Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

Microrganismi attribuiscono alle superfici e formare biofilm - aggregati di cellule racchiuse in una matrice extracellulare-polimero ^1. I biofilm si comportano in modo molto diverso dalle cellule microbiche individuali, perché biofilm hanno drammatico eterogeneità spaziale risultante da una combinazione di limitazioni del trasporto dei soluti interni e variazioni spaziali nel metabolismo cellulare ^2,3. Le concentrazioni di ossigeno e nutrienti drasticamente diminuire all'interfaccia tra biofilm e dintorni fluido e ottenere ulteriori impoverito all'interno del biofilm ^2. Variazioni spaziali in biofilm la respirazione e la sintesi proteica può verificarsi anche come una risposta all'ossigeno localizzato e la disponibilità di nutrienti ^2.

In ambienti acquatici e del terreno, la maggior parte dei batteri abitano in biofilm. Biofilm naturali svolgono importanti processi biogeochimici compresa ciclo del carbonio e azoto e ridurre i metalli ^4,5. Clinicamente, la formazione di biofilm è responsbile per polmonare prolungato e infezioni urinarie ^6. Infezioni biofilm associate sono molto problematico perché le cellule in biofilm sono estremamente elevata resistenza agli antimicrobici rispetto ai loro omologhi planctonici ^6. Perché biofilm sono importanti in contesti diversi, una notevole quantità di ricerca si è focalizzata sulla comprensione dei fattori ambientali che controllano le attività biofilm e l'eterogeneità spaziale biofilm e microambiente circostante.

Studi precedenti hanno dimostrato che lo sviluppo del biofilm è fortemente regolato da una serie di fattori ambientali: biofilm sviluppano differenti morfologie sotto varie condizioni di flusso; ossigeno e nutrienti disponibilità influenza biofilm morfologia; e sforzo di taglio idrodinamico colpisce l'attaccamento di cellule planctoniche alle superfici e il distacco delle cellule dal biofilm ^7-9. Inoltre, condizione di flusso esterno influenza la consegna dei substrati into ed entro ¹⁰ biofilm. La crescita di biofilm altera anche circostante condizioni fisiche e chimiche. Ad esempio, la crescita di biofilm porta alla deplezione locale di ossigeno e nutrienti ^2; biofilm accumulano composti inorganici e organici dall'ambiente circostante ^11; e cluster biofilm deviano il flusso e l'aumento della superficie di attrito ^12,13. Perché biofilm interagiscono con il loro ambiente circostante in modi molto complessi, è fondamentale per ottenere contemporaneamente informazioni sulle proprietà biofilm e delle condizioni ambientali, e gli approcci multi-disciplinari devono essere utilizzati per caratterizzare completo interazioni biofilm-ambiente.

Qui vi presentiamo una serie di metodologie integrate per caratterizzare i modelli spaziali in crescita microbica all'interno mono-specie e biofilm dual-specie sotto una pendenza nutrizionale imposto, e di osservare la modifica conseguente della sostanza chimica locale e microambiente fluido. Noi FIRv descrivono l'uso di una cella di flusso microfluidica doppia aspirazione recentemente sviluppato per osservare la crescita di biofilm sotto gradienti chimici ben definiti. Abbiamo poi dimostrare l'uso di questa cella di flusso microfluidica per osservare la crescita di due specie di batteri, Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli, in biofilm sotto una varietà di condizioni nutrizionali. Mostriamo come in visualizzazione situ fluorescente di propagazione tracciante in colonie biofilm può essere utilizzato per valutare quantitativamente i modelli di trasporto dei soluti in biofilm. Infine, si mostra come microscala velocimetria tracciamento di particelle, eseguita al microscopio confocale, può essere utilizzato per ottenere campo di moto locale intorno alle biofilm crescita.

Setup Cella 1. Flusso e inoculazione

NOTA:. Utilizzare una cella di flusso microfluidica doppio ingresso descritto nel Canto et al, 2014 ¹⁴ a crescere biofilm. Questa cella di flusso è in grado di creare gradienti chimici lisce ben definiti. Il disegno cella di flusso è mostrata in Figura 1 e flusso fabbricazione cella precedentemente descritto canzone et al. 2014 ^14. Qui dettaglio i nostri metodi utilizzando P. aeruginosa e E. coli per formare biofilm, ma altre specie può essere adatto anche. Abbiamo usato P. aeruginosa PAO1- GFP, che esprime costitutivamente una proteina verde fluorescente (GFP), come organismo modello per lo sviluppo di biofilm. Inoltre, abbiamo utilizzato E. coli DH5α per formare biofilm mixed-specie con P. aeruginosa. P. aeruginosa e E. ceppi coli sono state coltivate su piastre di agar LB.

1. Preparare la cella di flusso utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) legato ad unacoprioggetto di vetro con trattamento al plasma di ossigeno, come descritto in ^14. Le dimensioni della camera di cella di flusso sono di 23 mm x 13 millimetri × 0,24 millimetri (lunghezza x larghezza × profondità).
2. Preparare modificato FAB mezzo di crescita ^15. Per osservare la crescita di biofilm sotto un gradiente nutrizionale all'interno della cella di flusso, introducono modifiche FAB media ¹⁵ con 0,6 micron di glucosio in un ingresso e di introdurre FAB media senza alcuna fonte di carbonio attraverso l'altro ingresso. Filtro-sterilizzare (dimensione dei pori = 0,2 micron) la soluzione di glucosio magazzino (60 mm) prima di aggiungerlo al mezzo FAB. Autoclave Anche il mezzo FAB con ciclo 1 (liquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) prima dell'uso.
3. Sterilizzare il sistema di flusso. Prima dell'inoculo, autoclave l'intero percorso di flusso (bottiglie medie, tubi, trappole bolla, celle di flusso) utilizzando ciclo 1, eccetto per le valvole a tre vie (plastica monouso e pre-sterilizzati) a monte della cella di flusso. (Valvole a tre vie sono utilizzati per l'iniezione delle cellule culture, tracciante fluorescente e microsfere.) Per evitare la contaminazione in fase di montaggio, coprire tutte le aperture e tubi di collegamento con un foglio di alluminio o sacchetti di autoclave prima autoclave.
4. Collegare il sistema di flusso. Assemblare i componenti del sistema di cella di flusso accuratamente (vedi video per il montaggio del sistema di flusso) e fornire terreno di coltura alla cella di flusso tramite una pompa peristaltica che controlla con precisione la portata.
5. Preparare coltura cellulare per l'inoculazione trasferendo una colonia di P. aeruginosa o E. coli dalle piastre LB a 3 ml di brodo LB e scuotere la cultura O / N a 225 giri al minuto e 37 ° C. Diluire gli O / colture cellulari N in 1 ml di acqua sterile ad una OD finale ₆₀₀ = 0,01 come inoculo. (Cultura e diluire i batteri in una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione.)
6. Per gli esperimenti con biofilm mista specie, diluire le due colture batteriche ad un rapporto di 1: 1 in 1 ml con un equivalente OD ₆₀₀ = 0,01 per ogni batterio.
7. Seminare la cella di flusso. Iniettare 1 ml di inoculo all'ingresso cella di flusso dalla valvola a tre vie. Dopo l'iniezione, mettere in pausa il flusso per 1 ora per consentire cellule batteriche di allegare al vetro di copertura. (Assicurarsi che la cella di flusso è posizionato con il lato coprioggetto basso per consentire alle cellule in sospensione di depositarsi sul vetrino.)
8. Dopo 1 ora, riprendere il flusso e pompare il mezzo di crescita alla cella di flusso ad una velocità costante di 0,03 ml / min per ciascun ingresso per 3 giorni.

2. Characterizing biofilm sviluppo in risposta a nutrienti sfumature Utilizzo Microscopia confocale

NOTA: P. aeruginosa può essere ripreso con costitutivamente-espressa GFP, ma E. coli in biofilm misti specie deve essere ripreso dalla controcolorazione.

1. Osservare le biofilm 3 giorni usando la microscopia confocale. Per i risultati rappresentativi, osservare biofilm utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 63X. Prima di imaging, markla cella doppio ingresso a flusso con una griglia sul lato vetro di copertura. (Lo scopo di questa griglia è di consentire lo sperimentatore per individuare le regioni di imaging nella camera cella di flusso.)
2. Per colorazione di contrasto, diluire 10 ml di rosso fluorescente macchia cellule permeante acidi nucleici, come l'acido macchia verde fluorescente nucleico come STYO 62, soluzione madre (1 mm) in 990 ml di acqua sterilizzata e poi lentamente iniettare la macchia diluito con una siringa in la camera di cella di flusso dalla valvola a tre vie monte. Mantenere la cella di flusso stagnante e al buio per 30 minuti, quindi riprendere il flusso di lavare la macchia non legato per 15 min.
3. Eseguire confocale. Attivare la 488 nm Argon laser per l'eccitazione e l'emissione di raccolta canali per GFP (500-535 nm) e macchia acidi nucleici (per lampade fluorescenti colorazione verde acido nucleico, 650-750 nm). Regolare guadagni e offset per entrambi i canali per avere immagini brillanti e pulite. Selezionare xyz e modalità di imaging simultaneo. Utilizzare la manopola di z-controllo per idenduare parte inferiore e superiore del biofilm nel campo. Impostare la z-passo a 0,5 micron per l'acquisizione di una serie di immagini 3-D. (Per garantire immagini di alta qualità, utilizzare una media linea di quattro per l'acquisizione di immagini.)
4. Per mappare i modelli spaziali di sviluppo biofilm all'interno della cella di flusso, biofilm immagine a tre o più longitudinale (x) distanze lungo l'ingresso della cella di flusso, e alle tre trasversale (y) posizioni relative al gradiente nutrizionale imposto, come mostrato in Figura 1 .

3. Characterizing Soluto interno Trasporto Iniezioni di conservatore fluorescente Tracer

NOTA: Un tracciante fluorescente conservatore, come Cy5, può essere utilizzato per caratterizzare modelli di trasporto dei soluti all'interno del biofilm.

1. Sciogliere Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) in acqua ad una concentrazione finale di 10 mg / ml come soluzione madre. Conservare la soluzione di riserva Cy5 in un -20 ° C freezer.
   NOTA: Come Cy5 è chiaro Sensitive, magazzini, diluite e iniettare soluzioni Cy5 nel buio.
2. Prima delle iniezioni del tracciante fluorescente, prendere una serie di immagini 3-D del biofilm di 3 giorni con la microscopia confocale (con un obiettivo 63X). (Regioni larghe delle colonie biofilm sono ideali per serie temporali osservazioni di trasporto colorante.) Anche scegliere un piano z con colonie ben separati per l'imaging (come mostrato in Figura 5A).
3. Per ogni esperimento iniezione Cy5, diluire 2 ml di soluzione madre Cy5 in 998 microlitri di acqua sterilizzata per fornire una soluzione di iniezione avente una concentrazione Cy5 di 20 ug / ml.
4. Arrestare la pompa per interrompere il flusso e iniettare la soluzione Cy5 nel monte della cella di flusso utilizzando una siringa attraverso la valvola a 3 vie. (E 'importante per evitare bolle d'aria di entrare nel percorso di flusso durante l'iniezione. Bubble trappole devono essere tenuti aperti durante l'iniezione posteriore.)
5. Dopo aver iniettato il soluzione Cy5, chiudere le trappole bolla, regolare la valvola a 3 vie, e riavviare ilpompa per fornire la soluzione Cy5 iniettato nella cella di flusso.
6. Passa alla modalità di imaging confocale a XYT. Attivare Cy5 e GFP canali sotto la modalità di imaging simultaneo. Regolare le impostazioni confocale su intensità Cy5 (intensità del laser, di guadagno e offset) per evitare segnali, che è fondamentale per la quantificazione saturazione. (Alta risoluzione temporale è preferito per la visualizzazione penetrazione del colorante. Tuttavia, la scansione veloce diminuisce la qualità dell'immagine.) Scegliere la corretta velocità di scansione e media linea per bilanciare la risoluzione temporale dell'imaging e la qualità dell'immagine. Per questo protocollo utilizzare una media linea di quattro e un frame rate di 0,15 Hz.
7. Riprendere il flusso di consegnare Cy5 nella cella di flusso (ancora ad una portata di 0,03 ml / min). Contemporaneamente avviare serie temporali confocale.
8. Quantificare penetrazione Cy5 da radialmente media intensità Cy5 all'interno di un 2-D biofilm colonia circolare. Per media, prima identificare il bordo di un cluster biofilm, quindi generare una mappa di distanza per una sezione 2-D del cluster, E infine modelli medi radiali di intensità Cy5 per generare una curva di penetrazione (vedere Figura 6).
   1. Per computazionalmente realizzare passo 3.8, utilizzare BioSPA (biofilm Spatial Pattern Analysis) pacchetto software (inedito, software e manuale disponibile su richiesta) o di altri programmi di analisi delle immagini.
   2. Per utilizzare BioSPA, prima importare un'immagine impostata in BioSPA. Quindi selezionare soglia adeguata per i canali GFP e Cy5 per rendere le immagini binarie. Nel menu di analisi / calcolo, selezionare Advanced Analysis e quindi Analysis diffusione. Utilizzare il canale GFP per definire il bordo di un cluster e utilizzare lo strumento poligono per selezionare un cluster come la regione di interesse (ROI).
   3. Fare doppio clic sul gruppo biofilm selezionato per eseguire l'analisi di diffusione. Salvare i risultati delle analisi di diffusione e calibrare l'intensità Cy5 alla concentrazione Cy5 utilizzando una curva di calibrazione.
      1. Per generare Cy5 curva di calibrazione concentrazione, misurare intensità Cy5 su una conce Cy5gradiente ntration al microscopio confocale. (Intensità Cy5 e concentrazione hanno una relazione lineare.)

4. Caratterizzare il campo di moto circostante tracciando particelle fluorescenti

NOTA: particelle fluorescenti, quali microsfere fluorescenti, può essere usato per caratterizzare il campo di flusso intorno biofilm. Campo di moto intorno biofilm può essere calcolata dalle osservazioni di serie temporali di posizioni delle particelle che utilizzano software di monitoraggio di particelle velocimetria. I risultati qui riportati sono stati ottenuti con il software Streams 2.02 pacchetto ¹⁶ (download del software e la guida a disposizione dell'utente in http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

1. Diluire le microsfere fluorescenti (diametro ~ 1 micron) in acqua sterile ad una concentrazione solida finale di 0,2% e un volume finale di 0,5 ml. Vortex per assicurarsi che le microsferesono ben dispersi.
2. Iniettare e fornire i microsfere fluorescenti diluito nella cella di flusso in base a procedure da passaggi 3,3-3,5. Per consentire un monitoraggio accurato del percorso particella, utilizzare un tasso relativamente basso flusso (0,01 ml / h per i risultati di monitoraggio di particelle in questo documento).
3. Passare impostazioni confocale modalità di XYT per tracciare il movimento delle particelle in un z-slice e prendere le immagini serie temporali. (Una frequenza di 1 Hz è stato utilizzato per i risultati rappresentativi riportati in questo articolo.) Iniezione di ripetizione di particelle e di immagini in diverse posizioni z di generare flusso di campo 3-D.
4. Pre-processo time-series immagini confocale sottraendo il segnale di fluorescenza di fondo (il segnale nella prima immagine acquisita del set di immagini) utilizzando ImageJ (download del software e manuale disponibile su http://imagej.nih.gov/ij/ ) o altri programmi.
5. In ImageJ, aprire la prima immagine di un set di immagini e quindi importare il set di immagini. Sotto processo / Immagine Calculator, sottrarre la prima immagine dal set di immagini. Salvare il set di immagini pre-trattati.
6. Per calcolare i vettori di flusso, import time-series immagini confocale in Streams 2.02. In "vista del processo Apri", selezionare ed eseguire "Identificare le particelle". Utilizzare soglia adeguata di identificare particelle. Utilizzare 0,5 e 5 micron come soglie di diametro minimo e massimo per 1 micron particelle.
7. Poi sotto "view processo Open", selezionare ed eseguire "PTV analisi condotta" per generare percorsi di particelle. Controllare i percorsi di particelle per vedere se essi rappresentano il movimento delle particelle. Infine, selezionare ed eseguire "Crea campo di velocità" per generare una mappa di flusso vettoriale.

La cella doppia presa flusso microfluidica consente l'osservazione della crescita biofilm sotto un gradiente chimica ben definita formata miscelando due soluzioni all'interno della camera di flusso. Il gradiente chimica risultante è stato precedentemente osservato per iniezione colorante e caratterizzato in dettaglio da Song et al. 14. Gradienti di concentrazione lisce sono formate in direzione trasversale, come illustrato in Figura 1. Il profilo di concentrazione era ripida vicino all'ingresso e preso rilassato valle a causa della diffusione (Figura 1). Per osservare sviluppo biofilm sotto un gradiente nutrizionale, abbiamo usato un mezzo definito minima crescita (FAB medium) con glucosio aggiunto solo un ingresso come unica fonte di carbonio. Questo ha prodotto un gradiente di glucosio nella camera di cella di flusso, mentre tutti gli altri nutrienti sono stati omogeneamente distribuiti. La crescita di P. biofilm aeruginosa PAO1 era fortemente correlata alla consegna locale di glucosio (Figura 2).Come trasversale gradiente di concentrazione di glucosio era ripida, vicino all'ingresso, la biomassa biofilm mostrato una drammatica diminuzione da regione high-glucosio per la regione a basso glucosio. Poiché il gradiente di glucosio trasversale rilassato valle, la biomassa biofilm divenne più omogenea. Abbiamo dimostrato ulteriormente l'uso di questa cella di flusso per studiare le interazioni di P. aeruginosa e E. coli in biofilm sotto un gradiente di glucosio (Figura 3). I risultati hanno mostrato che queste due specie mostravano schemi spaziali distinti in crescita relativa al gradiente nutrizionale, e quindi occupato nicchie ecologiche distinte: P. aeruginosa dominato biofilm biomassa in zone con alte concentrazioni di glucosio e E. coli dominato in regioni con basse concentrazioni di glucosio (Figura 3).

Per capire il feedback tra crescita biofilm e l'ambiente circostante flusso, abbiamo caratterizzato il campo di moto bio intorno crescentefilm di fluorescente velocimetria tracciamento di particelle al microscopio confocale. Il movimento osservato delle microsfere fluorescenti iniettati è mostrato in Movie 1. Local informazioni flusso vettoriale è stato estratto da una media di almeno 4.200 misurazioni discrete di velocità delle particelle utilizzando il pacchetto software Streams. Mappatura tridimensionale del campo di moto è ottenuta tracciando particelle in posizioni verticali multipli (Figura 4). Crescita biofilm significativo aumento del flusso di eterogeneità (Figura 4). Flusso vicino alla base di biofilm deviata intorno cluster biofilm, con conseguente aumento della eterogeneità e diminuzione della velocità (Figura 4). Flusso in alto biofilm ha velocità maggiore ed è più omogenea (Figura 4).

Per comprendere l'eterogeneità interna causata dal trasporto dei soluti limitata nel biofilm, abbiamo osservato il trasporto di Cy5 all'interno biofilm mediante microscopia confocale. Penetrazione Time-seriesdi Cy5 in un cluster biofilm è mostrato in Movie 2. Le serie temporali Cy5 curve di penetrazione è mostrato in Movie 3. Il coefficiente di diffusione effettiva delle Cy5 in biofilm è stato calcolato adattando un modello di diffusione 1-D per i profili di concentrazione Cy5:

dove C è la concentrazione Cy5 radialmente media calcolata l'intensità di fluorescenza, ed è la distanza nel biofilm 17. Cy5 ha mostrato la più alta concentrazione nel flusso di massa e diminuita ripidamente entrando biofilm (Figura 5).

Figura 1. cella di flusso microfluidica doppio ingresso. Gradienti glucosio lisce sono state create all'interno della camera di flusso introducendo medio FAB ai due ingressi con una fonte di carbonio (gluco se) disponibile in una sola aspirazione. risultante pattern di glucosio all'interno della cella di flusso sono indicate con ombreggiatura. Ombreggiatura scura rappresenta la concentrazione di glucosio superiori. Confocale è stato effettuato a nove punti della cella di flusso. I risultati presentati nelle figure 2 e 3 si riferiscono alle posizioni numerate 1-9 in figura. Questa cifra è modificato dopo canzone et al. (2014), Fig. 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. PAO1 crescita biofilm sotto gradienti glucosio. 3 giorni biofilm PAO1 stati ripreso a 9 posizioni indicate in figura 1. Spaziatura griglia = 18 micron per un'immagine 1-8 e 24 micron per un'immagine 9.g "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Lo sviluppo di P. aeruginosa e E. coli biofilm dual-specie sotto gradienti di glucosio. P. aeruginosa esprime costitutivamente GFP, e biofilm sono stati anche contrastate da SYTO 62, che è una macchia generale di acido nucleico. Le immagini qui sono sovrapposizioni di GFP (green) e SYTO 62 (rosso) canali. P. aeruginosa appare dunque verde o giallo (verde + rosso), e E. coli appare rossa. Bar scale = 47 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Campi Figura 4. Flusso vettore velocità a z = 4, 10 e 16 micron circa un cluster biofilm. La lunghezza della freccia rappresenta la grandezza della velocità. Bassa velocità di flusso mostra alla base biofilm (z = 4, frecce blu). Flow è più omogenea nei pressi top biofilm (z = 16, frecce rosse). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Cy5 penetrazione nel biofilm. (A) confocale microscopio a z = 18 micron che mostra la penetrazione parziale Cy5 in cluster biofilm a t = 190 sec. Bar scale = 10 micron. (B) risultante pattern di Cy5 concentrazione mappa. (C) Cy5 profilo di concentrazione in un cluster biofilm. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Procedure per generare un profilo di penetrazione Cy5 sinistra:. ROI Selezionato contenente un biofilm cluster di 2-D. Middle: Distanza Mappa del cluster biofilm. A destra: radiale-media profilo di intensità Cy5. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

Movie 1 : movimento di particelle fluorescenti iniettate intorno cluster biofilm (video confocale).

Movie 2 : Propagazione della Cy5 in cluster biofilm (video confocale).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.