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Summary

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Abstract

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

Introduction

La pelle è l'organo più grande del corpo. Si crea una barriera tra l'ambiente esterno e gli organi interni. Inoltre, la pelle protegge il corpo da perdita di liquidi, le influenze ambientali, ferite e infezioni e aiuta a regolare la temperatura corporea ^1. Grazie alla sua posizione esposta, la pelle è spesso influenzata da traumi meccanici, termici o chimici. Anche se la pelle è generalmente in grado di auto-riparazione, molteplici fattori locali, come l'infezione, l'ossigenazione, e la sufficienza venosa può portare a compromissione della guarigione della ferita. La guarigione delle ferite può essere disturbato da fattori sistemici come l'obesità, l'alcolismo, il fumo, i farmaci, la nutrizione e le malattie come il diabete. ²

Il processo di guarigione della ferita può essere divisa in 3 fasi: (i) la fase infiammatoria, (ii) la proliferativi e (iii) fase di rimodellamento. Su lesioni alla pelle, un complesso segnale cascade inizia, che porta alla chiusura della ferita. ³Dopo l'infortunio, la ferita sanguina e un coagulo di sangue si forma. I fibroblasti muovono nel coagulo di sangue e sostituirlo con nuovo tessuto che viene successivamente ristrutturato nel corso degli anni.

L'attuale comprensione della riparazione cutanea processi biologici di base è limitata. Modelli piccoli animali e suini sono stati utilizzati per studiare la guarigione delle ferite. Tuttavia, questi risultati non possono essere trasferiti direttamente all'uomo a causa di differenze specifiche specie. Oltre a questi modelli in vivo, alcuni aspetti della guarigione delle ferite possono essere studiati simulando una situazione ferita con graffiare in vitro colture monostrato basato su linee cellulari immortalizzate o cellule primarie. ⁴ Questi modelli razzolare altamente standardizzati ma non sufficientemente riflettono la complesso la fisiologia in vivo. ⁵ Oltre ai modelli bidimensionali, tridimensionali equivalenti pelle umana sono stati sviluppati per la ricerca dermatologica. La parte cutanea di questi modelli sono generated utilizzando vari ponteggi compresi derma decellularized, ⁶ idrogel di collagene, glicosaminoglicani ^{7,8 9} o materiali sintetici. ¹⁰ Impiegando questi equivalenti pelle, il ruolo delle interazioni epiteliali-mesenchimali ^11, la riepitelizzazione, la diafonia tra cellulare fibroblasti e cheratinociti e influenza dei diversi fattori di crescita può essere studiato. Inoltre, questi modelli sono utili per acquisire nuove conoscenze su come fibroblasti migrano nella zona ferita e come fattori chemiotattici influenzano la rigenerazione dei tessuti. ¹²

Non solo la generazione del modello guarigione della ferita in sé è impegnativo, ma anche per stabilire una ferita altamente standardizzato in un modello è problematico. Tecniche comuni per creare le ferite sono test e vinci, ¹³ ustioni, ¹⁴ nastro abrasione, ¹⁵ lesioni termiche, ¹⁶ blister di aspirazione, l'azoto liquido ^{17, 18} laser, ¹⁹ </sup> bisturi, ¹⁸ meshers ⁶ e pugni biopsia. ²⁰ La maggior parte di questi metodi hanno le stesse insidie. Gli infortuni implementate manualmente sono difficili da standardizzare e riprodurre tra più prove. Dimensioni, forma e profondità della ferita variano tra gli studi e quindi compromettono la qualità dei dati di ricerca. L'uso del laser per ferire la pelle definito può essere relativamente facile standardizzato, ma porta ad una situazione mimando ustioni. Il calore applicato dal laser può causare denaturazione delle proteine, le piastrine aggregazione o vasi costrizione, che può portare a tessuto necrotico.

In un approccio alternativo, abbiamo sviluppato un dispositivo ferimento automatico (AWD), che ci permette di generare le ferite cutanee definiti e precisi in condizioni sterili. Parametri ferimento, come la profondità e la velocità di penetrazione e giri la testa di perforazione sono regolabili. In questo studio, abbiamo combinato l'AWD con in casa sviluppati spessore pieno equivalenti pelle (ftSE) che sono paragonabili a un protocollo pubblicato da Gangatirkar et al. ⁸ Lo strato dermico dell'equivalente pelle è composto di fibroblasti dermici umani (HDF), che sono incorporati in un collagene I idrogel. Sullo strato dermico, cheratinociti epidermici umani (HEK) sono teste di serie. Entro due settimane all'interfaccia aria-liquido la HEK costruire una epidermide composta di vari strati di cellule vitali e un strato corneo. Oltre alla generazione di questo modello, questo studio mostra l'uso del awd per creare ferite definite e precise in FTSE.

Protocol

NOTA: Il protocollo è progettato per la produzione di 24 intero spessore equivalenti pelle. Umano fibroblasti dermici e cheratinociti epidermici sono stati isolati da biopsie cutanee secondo un protocollo precedentemente pubblicato. ^21,22 il consenso informato è stato ottenuto in anticipo e lo studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale sulla ricerca umana della Julius-Maximilians-Universität Würzburg (voto 182 / 10).

1. Produzione di Dermal Component

1. Sciogliere collagene con 0,1% di acido acetico ad una concentrazione finale di 6 mg / ml. Per la soluzione di neutralizzazione del gel, mescolare 232,5 ml 2x DMEM, siero fetale di vitello 7,5 ml, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml condroitin solfato (5 mg / ml). Mantenere la soluzione di neutralizzazione del gel e soluzione di collagene su ghiaccio. Calcola 500 ml di gel per equivalente di inserimento / pelle.
   NOTA: Come la soluzione di gel di neutralizzazione sarà mescolato con due parti di soluzione di collagene prepare doppia quantità di collagene.
2. Mettere 24 inserisce in un piatto ben 24.
3. Risospendere fibroblasti dermici umani (HDF) in 10 ml DMEM, centrifugare per 5 min a 270 xg e contare le cellule. Estrarre la quantità necessaria di HDF (5 x 10 ⁴ cellule per 500 microlitri gel di collagene) e centrifugare le cellule per 5 min a 270 x g.
4. Rimuovere il surnatante e con attenzione risospendere il HDF in 4 ml di soluzione raffreddata neutralizzazione gel senza produrre bolle d'aria. Da questo punto assicurarsi di lavorare più velocemente possibile per evitare solidificazione prematura del gel di collagene.
5. Risospendere la soluzione con 8 ml di soluzione di collagene.
6. Prendere la cellula-miscela di collagene con un multistep-pipetta e riempire rapidamente 500 ml di miscela in ogni inserto. Incubare il gel per 20 minuti in un incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ per gelificano i gel.
7. Immergere il gel in ml di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) siero 2 + 10% di vitello fetale (FCS) per pozzettoe incubare per 24 ore in un incubatore (37 ° C, 5% CO _2).

2. Aggiunta di Human Epidermal cheratinociti (HEK)

1. Rimuovere media dopo 24 ore. Sciogliere proteina umana fibronectina con acqua ultrapura ad una concentrazione finale di 50 mg / ml. Coprire ogni cutanea equivalente con 25 ml di soluzione di fibronectina. Incubare il gel per 30 min in un incubatore (37 ° C, 5% CO _2).
2. Nel frattempo, risospendere il Hek in 10 ml KGM-2 e impostare concentrazione cellulare di 1 x 10 ⁶ cellule / ml con KGM-ready 2 + 5% FCS. Seme 1 x 10 ⁵ HEK su ogni gel. Incubare gel per 45 min in incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ per permettere alle cellule di aderire.
3. Immergere i gel con KGM-2 pronto + 5% FCS e cultura loro in incubatore (37 ° C, 5% CO _2).

3. Cultura della completa equivalenti pelle Spessore (FTSE)

1. Cultura Ftse per 6-7 giorniin decrescente FCS-concentrazione (5%, 2% e 0% FCS). Cambiare la media ogni 2-3 giorni con la successiva concentrazione FCS inferiori. Per questo, rimuovere completamente il mezzo e aggiungere 1,6 ml di mezzo fresco.
2. Il giorno 7, rimuovere completamente media.
   NOTA: Non toccare la superficie FTSE con la punta della pipetta, mentre farlo.
3. Svolge ogni inserire in 1 pozzetto di una piastra 6 bene con pinze sterili. Aggiungere 1,5 ml di mezzo di trasporto aereo per bene, assicurarsi di non bagnare la superficie Ftse. Cambiare media ogni 2-3 giorni per altri 14 giorni.
   NOTA: Il livello di riempimento del mezzo è fino al menisco del FTSE.

4. Analisi istologica

1. Fissaggio e paraffina embedding del FTSE
   1. Togliere terreno di coltura, di trasferire gli inserti in fresco 24 pozzetti e fissare i tessuti con l'aggiunta di 1,6 ml di 4% paraformaldeide a ciascun pozzetto e incubare i tessuti per 2 ore a temperatura ambiente. Attenzione! Paraformaldehyd è tossico, manipolare sotto cappa aspirante. Trasferimentoil FTSE di una cassetta di tessuto-embedding. Eliminare le rimanenti fissativo mediante lavaggio con acqua e disidratare i tessuti con le concentrazioni ascendente di etanolo.
   2. Dividere la equivalente pelle un taglio verticale nel mezzo. Mettere i due pezzi in uno stampo di base metallica di paraffina in, con superfici di taglio verso il basso. Aggiungere la cassetta tessuto sulla parte superiore dello stampo come supporto.
   3. Tagliare 3-5 micron fette e li galleggiare su un bagno d'acqua a 40 ° per straitening, montare scivoli su appositi vetrini da microscopio. Fette asciugare accuratamente.
2. Hematoxylin & eosina (H & E) e immunoistochimica (IHC) colorazione
   1. Collocare i vetrini in rack e incubare per 1 ora a 60 ° C. Assicurarsi che la paraffina è sciolto. Stain fette con H & E reidratato come una panoramica colorazione standard.
   2. Per H & E colorazione preparare 4x Cuvette colorazione vetro con xilolo, 3x con etanolo 96%, 2x con etanolo al 70%, 1x con etanolo al 50%, 4x acqua deionizzata, 1x ematossilina, 1x HCl-eTHANOL (13.7 ml 1 M HCl ad 200 ml di etanolo al 50%), 1x scheda acqua, 1x eosina (1 g eosina in 100 ml di acqua deionizzata) e 2x 2-propanolo.
   3. Collocare i vetrini 10 min in xilolo I e 10 minuti in xilolo II Deparaffinare e reidratare le diapositive. Dip scivola 3x in etanolo 96% I, 3x in etanolo 96% II, 3x in etanolo al 70% e 3x in etanolo 50%. Ruotare i vetrini in acqua deionizzata. Per differenziare ematossilina tintura, tuffo 2x in HCl-etanolo. Risciacquare con acqua deionizzata. Per brunitura, posto scivola 5 min in acqua tab. Per eosina, posto scivola 1 min in eosina e lavare poi in acqua deionizzata. Per disidratazione, dip vetrini 2x in etanolo 70%, 2x in etanolo 96% e metterli per 5 minuti in 2-propanolo I, per 5 minuti in 2-propanolo II, 5 min in xilolo I e 5 min in xilolo II. Dopo colorazione H & E, nuclei delle cellule sono colorate in blu, citoplasma e matrice extracellulare sono macchiate di rosso.
   4. Per il recupero dell'antigene, rimuovere la paraffina con xilene e reidratare fette per la colorazione. Mettere le fettein forno a vapore e cuocere fette deparaffinate e reidratati per 20 min in pre-riscaldate a 10 mM tampone citrato (pH 6).
   5. Collocare i vetrini in tampone di lavaggio (PBS tampone + 0,5% Polysorbat 20) e fette di cerchio con un pennarello repellenti diapositiva liquido o diamante stilo.
   6. Mettere i vetrini in una camera umida. Bloccare la perossidasi endogena, con l'aggiunta di 100 microlitri 3% soluzione di perossido di idrogeno su ogni fetta. Attenzione! Molto pericoloso in caso di pelle e con gli occhi. Maneggiare con dispositivi di protezione individuale. Lavare i vetrini in tampone di lavaggio.
   7. Applicare l'anticorpo primario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte con tampone di lavaggio. Da qui in poi, i campioni devono essere tenuti all'oscuro.
   8. Utilizzare sistema di rilevamento biotina-streptavidina per il rilevamento di legame specifico antigene-anticorpo.
   9. Nuclei Controcolorare con ematossilina per 1 min. Disidratare e montare le diapositive.
   10. Campioni immagine utilizzando un microscopio inversa.

<p class = "jove_title"> 5. Infortunio per l'uso del dispositivo automatizzato Ferimento (AWD)

1. Preparare la AWD da disinfettare l'area di lavoro con il 70% di etanolo e la luce ultravioletta. Assicurarsi che la testa di foratura delle dimensioni desiderate (ad esempio, 1 mm) è attaccata.
2. Mettere equivalenti pelle in aree designate della piastra di supporto del campione in autoclave con pinza sterile. Posizionare la piastra di supporto del campione nella presa sotto la testa di foratura.
3. Utilizzare il software di controllo per impostare i parametri ferendone come segue: velocità di rotazione: 15.000 rpm; penetrazione: 1,5 millimetri; propulsione: 100 Hz. Devono essere definiti per ogni tipo di campione singolarmente Questi parametri. Trasferimento ferendo parametri AWD.
4. Avviare ferendo procedura. Rimuovere piastra di supporto del campione dalla presa. Trasferimento ferito Ftse nuovamente dentro inserti utilizzati per la cultura con pinza sterile.
5. Procedere con la cultura del FTSE feriti in incubatrice (37 ° C, 5% CO ₂₎ per le indagini di rigenerazione. Alternativa, utilizzare i modelli per l'analisi istologica in qualsiasi momento.

Representative Results

Discussion

In cellule in vitro sono normalmente espanso in colture cellulari bidimensionali, in cui le cellule aderiscono a superfici plastiche. Tuttavia, queste condizioni di coltura non riflettono le condizioni tridimensionali fisiologiche in cui le cellule crescono in vivo. In condizioni tridimensionali, le cellule possono formare allegati cellula-cellula e cellula-matrice naturali e migrare in tre dimensioni. Soprattutto nella ferita cutanea guarigione la somiglianza della situazione in vivo è fondamentale per generare dati significativi, come la migrazione delle cellule e la produzione di matrice sono elementi chiave della guarigione delle ferite.

Per simulare queste condizioni abbiamo sviluppato FTSE composti da cellule primarie umane e riflettere sia il derma e lo strato epidermico della pelle. Nel corso di due settimane di coltura all'interfaccia aria-liquido, il HEK formare un'epidermide composta da più strati di cheratinociti in diverse fasi di differenziazione e dello strato corneo. Fnoltre, lo strato dermico è composto di HDF, che sono integrati in un collagene I idrogel. Durante il tempo di coltura, l'HDF rimodellare il componente dermica, che si traduce in una contrazione significativa dei modelli (Figura 2B).

Per preparare le ferite riproducibili e standardizzate, abbiamo sviluppato un AWD. La macchina a controllo computerizzato può impostare le lesioni cutanee definite e precise (Figura 4). A seconda della destinazione di ricerca, la profondità, la forma e le dimensioni della lesione può essere adattato. Tuttavia, a causa delle specifiche tecniche del AWD e la morfologia del FTSE, si raccomanda di impostare una penetrazione minima di 100 micron riproducibilità. L'AWD opera in condizioni sterili in un box-sistema chiuso e tutti i componenti può essere sterilizzato in autoclave, soluzioni disinfettanti o luce ultravioletta. In preparazione per la procedura di ferire i campioni devono essere trasferiti ad una piastra di supporto del campione. Questo piatto facilita unesatta posizione dei campioni. Inoltre l'adesione tra il campione e la piastra di supporto del campione è sufficiente a mantenere i campioni in posizione durante la procedura di ferimento. La procedura ferimento stessa può essere monitorato otticamente attraverso una finestra anteriore o da una telecamera ad alta risoluzione che registra tutti i passi da una posizione primo piano. A differenza di altri sistemi che utilizzano laser per scavare tessuto per generare una ferita, il AWD impiega un trapano rotante. Pertanto, il calore viene applicato durante il procedimento, che è una prerogativa fondamentale per indagare ferite meccaniche. Inoltre, la forma specifica della testa di foratura assicura una rimozione del materiale dal canale ferita. Uso dei parametri ferimento empiricamente determinato di cui sopra la procedura ferendo può essere regolata per soddisfare specifiche proprietà fisiologiche di entrambi FTSE o campioni di pelle di nativi. In questo modo gli eventuali effetti collaterali indesiderati come il distacco accidentale di strati epidermici può essere minimizzato e il ferimento riproducibili eseguita con un tasso di successodel 90%.

Questo studio dimostra che il FTSE sviluppati imitano in parte la situazione in vivo della pelle con precisione e quindi possono essere utilizzati come modello per gli studi guarigione delle ferite. Sebbene aspetti importanti del processo di guarigione della ferita come l'effetto del sistema vascolare, il coagulo di sangue e il sistema immunitario mancano nel modello, l'interazione epidermica-mesenchimali e cellula-matrice è riassunta in un ambiente altamente standardizzato tridimensionale. Inoltre, abbiamo potuto dimostrare che l'AWD genera ferite standardizzati in modelli di pelle. In combinazione, entrambe le tecnologie possono essere usati per studiare la guarigione della ferita e l'effetto delle sostanze e farmaci che supportano il processo di guarigione. Al fine di simulare la situazione in vivo più da vicino, il FTSE può essere prorogato di altre cellule, come melanociti, le cellule tumorali della pelle o cellule endoteliali micro-vascolare.

Materials

Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
6 well plate 	Nunc	140685
24 well plate	Nunc	142485
Microscope slides	R. Langenbrinck	03-0070
<strong>Fibroblasts culturing (500 ml):</strong>
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio &amp; Sell	FCS.ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
<strong>Keratinozyten culture medium (500 ml):</strong>
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell&nbsp;	C-20111	89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell&nbsp;	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
<strong>Gel neutralization solution (250 ml):</strong>
Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93% (232.5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-1g	1% (2.5 ml)
Fetal bovine serum	Bio &amp; Sell	FCS.ADD.0500	3% (7.5 ml)
HEPES	Sigma&nbsp;	H3375-1kg	3% (7.5 ml)
<strong>Skin model submers medium (500&nbsp;ml):</strong>
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell&nbsp;	C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell&nbsp;	C-39011
Fetal calf serum	Bio &amp; Sell	FCS.ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)&nbsp;
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
<strong>Skin model air-liquid interface medium (500 ml):</strong>
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell&nbsp;	C-39011	adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl<sub>2</sub>
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl<sub>2</sub> (300 mM)	Sigma&nbsp;	C7902-500g	0.62% (3.1 ml)
<strong>Histology:</strong>
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma&nbsp;	HPA023040-100&micro;l
CK10 antibody	Dako	M7002
Filaggrin antibody	Abcam	ab81468
<strong>H&amp;E staining:</strong>
Mayer&acute;s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mounting Medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML