Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

Sommario

Qui viene presentato un metodo comodo e potente per studiare l'autofagia in Penicillium chrysogenum utilizzando tamponi di fame (miscele di agarosio e acqua di rubinetto in un vetrino da microscopio contenente una cavità centrale).

Abstract

Lo studio dei sistemi di controllo della qualità cellulare è emerso come un campo di ricerca contemporaneo altamente dinamico e rilevante. È diventato chiaro che le cellule possiedono diverse linee di difesa contro i danni a molecole biologicamente rilevanti come gli acidi nucleici, i lipidi e le proteine. Oltre alla dinamica degli organelli (fusione/fissione/motilità/ereditarietà) e all'attività proteasica strettamente controllata, la degradazione degli organelli in eccesso, danneggiati o compromessi da parte dell'autofagia (auto-alimentazione cellulare) ha ricevuto molta attenzione da parte della comunità scientifica. La regolazione dell'autofagia è piuttosto complessa e dipende da fattori genetici e ambientali, molti dei quali non sono stati finora chiariti. Qui viene presentato un nuovo metodo che consente lo studio conveniente dell'autofagia nel fungo filamentoso Penicillium chrysogenum. Si basa sulla crescita del fungo sui cosiddetti "cuscinetti di fame" per stimolare l'autofagia in modo riproducibile. I campioni vengono analizzati direttamente al microscopio e valutati per l'induzione/progresso dell'autofagia. Il protocollo qui presentato non è limitato all'uso con P. chrysogenum e può essere facilmente adattato per l'uso in altri funghi filamentosi.

Introduzione

Funghi filamentosi sono ottimi sistemi modello per lo studio dei processi di sviluppo. Essi offrono diversi vantaggi sperimentali come la coltivazione a basso costo, un numero elevato di progenie e accessibilità genetica. L'ultimo punto è di particolare rilevanza per la costruzione di trasformanti che permettono di indagare l'importanza dei geni so-far non caratterizzate per diversi meccanismi cellulari. Funghi filamentosi sono stati strumentali per la delucidazione di diversi elementi e meccanismi di controllo della qualità vie cellulari come attività della proteasi per la degradazione delle proteine ​​aberranti, dinamiche mitocondriali per mantenere l'i....

Protocollo

1. Preparazione di P. chrysogenum per gli esperimenti da fame

1. Se la P. chrysogenum ceppo di interessi è tenuto il riso ('riso verde'), posizionare 2-3 chicchi di riso ricoperti di sporulanti micelio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Riempire con 500 microlitri YGG (10 g / l KCl, 20 g / l di glucosio, 10 g / l di lievito base di azoto, 5 g / l K ₂ HPO ₄ estratto di lievito, 20 g / l).
   1. Agitare la provetta per 30 sec in modo che le spore possano staccarsi dal riso efficiente.
   2. Incubare la provetta per 1 giorno a temperatura ambiente (per esempio, tra 20 e 25 ° C).
   3. Pr....

Risultati

Per dimostrare l'utilità del protocollo sopra descritto degrado perossisoma nel P. chrysogenum ceppo Ws54-1255 (GFP-SKL) è stato analizzato. In questo ceppo GFP-SKL è di solito importato in perossisomi ^9. Ciò provoca la comparsa di molteplici forme sferiche quando il campione viene analizzato tramite microscopia a fluorescenza. Se si verifica l'autofagia, vacuoli ingrandire. GFP-SKL viene incorporato nel vacuoli da autofagia (pexophagy). A causa del fatto che la GFP è resistente alla degradaz.......

Discussione

Il metodo qui presentato permette lo studio comoda e riproducibile dell'autofagia in P. chrysogenum. Ad esempio, può essere utilizzata per lo screening l'efficacia di vari composti che siano in grado di modulare la risposta autofagia di questo fungo o meno. I risultati con rapamicina dimostrano che l'inibizione di segnalazione TOR conduce ad una induzione pronunciato dell'autofagia in P. chrysogenum che è stato dimostrato anche per altri organismi ^11.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini per microscopio con cavità centrale	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania	H884.1	Possono essere utilizzati più volte dopo la pulizia.
Perle di vetro	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania	A553.1	Diametro: 0,25 - 0,50 mm