L'obiettivo di questo protocollo è studiare la tumorigenesi mammaria. Con questa tecnica, i tumori mammari di topo vengono rimossi e le cellule primarie vengono preparate dai tumori. È incluso un protocollo di estrazione polmonare per lo studio delle metastasi polmonari. Inoltre, è incluso un altro protocollo per l'analisi dei fibroblasti embrionali di topo dall'embrione di topo.
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Articolo metodologico
Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella tumorigenesi mammaria, lo stadio metastatico della malattia rappresenta la più grande minaccia per l'individuo affetto. Le cellule mammarie normali con genotipi alterati ora possiedono la capacità di invadere e sopravvivere in altri tessuti. In questo protocollo, i tumori mammari di topo vengono rimossi e le cellule primarie vengono preparate dai tumori. Le cellule isolate da questa procedura sono quindi disponibili per esperimenti di profilazione genica. Per una metastasi di successo, queste cellule devono essere in grado di intravasare, sopravvivere in circolo, stravasare in organi distanti e sopravvivere in quel nuovo sistema di organi. I polmoni sono il bersaglio tipico delle metastasi del cancro al seno. È stato scoperto un insieme di geni che media la selettività delle metastasi al polmone. Qui descriviamo un metodo per studiare le metastasi polmonari da un modello murino geneticamente modificato. Inoltre, è incluso un altro protocollo per l'analisi dei fibroblasti embrionali di topo (MEF) dall'embrione di topo. Le cellule MEF dello stesso tipo animale forniscono un indizio dell'espressione genica delle cellule non tumorali. Insieme, queste tecniche sono utili nello studio della tumorigenesi mammaria del topo, dei meccanismi di segnalazione associati e delle vie delle anomalie negli embrioni.
Introduzione
La metastasi è il passo finale nella progressione del cancro al seno 1. Comporta una serie di passaggi in cui le cellule maligne vengono rilasciate dal tumore primario e disseminate ad altri organi 2. Le cellule devono essere in grado di intravasare, sopravvivere in circolo, stravasare in organi distanti e sopravvivere in quel nuovo sistema di organi 3. Ogni fase della tumorigenesi è strettamente controllata dalle cellule attraverso vari cambiamenti genetici ed epigenetici 4. Per studiare i meccanismi della tumorigenesi del cancro al seno, sono stati utilizzati sistemi modello murini a causa della loro breve durata di vita, ....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti di topo sono stati fatti secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Usa Comitati (IACUC) di LSU School of Medicine. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati in autoclave prima della dissezione.
1. Preparazione di cellule primarie di tumore al seno del mouse
- Utilizzare un modello di topo che è stato geneticamente con il Tumor Virus mouse mammaria Polyoma Medio T-Antigen (topo MMTV-PyMT transgenico), che si sviluppano spontaneamente tumori come descritto in precedenza 6.
- Sacrificare topi con isoflurano (99,9%) e spruzzare il 75% di etanolo per assicurare un ambiente sterile <....
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Risultati
Lo stadio progressione tumorale in cui sacrificare l'animale dipende dalla particolare studio e orientamenti IACUC. Nella Figura 1A, un 100 giorni vecchio C57BL / 6 del mouse con il Tumor Virus mouse mammaria Polyoma Medio T-antigene (MMTV-PyMT) è stato sacrificato a tre mesi. La pelle è stata aperta dalla zona dell'orifizio uretrale al collo con le forbici e la pelle era immobilizzato per consentire un facile accesso agli organi come mostrato nella Figura 1B. Questo ha permesso.......
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Discussione
Questo protocollo è per isolare cellule primarie di un tumore del mouse fresca. I lisati preparati da questo metodo sono utili per le proteine, DNA e RNA analisi. Le cellule tumorali del tumore mammario primario spesso metastatizzano al cervello, polmoni e ossa 1. Incluso è una tecnica per estrarre il polmone per il rilevamento di metastasi. Colorazione polmone con una macchia di inchiostro permetterà la visualizzazione dei noduli tumorali, come mostrato nella Figura 2B. Fissaggio dei polmoni.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno informativa.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare NIH, LACaTS e la fondazione clinica Ochsner per il sostegno finanziario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Negozio a 4 gradi C |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Tecnologie per la vita | 25300-062 | Conservare a – 20 C |
| Collagenasi Tipo IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Negozio a – 20 ° C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Negozio a – 20 ° C |
| Pen Strep | Life tecnologie | 15140-122 | Negozio a 4 gradi C |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Negozio a – 80 ° deg; C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Negozio presso RT |
| India Ink | Yasutomo | Negozio presso RT | |
| AERRANE (Isoflurano) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Negozio presso RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Negozio presso RT |
Riferimenti
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L.
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Ristampe e permessi
Tag
Isolamento del tumore primariofibroblasti embrionali di topostudio delle metastasi polmonariisolamento di cellule tumoralipreparazione di cellule MEFprocedura di estrazione del polmonemetodi di coltura tissutaledigestione con collagenasitrattamento con tripsina EDTAlavaggio della sospensione cellulare
