'interno per 1 min
- Dopo aver inserito il filo alla lunghezza ottimale, lasciare per 1 min per deformare eccessivamente la parete arteriosa. Inumidire il filo e le arterie con PBS per evitare l'essiccazione. Un'altra sutura 9-0 nylon può essere collocato intorno prossimale DFA al punto di inserimento filo durante questo tempo di attesa. Questo sutura verrà utilizzato successivamente per chiudere il foro sul DFA dopo la rimozione del filo.
- Recuperare Wire e riprendere il flusso di sangue
- Tenere il filo con una pinza nave incannulamento, e tirarlo indietro delicatamente; il filo deve essere recuperato senza problemi. Per superare alcuna resistenza, di solito causato dalla aderenza del filo alla parete arteriosa, tirando indietro il filo con rotazione dolce è utile. Ancora una volta, una manovra forzata potrebbe provocare la perdita animali.
- Laopo il filo recuperato, legare il DFA nel punto di biforcazione con 9-0 sutura di nylon. Non legare troppo vicino alla biforcazione, che metterebbe a repentaglio il deflusso di sangue al SFA.
- Allentare gli anelli di sutura SFA e CFA di riprendere il normale flusso sanguigno. Si noti che il CFA è ben espansa-by inserimento del filo (Figura 2D).
4. Pelle Chiusura e postoperatoria cura
- Controllo sanguina. Stillicidio Minor può essere fermato con una semplice compressione; alcuni sanguinamenti maggiori arterie richiedono punti di sutura con una sutura 11-0 nylon. Queste arterie suturate finirà per determinare occlusione arteriosa.
- Chiudere la pelle ferita con cucitrici di pelle (di solito 3-4 punti metallici). Mantenere l'area ferita sterilizzata applicando soluzione chirurgica clorexidina.
- Applicare trattamenti post-chirurgici. Controllare il dolore del mouse con iniezioni sottocutanee di buprenorfina. Tenere il mouse sul tappetino di riscaldamento fino a che non ha recuperato sufciente coscienza per mantenere decubito sternale. Casa in una gabbia pulita senza compagnia di altri animali fino pienamente recuperato.
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Risultati
Quattro settimane dopo l'intervento, raccolgono l'arteria femorale filo-feriti e rendono esemplare di blocco una paraffina per analizzare la formazione neointima. Indurre anestesia generale come descritto sopra. Aprire immediatamente il torace e inserire un calibro 20 farfalla ago al ventricolo sinistro. Collegare la linea ad una bottiglia di infusione. Eseguire la fissazione perfusione per infusione a goccia di PBS seguito da 4% paraformaldeide (di solito 10-20 ml, ciascuno). La bottiglia di infusione ...
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Discussione
La procedura lesioni filo è applicabile a tutti i ceppi di topi, purché le strutture anatomiche sono simili. 4 In questo lavoro, abbiamo utilizzato maschio C57BL / 6 topi con un'età di 12-16 settimane. Come abbiamo imparato dai nostri studi preliminari, le arterie femorali di topi più giovani di 10 settimane sono spesso così piccole che l'inserimento del filo è molto impegnativo. D'altra parte, l'inserimento del filo in topi vecchi a 16 settimane è tecnicamente più semplice, ma tende a causare...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da un Wisconsin Partnership Program New Investigator Award (ID 2832), da un National Heart, Lung, Blood Institute R01 Grant (HL-068673) e da un T32 training grant (HL-110853). Ringraziamo il gruppo della dottoressa Melina Kibbe della Northwestern University per aver fornito informazioni utili.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Guida del filo a nucleo fisso | Cook | G02426 | Diametro 0,015 pollici, pinza a dilatazione diritta |
| Roboz | RS-4927 | Punte curve e smussate | |
| Pinzette Dumont #5 | World Precision Instruments | 14095 | Punte diritte e affilate |
| Pinze per incannulamento dei vasi Dumont | World Precision Instruments | 503373 | |
| Forbici McPherson-Vannas | World Precision Instruments | 501234 | |
| Pinze per zanzare | World Precision Instruments | 501291 | |
| Sutura in nylon Ethilon 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Monofilamento di nylon nero |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometri, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Monofilamento di nylon nero |
| 3M Precision Multi-Shot DS Pelle monouso Graffatrice | 3M | DS-25 |
Riferimenti
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
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Ristampe e permessi
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