L'obiettivo di questo protocollo è quello di costruire un equivalente tridimensionale a tutto spessore della pelle, che assomiglia alla pelle naturale. Con un dispositivo di ferimento automatizzato appositamente costruito, è possibile generare ferite precise e riproducibili in caso di mantenimento della sterilità.
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Articolo metodologico
Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I modelli in vitro sono un'alternativa economica ed etica per studiare i processi di guarigione delle ferite cutanee. Inoltre, utilizzando cellule umane, questi modelli riflettono la situazione della ferita umana meglio dei modelli animali. Sebbene i modelli bidimensionali siano ampiamente utilizzati per studiare processi come la migrazione e la proliferazione cellulare, sono necessari modelli più complessi per acquisire una conoscenza più approfondita della guarigione delle ferite. Oltre a un sistema di modelli adeguato, la generazione di ferite precise e riproducibili è fondamentale per garantire risultati comparabili tra diversi cicli di test. In questo studio, viene mostrata la generazione di una pelle tridimensionale a tutto spessore equivalente allo studio della guarigione delle ferite. La parte dermica dei modelli è costituita da fibroblasti dermici umani incorporati in un idrogel di collagene di tipo I a coda di topo. Dopo l'inoculazione con cheratinociti epidermici umani e la conseguente coltura all'interfaccia aria-liquido, si forma un'epidermide multistrato sopra i modelli. Per studiare il processo di guarigione delle ferite, abbiamo inoltre sviluppato un dispositivo di feritura automatizzato, che genera ferite standardizzate in un'atmosfera sterile.
Introduzione
La pelle è l'organo più grande del corpo. Si crea una barriera tra l'ambiente esterno e gli organi interni. Inoltre, la pelle protegge il corpo da perdita di liquidi, le influenze ambientali, ferite e infezioni e aiuta a regolare la temperatura corporea 1. Grazie alla sua posizione esposta, la pelle è spesso influenzata da traumi meccanici, termici o chimici. Anche se la pelle è generalmente in grado di auto-riparazione, molteplici fattori locali, come l'infezione, l'ossigenazione, e la sufficienza venosa può portare a compromissione della guarigione della ferita. La guarigione delle ferite può essere disturbato da fattori sistemici come l&....
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Protocollo
NOTA: Il protocollo è progettato per la produzione di 24 intero spessore equivalenti pelle. Umano fibroblasti dermici e cheratinociti epidermici sono stati isolati da biopsie cutanee secondo un protocollo precedentemente pubblicato. 21,22 il consenso informato è stato ottenuto in anticipo e lo studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale sulla ricerca umana della Julius-Maximilians-Universität Würzburg (voto 182 / 10).
1. Produzione di Dermal Component
- Sciogliere collagene con 0,1% di acido acetico ad una concentrazione finale di 6 mg / ml. Per la soluzione di neutralizzazione del gel, mescolare 232,5 ml....
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Risultati
Il HDF isolata e Hek differiscono sia nella morfologia e nella espressione di marcatori tipici. HDF mostrava tipica morfologia fuso-forma, considerando morfologia Hek può essere descritto da una morfologia ciottoli. Le cellule sono state caratterizzate mediante colorazione immunoistochimica (Figura 1) prima di utilizzarli per FTSE. HDF sono positive per vimentina (Figura 1A), un marcatore per fibroblasti. Primaria HEK altamente esprimere presto proteina differenziazione citocheratina-14.......
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Discussione
In cellule in vitro sono normalmente espanso in colture cellulari bidimensionali, in cui le cellule aderiscono a superfici plastiche. Tuttavia, queste condizioni di coltura non riflettono le condizioni tridimensionali fisiologiche in cui le cellule crescono in vivo. In condizioni tridimensionali, le cellule possono formare allegati cellula-cellula e cellula-matrice naturali e migrare in tre dimensioni. Soprattutto nella ferita cutanea guarigione la somiglianza della situazione in vivo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Fraunhofer ISC per la collaborazione riguardante la costruzione del dispositivo di avvolgimento automatico. Il progetto è stato fondato dal progetto interno del Fraunhofer "Märkte von Übermorgen" (SkinHeal).
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Materiali
Coltura di fibroblasti (500 ml):H& Colorazione E:
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tripsina EDTA (1:250) 0,5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0,05% |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma | D8537 | |
| Collagene (6 mg/ml in acido acetico allo 0,1%) | Prodotto in casa | ||
| Fibronectina Proteina umana, plasma (50 µ g/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserti | Nunc | 140627 | |
| piastra a 6 pozzetti | Nunc | 140685 | |
| Piastra a 24 pozzetti | Nunc | 142485 | |
| Vetrini per microscopio | R. Langenbrinck | 03-0070< | |
| DMEM, alto glucosio | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Siero fetale bovino | Bio & Vendi | FCS. ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Terreno di coltura per cheratinozyten (500 ml): | |||
| Terreno di crescita per cheratinociti 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Terreno di crescita per cheratinociti 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Soluzione di neutralizzazione del gel (250 ml): | |||
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder con L-Glutammina | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
| Condroitina solfato sale sodico da cartilagine di squalo | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
| Siero fetale bovino | Bio & Vendi | FCS. ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Il modello di pelle immerge il terreno (500 ml): | |||
| Terreno di crescita dei cheratinociti 2 | Promocell | C-20111 | |
| Terreno di crescita dei cheratinociti 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Siero fetale di vitello | Bio & Vendi | FCS. ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Medium di interfaccia aria-liquido per modello cutaneo (500 ml): | |||
| Terreno di crescita dei cheratinociti 2 | |||
| Terreno di crescita dei cheratinociti 2 Confezione di integratori | Promocell | C-39011 | aggiungendo solo integratori: insulina, idrocortisone, epinefrina, transferrina, CaCl2 |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
| Istologia: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Anticorpo Vimentina | Abcam | ab92547 | |
| CK14 anticorpo | Sigma | HPA023040-100µ | |
| CK10 anticorpo | Dako | M7002 | |
| Filaggrin anticorpo | Abcam | ab81468< | |
| Mayer&acuto; s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Etanolo | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanololo | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Supporto di montaggio | Sigma | Aldrich M1289-10ML |
Riferimenti
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H.
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Ristampe e permessi
