Neural Activity Propagazione in ippocampale preparazione piegato con un penetrante Micro-elettrodo Array

Informazioni conduzione neurale o propagazione dei segnali neurali è cruciale per determinare il meccanismo di comunicazione neurale sia nel normale funzionamento e condizioni patologiche nel cervello ^1-3. L'ippocampo è una delle strutture più studiati nel cervello in quanto svolge ruolo fondamentale in molte funzioni cerebrali come la memoria, e il monitoraggio del territorio ed è coinvolto in diverse alterazioni patologiche che influenzano notevolmente il comportamento e ^1,6. Sebbene, l'ippocampo presenta una struttura complessa, i vari elementi della struttura possono essere facilmente identificate ed accessibili nella preparazione fetta ^4-6. Nella direzione trasversale dell'ippocampo, attività neurale è noto per propagare attraverso la via tri-sinaptica che compongono il giro dentato (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5. Si ritiene che la trasmissione sinaptica e conduzione assonale svolgono un ruolo importante per communicatiin questo circuito trasversale ^4,6. Tuttavia, la propagazione del segnale neurale avviene sia trasversale e longitudinale ^4,6. Questo implica che l'ippocampo non può essere completamente studiato utilizzando preparazioni fetta che limitano l'osservazione ad una particolare direzione di propagazione ^4. La fetta longitudinale è stato sviluppato per studiare le vie assonale lungo l'asse longitudinale ^5. I ricercatori hanno osservato gamma e theta oscillazioni specifici comportamenti prevalentemente lungo la trasversale e assi longitudinali rispettivamente ^6. Questi comportamenti sono stati studiati separatamente, ma l'accesso simultaneo a due direzioni è cruciale per capire questi comportamenti. Anche con lo sviluppo della preparazione dell'ippocampo intatta, è difficile controllare la propagazione tutto il tessuto a causa della struttura ripiegata-dell'ippocampo ^4. L'ippocampo spiegato fornisce l'accesso ai neuroni imballatoin una forma di un piano bidimensionale strato di cellule ^7,8.

Con dispiegarsi giro dentato (DG) (Figura 1), l'ippocampo adotta una forma appiattita con una configurazione rettangolare, in cui entrambe le connessioni longitudinali e trasversali rimangono intatti con lo strato di cellule piramidali disposti in un foglio bidimensionale contenente sia CA3 e CA1, lasciando un pezzo di tessuto neurale che può essere usato per studiare la propagazione neurale (Figura 2) ^8. L'attività neurale può essere monitorato con i singoli pipette di vetro, matrici di microelettrodi, elettrodi stimolanti, così come coloranti sensibili tensione (VSD) ^3,7,8. Inoltre, geneticamente codificato indicatore di tensione da topi transgenici possono essere utilizzati per monitorare lo schema di propagazione ^9.

La configurazione piatta della rete dell'ippocampo spiegato è adatto per la registrazione metodo ottico, ma anche per una matrice microelettrodo. Most degli array disponibili in commercio sono fabbricati con elettrodi profilo piatto o basso e in grado di registrare l'attività neurale in entrambe le fette di tessuto e colture di neuroni ^10-12. Tuttavia, il rapporto segnale-rumore (SNR) diminuisce quando i segnali sono ottenuti da un tessuto intatto dal soma dei neuroni si trovano più in profondità nel tessuto. Schiere di elettrodi microelettrodi con elevati rapporti di aspetto sono necessari per migliorare il SNR.

A tal fine, una matrice microelettrodo penetrante (PMEA) è stato sviluppato nel nostro laboratorio, e fornisce la capacità di sondare direttamente nel tessuto inserendo 64 picchi con un diametro di 20 micron e 200 micron altezza nell'ippocampo unfolded ^7,13 . Questa matrice microelettrodo ha una maggiore SNR rispetto sensibili di imaging colorante tensione e il SNR rimane stabile durante un esperimento ^7,13. La combinazione della preparazione dell'ippocampo dispiegata e PMEA fornisce un nuovo modo di investireiGate propagazione neurale su un piano bidimensionale. Gli esperimenti con questa tecnica hanno già dato risultati significativi sui meccanismi di propagazione del segnale neurale nell'ippocampo cui attività neurale in grado di propagarsi autonomamente di sinapsi sinaptici o elettrici ^7.

NOTA: Animal protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'università. CD1 topi di entrambi i sessi, all'età di P10 a P20 sono utilizzati in questo studio.

1. Le soluzioni per la chirurgia e la registrazione sperimentale

1. Preparare tampone normale liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH ₂ PO 4 1,25, MgSO ₄ 2, _NaHCO3 26, destrosio 10, e CaCl ₂ 2. Utilizzare questo normale aCSF per il recupero dei tessuti dopo la dissezione, così come per il sistema di lavaggio all'inizio dell'esperimento.
2. Preparare saccarosio aCSF che viene utilizzata durante la dissezione dell'ippocampo e contiene (mm): 220 saccarosio, KCl 2,95, NaH ₂ PO4 1.3, MgSO ₄ 2, ₃ NaHCO 26, destrosio 10, e CaCl ₂ 2. Per indurre attività epilettiforme nella preparazione del tessuto dell'ippocampo intatta, aggiungere 4-aminopiridina (4-AP) alla normalità aCSF ala concentrazione di 100 mM.

2. Procedura chirurgica per l'Hippocampus preparazione Intact

1. Goccia isoflurano (1 ml) nella camera al fondo di un barattolo di vetro essiccatore (No.1 in materiali specifici e attrezzature) e usare un tovagliolo di carta normale per coprire la superficie della fase inferiore in modo che l'animale non entrare in contatto con il liquido. Quindi, posizionare il mouse CD1 nel barattolo e chiudere il coperchio. Mantenere l'animale nel vaso chiuso per circa 1 min per 2 min. Quando la frequenza respiro è di circa uno al secondo, rimuovere il mouse dal vaso.
2. Posizionare il mouse sul palco chirurgia e decapitarlo con un adeguato forbici. Subito dopo decapitazione, posizionare la testa nel ghiacciata (3-4 ° C), saccarosio ossigenato aCSF per circa 30 sec.
3. Utilizzare forbici fini (No.5 in materiali specifici e Equipment) per rimuovere la pelle sulla parte superiore del cranio e di tagliare il cranio lungo la linea centrale della testa, nonché a due estremità vicino il tempolobo ral. Utilizzare pinze (# 6 in materiali specifici e attrezzature) per sbucciare cranio tagliata verso ogni lato della testa, al fine di esporre il cervello.
4. Inserire un laboratorio spatola micro (No. 8 in materiali specifici e attrezzature) nella fessura tra i lobi parietali del cervello e del cranio a sbucciare con attenzione il cervello dal fondo del cranio e poi rilasciarlo su un preparato ghiacciata (3 -4 ° C) fase chirurgica ricoperta con carta da filtro bagnata (n.2 in materiali specifici e attrezzature). Rimuovere il cervelletto con una lama di ghiaccio-refrigerati e separare i due emisferi tagliando la linea mediana del cervello. Poi, posizionare i due emisferi separati in un bicchiere pieno di saccarosio aCSF ghiacciato bollito con il 95% O _2/5% di CO _2.
5. Prendere una metà dell'emisfero e posto sulla scena carta da filtro ghiacciata. Posizionare asciugamani di carta regolari o carta da filtro in tutto il cervello a succhiare la soluzione supplementare. Utilizzare due strumenti pipetta di vetro al fuoco lucido (# 10 in Materiali eEquipment) per separare la corteccia dal resto della parte centrale del cervello.
6. Dopo l'ippocampo è esposta all'interno della corteccia e messo in fase gelata, collocare due o tre gocce di ghiacciata saccarosio aCSF sul tessuto e poi rimuovere la soluzione supplementare intorno nell'ippocampo. Tagliare le connessioni con la corteccia a due estremità dell'ippocampo. Poi, sezionare l'ippocampo fuori del cervello con gli strumenti di vetro fuoco lucidato e rimuovere la parte restante del cervello.
7. Separare l'intero ippocampo con il lato rivolto verso l'alto e alveus ippocampale solco rivolto verso il basso. Rilasciare rapidamente due o tre gocce di ghiacciata saccarosio aCSF sul tessuto di nuovo e rimuovere la soluzione extra intorno il tessuto utilizzando un foglio di carta assorbente. Utilizzare uno strumento di vetro fuoco lucido per girare su tutto ippocampo per esporre il solco (Figura 1B, C).
8. Sotto un microscopio ottico normale, inserire un ago di vetro su misura (No. 11 in specifico Materials e Impianti) in un'estremità del solco e tagliare le connessioni di fibre, di giro dentato (DG) per subiculum o il campo CA1, lungo la direzione del solco (Figura 1C). Applicare una lama ghiacciata per tagliare i setto e temporali estremità dell'ippocampo se necessario. Inserire un anello di filo metallico su misura (n ° 12 in materiali specifici e attrezzature) nel solco di taglio e tirare su il DG di distanza dal tessuto tenendo la fine subiculum / CA1 dell'ippocampo da uno strumento di fuoco in vetro lucido (Figura 1D) .
9. Seguendo la procedura sopra dispiegamento, aggiungere altri due o tre gocce di saccarosio aCSF ghiacciata sul tessuto e rimuovere la soluzione supplementare intorno al tessuto. Quindi, tagliare l'ippocampo spiegato con la lama ghiacciata ai bordi (Figura 1E) e posizionare la preparazione da una spatola nella camera di recupero riempita con aCSF normale e gorgogliare con 95% O _2/5% di CO ₂ a RT (circa 25 ° C). Lasciareil tessuto ippocampo spiegato di recuperare circa 1 ora prima di metterlo nella camera di registrazione.
10. Prendere l'altro emisfero del cervello e usarlo per passare attraverso passaggi 2,5-2,9. Di solito, prendere circa 1 a 2 minuti per completare l'intera procedura di dispiegare un solo ippocampo e drop ghiacciata saccarosio aCSF continuamente per mantenere il tessuto ossigenato e idratata.

Setup 3. sistema sperimentale

1. Colla un PMEA fabbricato personalizzato su un Pin Grid Array (PGA) pacchetto e utilizzare micro bonding cavo per collegare ogni pad da un singolo microelettrodo al pad di un perno sulla confezione (Figura 3B). Quindi, inserire il pacchetto nella presa su un circuito su misura ^13.
2. Collegare individualmente ogni microelettrodi per i suoi filtri con banda passante frequenza di taglio da 1 Hz a 4 KHz e amplificatori con guadagno del 100 sul circuito misura ^13. Digitalizzare l'uscita analogica del circuito da un A / D convSistema erting, e acquisire e memorizzare i dati su un computer.
3. Colla un camera di registrazione di plastica su misura intorno l'array con aspirazione e tubo di uscita per il flusso della soluzione (Figura 4A). Utilizzare almeno due bottiglie di mantenere diverse soluzioni nel sistema, e unire e controllare il tubo di uscita delle bottiglie da un tri-valvola. Collegare l'uscita del tri-valvola per un sistema di tubi con una camera di gocciolamento IV, che guida la soluzione nella camera di registrazione.
4. Tra il tri-valvola e l'ingresso della camera di registrazione, aggiungere un riscaldatore elettrico per riscaldare la soluzione a temperatura controllata (35 ° C) prima che la soluzione è guidato alla camera di registrazione. Attaccare l'uscita della camera di registrazione di un tubo a vuoto per raccogliere la soluzione in un pallone collegato valvolare. Non riciclare alcuna soluzione in ogni esperimento in questo studio.

4. Posizionamento del Hippocampus piegato sul PMEA per registrare l'attività neurale

5. RimozioneTessuto dalla PMEA Dopo un esperimento

1. Controllare l'ancoraggio del tessuto da un micromanipolatore e gradualmente sollevare il tessuto dalla camera di registrazione. Spegnere sia ingresso e uscita per arrestare il flusso nella camera di registrazione. La camera di registrazione dovrebbe essere pieno di soluzione o aggiungere qualche goccia di soluzione per riempire la camera se la camera di registrazione non è pieno.
2. Utilizzare un piccolo pennello per sollevare ogni angolo del tessuto. Se il tessuto non è fluttuante nella soluzione, poi impiegare il tubo vuoto per asciugare la camera accuratamente con il tessuto ancora seduto sulla matrice. Quindi aprire accuratamente l'ingresso per riempire progressivamente la camera e chiudere l'ingresso per arrestare il flusso quando la camera di registrazione è pieno. Applicare il piccolo pennello per sollevare di nuovo ogni angolo del tessuto.
3. Ripetere passaggio 5.2 finché il tessuto viene staccato dalla matrice e galleggianti nella soluzione. Se il tessuto è fluttuante nella soluzione, quindi utilizzare il tubo a vuoto per aspirare il tessuto di distanza. Aprire tegli flusso in ingresso e aprire il vuoto nella presa. Lavare il sistema con acqua distillata e asciugarlo.

I dati riportati nelle figure qui sono stati registrati nella preparazione nell'ippocampo spiegato con 4-AP (100 mM) aCSF aggiunto durante l'incubazione del tessuto nella camera di registrazione a RT (25 ° C). Normalmente l'attività inizia entro 5 minuti, ma in alcuni tessuti ippocampali dagli animali più anziani potrebbe richiedere più tempo. La cottura neuronale 4 AP-indotta osservato con il PMEA è lo stesso come precedentemente riportato 14,15. Poiché gli elettrodi hanno un'altezza di 200 micron, le punte degli elettrodi si trovano appena sotto lo strato di cellule (Figura 3C), perché lo strato di cellule è di solito 250 a 300 micron sopra la alveus dell'ippocampo (figura 2), registrazioni (57 su 64 nell'esperimento di esempio) da diversi canali hanno una deflessione per lo più positive. Tuttavia, alcune di queste registrazioni positivi potrebbe visualizzare piccole deviazioni negative pure (Figura 5B) se le punte degli elettrodi di registrazione sono abbastanza vicino allo strato di cellule.Se le punte degli elettrodi si trovano proprio a livello di strato di cellule, la registrazione avrà molto forte chiodare negativa con spostamento positivo su di esso o solo incurvamento negativo (Figura 5C) 16. Nel campione di dati mostrato qui, 5 canali su 57 registrazioni hanno chiodare negativo. Dopo aver acquisito i dati di tutti i canali 64, il metodo di normalizzazione singoli (Figura 6B) è applicato per mappare la propagazione neurale su un piano 2-D lungo l'asse del tempo della registrazione 7. Con una combinazione di PMEA e l'ippocampo spiegato, la propagazione neurale è mappato e osservato per avviare lo più in un lato della CA3 e spostare longitudinalmente in un fronte d'onda diagonale, attraversando l'intera area dell'ippocampo (Figura 6).

Figura 1. Procedura chirurgica per un ippocampo spiegato . (A) Uno dei due ippocampi è sezionato dal lobo temporale di un cervello di topo. (B) del setto e terminazioni temporali lungo l'asse longitudinale. (C) L'ippocampo è capovolto con una pipetta di fuoco in vetro lucido per esporre il solco. Entrambe le estremità dell'ippocampo sono tagliate e un ago di vetro viene utilizzato per tagliare i collegamenti tra la DG e CA1 o subiculum lungo l'asse longitudinale. (D) L'ippocampo è spiegato da un anello di filo metallico su misura. (E) ippocampo Unfolded con subiculum e DG tagliati. (F) La preparazione finale dei tessuti di un ippocampo spiegato. Questa posizione mostra l'orientamento dell'ippocampo quando è posto sulla matrice in un esperimento. Per ulteriori dettagli sulla ippocampo anatomia spiegato fare riferimento ai metodi sperimentali in manoscritti già pubblicati 7.g1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Istologia sezione dell'ippocampo unfolded. Macchia Crystal-viola mostra la posizione dello strato di cellule piramidali CA1-CA3 all'interno dell'ippocampo unfolded un livello di 250 a 300 micron sopra la alveus localizzazione così i microelettrodi proprio sotto lo strato di cellule (vedere Figura 3C). Per ottenere le sezioni colorate con la viola di cristallo, il tessuto è stato post-fisso dopo l'ippocampo era spiegato. L'ippocampo unfolded stata posta in PFA 4% O / N. Quindi, il tessuto è stato trasferito e mantenute in soluzione di saccarosio (30%) per 48 ore, e seguita da snap-congelamento in un motociclista contenente isopentano (2-metilbutano) raffreddare a -35 ° C in ghiaccio secco. Sezioni congelate sono stati poi tagliati in un criostato con20 micron di spessore sezioni nel piano trasversale (come mostrato nella figura 2) per rivelare la posizione dello strato di cellule piramidali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. ippocampo spiegato sul PMEA. (A) vista dall'alto di una nuova PMEA con i microelettrodi situato alla fine di ogni traccia metallo in oro. L'inserto sul lato destro mostra una singola microelettrodo al microscopio elettronico con un'altezza di 200 micron e un diametro di 20 micron 7,13. (B) La matrice microelettrodo è incollato su un pacchetto PGA con una camera di registrazione di plastica intorno ai microelettrodi su un substrato di vetro. L'inserto a destra mostra un ippocampo spiegato posto sul arr microelettrodoay nel mezzo. (C) A sinistra, Optical Coherence Tomography (OCT) di imaging mostra il tessuto spiegato posizionato sulla parte superiore della matrice in un esperimento diverso. A destra, due immagini fetta longitudinali ottenuti dalla formazione immagine Ottobre a sinistra mostra le punte di microelettrodi (puntini bianchi sottolineato dalle frecce) situata nell'area proprio sotto lo strato corpo cellulare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura .

Figura 4. installazione sperimentale. (A) Un coperchio copertura in plastica con viti è collocato sopra i circuiti per la protezione contro possibili danni dell'acqua. La camera di registrazione ha entrambi i tubi di ingresso e uscita per portare il flusso della soluzione. Un ancoraggio tessuto misura incollato con una rete in fibra di nylon viene utilizzato per fissare il tissue durante gli esperimenti. (B) Immagine presa dal fondo del substrato di vetro del PMEA mostrando l'ancoraggio del tessuto con una fetta campione durante un esperimento. I fili curvi sono le fibre di nylon della maglia premendo sulla parte superiore del tessuto. I punti rotondi sono le basi di microelettrodi. Le frecce indicano elettrodi che sono stati danneggiati dopo diversi esperimenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. I dati grezzi registrati dal PMEA da un ippocampo spiegato. A sinistra: 4-AP-indotta attività epilettiforme registrato da un unico pannello di destra microelettrodo:. Versione ingrandita del segnale contrassegnata nella finestra di tempo a sinistra. (A) 10 sec sezione di un esempio di attività spontanea inprodotta da 100 mM 4-AP aCSF ottenuto per uno dei microelettrodi situate nella regione dendritico basale basato sulla polarità dei segnali con un SNR di 34,9 dB. (B) I dati grezzi da un'altra microelettrodo situato vicino al somata con un SNR del 27,2 dB. (C) Esempio di registrazione ottenuto da un elettrodo posizionato all'interno dello strato somatica. In questo esempio, il SNR è 18.53 dB. (D) Registrazione ottenuto da un elettrodo piegata ancora conducendo ma non penetra nel tessuto. L'elettrodo piegata ha una significativa SNR inferiore rispetto a tali elettrodi intatte (1,5 dB in questo esempio). (E) rumore Baseline registrato da un microelettrodo. La linea di base di solito ha un picco di valore di picco 150-200 mV e l'impedenza di un singolo elettrodo è di circa 1 a 2 MW. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. La conversione dei dati di registrazione neurali nella propagazione mappe 2-D. (A) Una finestra msec 170 tronca un singolo chiodare neurale in ogni canale tracciata sulla foto del PMEA. I dati grezzi viene filtrato da un filtro passa basso a 100 Hz. I segnali provenienti dai elettrodi rotti sono interpolati con le registrazioni intorno. In questo esempio, tutte le punte sono positivi. (B) Un picco di singolo neurale dal pixel rosso (A) è normalizzata alla barra dei colori con un metodo personalizzato sviluppato per la normalizzazione individuale (Si prega di fare riferimento alla pubblicazione precedente per maggiori dettagli sulla normalizzazione 7). (C) Le mappe di colore creati dalla normalizzazione singoli mostrano che la propagazione si muove attraverso l'intera area dell'ippocampo spiegato in diversi punti temporali.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.