Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è studiare la tumorigenesi mammaria. Con questa tecnica, i tumori mammari di topo vengono rimossi e le cellule primarie vengono preparate dai tumori. È incluso un protocollo di estrazione polmonare per lo studio delle metastasi polmonari. Inoltre, è incluso un altro protocollo per l'analisi dei fibroblasti embrionali di topo dall'embrione di topo.

Abstract

Nella tumorigenesi mammaria, lo stadio metastatico della malattia rappresenta la più grande minaccia per l'individuo affetto. Le cellule mammarie normali con genotipi alterati ora possiedono la capacità di invadere e sopravvivere in altri tessuti. In questo protocollo, i tumori mammari di topo vengono rimossi e le cellule primarie vengono preparate dai tumori. Le cellule isolate da questa procedura sono quindi disponibili per esperimenti di profilazione genica. Per una metastasi di successo, queste cellule devono essere in grado di intravasare, sopravvivere in circolo, stravasare in organi distanti e sopravvivere in quel nuovo sistema di organi. I polmoni sono il bersaglio tipico delle metastasi del cancro al seno. È stato scoperto un insieme di geni che media la selettività delle metastasi al polmone. Qui descriviamo un metodo per studiare le metastasi polmonari da un modello murino geneticamente modificato. Inoltre, è incluso un altro protocollo per l'analisi dei fibroblasti embrionali di topo (MEF) dall'embrione di topo. Le cellule MEF dello stesso tipo animale forniscono un indizio dell'espressione genica delle cellule non tumorali. Insieme, queste tecniche sono utili nello studio della tumorigenesi mammaria del topo, dei meccanismi di segnalazione associati e delle vie delle anomalie negli embrioni.

Introduzione

La metastasi è il passo finale nella progressione del cancro al seno ¹. Comporta una serie di passaggi in cui le cellule maligne vengono rilasciate dal tumore primario e disseminate ad altri organi ². Le cellule devono essere in grado di intravasare, sopravvivere in circolo, stravasare in organi distanti e sopravvivere in quel nuovo sistema di organi ³. Ogni fase della tumorigenesi è strettamente controllata dalle cellule attraverso vari cambiamenti genetici ed epigenetici ⁴. Per studiare i meccanismi della tumorigenesi del cancro al seno, sono stati utilizzati sistemi modello murini a causa della loro breve durata di vita, delle piccole dimensioni e del rapido tempo di riproduzione. Alcuni dei principali vantaggi dell'utilizzo di modelli murini nella ricerca sul cancro sono le somiglianze molecolari e fisiologiche che condividono con gli esseri umani ⁵.

Le linee cellulari umane e di topo consolidate sono state ampiamente utilizzate nella ricerca sul cancro al seno. Sebbene sia possibile ottenere alcune informazioni sulle fasi delle metastasi utilizzando queste cellule, i modelli animali geneticamente manipolati con oncosoppressori/oncogeni forniranno molte più informazioni sullo sviluppo e sulle metastasi del tumore a partire dallo stadio embrionale. Pertanto, con questi modelli murini, possiamo ottenere la regolazione genetica e dello sviluppo della crescita tumorale. Inoltre, anche il microambiente tumorale svolge un ruolo importante nell'espressione genica delle cellule tumorali e può essere difficile imitare lo stesso scenario con studi che utilizzano linee cellulari consolidate. I tumori mammari umani primari possono anche essere utilizzati per studiare la tumorigenesi mammaria del topo. Il principale svantaggio dell'utilizzo di tumori al seno isolati è che questo tumore appena impiantato non ha la vascolarizzazione e il tessuto linfatico del topo. Mentre i sistemi modello genetici murini per lo studio della tumorigenesi mammaria ci permetteranno di monitorare le fasi delle metastasi, analizzare il microambiente tumorale e l'accesso all'intero corpo ⁵.

L'obiettivo generale di questo protocollo è studiare la tumorigenesi mammaria nei topi. È noto che i tumori al seno in genere metastatizzano al cervello, ai polmoni e alle ossa. Questo protocollo consente l'isolamento delle cellule tumorali mammarie primarie e lo studio delle metastasi del cancro al seno al polmone. Inoltre, è incluso un altro protocollo per l'analisi dei fibroblasti embrionali di topo (MEF) dall'embrione di topo. Insieme, queste tecniche sono utili nello studio della tumorigenesi mammaria del topo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti di topo sono stati fatti secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Usa Comitati (IACUC) di LSU School of Medicine. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati in autoclave prima della dissezione.

1. Preparazione di cellule primarie di tumore al seno del mouse

1. Utilizzare un modello di topo che è stato geneticamente con il Tumor Virus mouse mammaria Polyoma Medio T-Antigen (topo MMTV-PyMT transgenico), che si sviluppano spontaneamente tumori come descritto in precedenza ^6.
2. Sacrificare topi con isoflurano (99,9%) e spruzzare il 75% di etanolo per assicurare un ambiente sterile (Figura 1A).
3. Aprire la pelle dalla superficie dell'orifizio uretrale al collo con le forbici. Pin la pelle verso il basso per consentire un facile accesso agli organi (Figura 1B).
4. Isolare il tumore al seno mammaria e lavare con freddo fosfato sterile salina tamponata (PBS) (pH 7,4) (Figura 1C).
5. Trasferire il tumoreuna piastra di coltura tissutale sterili 10 centimetri e tritare con una lama di rasoio sterile e forbici a circa 1 mm ³ pezzi. Fasi successive devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare sterile.
6. Incubare il tessuto tumorale tritato con collagenasi disciolto nel siero mezzi DMEM ad una concentrazione finale di 1 mg / ml su un bilanciere per 2 ore a 37 ° C. Centrifugare la sospensione tessuto tumorale per 3 min a 200 x g.
   NOTA: L'incubazione Collagenase è essenziale per la dissociazione enzimatica del tessuto.
7. Eliminare il supernatante e lavare il precipitato 3 volte con PBS (pH 7,4) per centrifugazione per 3 min a 200 x g. Dopo l'ultimo lavaggio, decantare il surnatante.
8. Risospendere il tessuto con 2 ml di tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C mentre oscillante. Centrifugare la sospensione per 3 min a 200 xg e ripetere i lavaggi.
9. Risospendere il pellet in tessuto normale terreno di coltura (DMEM, 10% FBS, penna 2X / strep) su un piatto 10 cm. Cambiamentoi media ogni giorno per i prossimi 3 giorni. Cellule coltura fino numero di cellulare desiderato si ottiene.
   NOTA: circa 1x10 ⁷ cellule saranno isolati da questa procedura. Altri modelli tumorigenesi del mouse mammari, come MMTV-Neu, danno minore resa delle celle rispetto a MMTV-PyMT. Quando si utilizzano i modelli che producono un rendimento inferiore, è utile cominciare con una più grande cellule tumorali e cultura più lunghi.

2. polmone mouse estrazione di visualizzare Lung Metastasi

1. Prima di procedere all'estrazione del polmone, rimuovere il fegato e il diaframma. Rimuovere le costole senza disturbare i polmoni.
2. Con un bel paio di forbici, aprire la parte superiore della trachea che è più vicino alla vena giugulare.
3. Utilizzando un catetere, iniettare un agente chimico come 1 ml di Z-fix o inchiostro India attraverso la trachea per riempire i polmoni (Figura 2A). Incorpora la Z-fix Polmoni in paraffina.
4. De-macchia polmoni iniettati con inchiostro di china in soluzione di Fekete(100 ml 70% alcool, 10 ml di 10% formalina tamponata, e 5 ml di acido acetico glaciale) per 5 min. Definire noduli tumorali nei siti secondari con un ≥ 0,5 mm di diametro, determinare i noduli come metastasi.
   NOTA: a causa di un blocco bronchi e bronchioli dal tumore, noduli tumorali non possono assorbire il 15% inchiostro di china, e quindi normale tessuto polmonare sarà in nero, e noduli tumorali saranno di colore bianco ^7. Questo permetterà la visualizzazione dei noduli tumorali individuali (Figura 2B).

3. Preparazione embrionali fibroblasti di topo (MEF) da embrioni di topo

1. Sacrificio topi in gravidanza con isoflurano (99,9%) e spruzzare il 75% di etanolo per garantire un ambiente sterile.
2. Aprire la pelle dalla superficie dell'orifizio uretrale al collo con le forbici e isolare gli embrioni dall'utero.
3. Fare attenzione a non disturbare gli embrioni quando si apre la pelle.
4. Rimuovere le corna uterine e sciacquarli sotto ste freddorile PBS (pH 7,4).
5. Separare l'embrione dalla sua placenta con molta attenzione e mettere gli embrioni in un piatto 10 centimetri contenente ghiaccio freddo PBS (pH 7,4).
6. Togliere la testa, fegato e intestino dall'embrione e posizionare la parte restante in una piastra di coltura tissutale 12 pozzetto contenente PBS (pH 7,4).
7. Trasferire il corpo dell'embrione ad un altro 12 pozzetti contenente tripsina EDTA e tagliato in piccoli pezzi (~ 1 mm ³⁾ con una lama di rasoio sterile e forbici. Incubare il materiale tagliato con 5 ml di tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C.
8. Inattivare tripsina aggiungendo 1 ml di siero fetale bovino (FBS) per gli embrioni tritate. Centrifugare la sospensione a 200 velocità xg per 10 minuti, rimuovere con attenzione il surnatante, risospendere il pellet con 1 ml di terreno DMEM caldo e trasferire tutti i contenuti per un piatto di 10 centimetri contenente 10 ml di DMEM (con il 20% FBS e 2X penicillina / streptomicina ).
9. Cambia il mezzo ogni giorno per due giorni. Coltivare le cellule fino cella desideratail numero è raggiunto.

Risultati

Lo stadio progressione tumorale in cui sacrificare l'animale dipende dalla particolare studio e orientamenti IACUC. Nella Figura 1A, un 100 giorni vecchio C57BL / 6 del mouse con il Tumor Virus mouse mammaria Polyoma Medio T-antigene (MMTV-PyMT) è stato sacrificato a tre mesi. La pelle è stata aperta dalla zona dell'orifizio uretrale al collo con le forbici e la pelle era immobilizzato per consentire un facile accesso agli organi come mostrato nella Figura 1B. Questo ha permesso...

Discussione

Questo protocollo è per isolare cellule primarie di un tumore del mouse fresca. I lisati preparati da questo metodo sono utili per le proteine, DNA e RNA analisi. Le cellule tumorali del tumore mammario primario spesso metastatizzano al cervello, polmoni e ossa ^1. Incluso è una tecnica per estrarre il polmone per il rilevamento di metastasi. Colorazione polmone con una macchia di inchiostro permetterà la visualizzazione dei noduli tumorali, come mostrato nella Figura 2B. Fissaggio dei polmoni...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	HyClone	SH30243.01	Negozio a 4 gradi C
0,05% Tripsina-EDTA	Tecnologie per la vita	25300-062	Conservare a – 20 C
Collagenasi Tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138	Negozio a – 20 ° C
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Negozio a – 20 ° C
Pen Strep	Life tecnologie	15140-122	Negozio a 4 gradi C
Siero fetale bovino (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106	Negozio a – 80 ° deg; C
Z-fix	ANATECH	#174	Negozio presso RT
India Ink	Yasutomo		Negozio presso RT
AERRANE (Isoflurano)	Baxter	NDC 10019-773-60	Negozio presso RT
Ethanol	EMD	AX0441-3	Negozio presso RT