Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.
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Articolo metodologico
Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La costruzione di condotti vascolari è una strategia fondamentale per la riparazione chirurgica di vasi danneggiati e feriti derivanti da malattie cardiovascolari. L'attuale protocollo presenta una strategia efficiente e riproducibile in cui è possibile generare innesti di vasi funzionali di ingegneria tissutale utilizzando cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte (PiPSC) da fibroblasti umani. Abbiamo progettato un bioreattore decellularizzato per scaffold navali, che imita da vicino la struttura proteica della matrice e il flusso sanguigno che esiste all'interno di un vaso nativo, per la semina di cellule endoteliali PiPSC o cellule muscolari lisce prima dell'innesto nei topi. Questo approccio si è dimostrato vantaggioso perché i topi immunodeficienti innestati con gli innesti derivati da PiPSC presentavano un tasso di sopravvivenza marcatamente aumentato 3 settimane dopo l'intervento chirurgico. Questo protocollo rappresenta uno strumento prezioso per la medicina rigenerativa, l'ingegneria tissutale e la terapia cellulare potenzialmente paziente-specifica nel prossimo futuro.
Introduzione
La costruzione di condotti vascolari è una strategia fondamentale per la riparazione chirurgica di vasi danneggiati e feriti derivanti da malattie cardiovascolari. Ad oggi, materiali protesici utilizzati in chirurgia includono polimeri sintetici biocompatibili (politetrafluoroetilene [Teflon], politetrafluoroetilene espanso [ePTFE, Gore-Tex] o polietilene tereftalato [Dacron]), trapianti, tessuto autologo (pericardio o vena safena) e xenotrapianti 1. Mentre innesti artificiali (ad esempio, Gore-Tex e Dacron) sono più comunemente utilizzati, questi materiali possono causare numerose complicazioni a breve e lungo termine, che includono la stenosi, d....
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Protocollo
Eseguire tutti gli esperimenti su animali secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per l'uso e la cura di animali da laboratorio.
1. Preparazione della cultura media
- Fai terreni di coltura per la linea cellulare di fibroblasti umani CCL-153: F-12K Medium, siero fetale bovino 10% (FBS) e 100 U / ml di penicillina e la streptomicina.
- Fai riprogrammazione supporti per la generazione PiPSC: mezzo di Eagle modificato di Knockout Dulbecco (DMEM) contenente il 20% Knockout siero sostituzione, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 0.1 Minimum mM Essential Medium (MEM) non-aminoacidi essenziali, 10 ng / ml di base del fattore di crescita de....
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Risultati
La generazione di successo di PiPSC stata confermata 4 giorni dopo nucleofecting fibroblasti umani con un plasmide pCAG2LMKOSimO linearizzato portando 4 fattori di trascrizione, Oct4, Sox2 Klf4 e c-Myc (OSKM). PiPSC visualizzato un fenotipo nettamente distinti rispetto ai fibroblasti (Figura 2A) ed espressa 4 fattori di riprogrammazione a mRNA (Figura 2B) e di proteine (Figura 2C) 10 livelli. L'efficacia di un innesto vascolare basato PiPSC è fortemente.......
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Discussione
Il protocollo attuale indica un suono, veloce strategia, semplice, efficiente e riproducibile in cui i vasi ingegneria tessutale funzionali possono essere generati utilizzando PiPSC da fibroblasti umani. Questa tecnica rappresenta uno strumento prezioso per la medicina rigenerativa, l'ingegneria dei tessuti e terapia cellulare potenzialmente paziente-specifica in un prossimo futuro. Passaggi critici per assicurare l'efficacia del protocollo comprendono la preparazione di PiPSC, preparazione di innesti aortica st.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari in conflitto.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da The British Heart Foundation e The Oak Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibroblasti umani CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Fibroblasti embrionali umani prenatali |
| ATCC F-12K Medium (modifica di Kaighn del terreno F-12 di Ham) | ATCC | 30-2004 | |
| Siero fetale bovino ATCC | 30-2020 | ||
| Knockout DMEM medium ottimizzato per cellule staminali embrionali | Tecnologie per la vita (Gibco) | 12660-012 | |
| Tecnologie per la vita sostitutiva del siero knockout | (Invitrogen) | 10828-028 | |
| FGF-2 di base umano | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alfa-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R& D System | 120-HD-001 | |
| Soluzione di gelatina 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmide 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| Enzima di restrizione PvuI | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Kit di sterilizzazione (kit NHDF) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomicina | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, illuminazione per stereomicroscopia | SCHOTT | KL 1500 LCD | Illuminazione a luce fredda per stereomicroscopia |
| Nikon Zoom Steromicroscopio SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Eparina sale sodico | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Soluzione madre Reagente di biologia molecolare | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Fosfato di Dulbecco Soluzione salina tamponata | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Agitatore IKA Vibrax con piattaforma di agitazione VX 7 | Jepson Bolton's, Janke & Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Azionamento digitale | della pompa Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6 canali, testa della pompa a cartuccia a 6 rulli | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S cartucce grandi per testa della pompa | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Tubo della pompa in silicone polimerizzato al platino Masterflex, L/S 14, 25 piedi | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Il tubo passa attraverso la pompa peristaltica |
| 0,5 mm di diametro interno, 0,8 mm di diametro esterno Tubo in silicone | SILEX | N/A | I tubi collegano la camera di incubazione, il serbatoio del terreno e la camera di conformità |
| Raccordo Riduttore da 0,5 a 1,6, naturale Polipropilene | Ibidi | 10829 | Adattatore collegare sopra due tipi di tubi |
| Tubo da 1/32", ID 0,01" (250µ m) Materiale: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubo attraverso la parete della camera di incubazione che collega l'innesto con il tubo esterno |
| Raccordi monopezzo | LabSmith | T-132-100 | Fissare i tubi di cui sopra attraverso la parete della camera di incubazione |
| Tubi in nylon (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) | Smiths Medical | N/A | si inseriscono in due estremità del NOD dell'innesto dell'aorta |
| . CB17-Prkdcscid/NcrCrl topo | Charles River | ||
| Suture chirurgiche, seta 8-0 | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesico per l'uso nei topi |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induzione di anestesia |
| Microscopio da dissezione | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Tubo in nylon | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0,65 mm di diametro e 1 mm di lunghezza; per fare la cuffia delle arterie |
| Elettrocoagulatore | Martin | SN 54.131 | Legatura dei rami delle arterie sull'aorta |
| Micro pinza emostatica bipolare | Martin | 80-91-12-04 | Fissazione delle estremità dei vasi |
| Dilatatore dei vasi | S& T | JFX-7 | |
| Dilatatore del vaso | S & T | JFL-3dZ | |
| dilatatore del vaso | S & T | D-5aZ | |
| Mini applicatore | AESCULAP | FE572K | |
| Clip per micro emostati | AESCULAP | FE720K | |
| Suture chirurgiche, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
Riferimenti
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr
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Ristampe e permessi
Tag
Cellule staminali pluripotenti parzialmente indotteinnesti di aorta decellularizzatacircuito di flusso del bioreattoretecnica di semina doppiaprocedura di trapianto in topodifferenziazione endoteliale e della muscolatura lisciaterapia per le malattie cardiovascolariapproccio di medicina rigenerativamodello di topo immunodeficiente
